一种甾体c1,2位脱氢酶酶活检测方法
阅读说明：本技术 一种甾体c1,2位脱氢酶酶活检测方法 (Method for detecting enzyme activity of steroid C1, 2-dehydrogenase ) 是由 柳志强 倪叶雯 张博 陈鑫鑫 柯霞 郑裕国 于 2020-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法。甾体C1,2位脱氢酶能够代谢还原WST-1,同时在PMS的联合作用下生成还原成水溶性的橙黄色甲臢产物,在440nm下测定吸光度,以WST-1还原量表示脱氢酶活性,根据标准曲线计算橙黄色甲臢的生成量,进而求出甾体C1,2位脱氢酶活性。本发明提供了一种氧化还原酶活力检测方法,特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确,适合高通量的甾体C1,2位脱氢酶活性检测。(The invention relates to a method for detecting enzyme activity of steroid C1, 2-dehydrogenase. The steroid C1, 2-dehydrogenase metabolically reduces WST-1 and produces a formazan product reduced to water-soluble orange in combination with PMS, measures the absorbance at 440nm, expresses dehydrogenase activity as the WST-1 reducing amount, calculates the formazan producing amount from the standard curve, and then determines the steroid C1, 2-dehydrogenase activity. The invention provides a method for detecting the activity of oxidoreductase, which has the advantages of strong specificity, high sensitivity, convenient operation, short detection time and accurate quantification and is suitable for high-flux activity detection of steroid C1, 2-dehydrogenase.)
(一)技术领域
本发明涉及一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法。
(二)背景技术
甾体化合物，是一类特殊的多元环萜类化合物，通常含有一个由A、B、C和D四个环组成的环戊烷多氢菲母核，其中A、B、C环为完整封闭的六元环，D环为五元环；甾体化合物广泛存在于动物、植物组织和某些微生物中。目前，涉及的反应类型主要有羟基化、氧化、水解、侧链降解、C1,2位脱氢、酯化、还原、异构化以及其他基团的导入等。
甾酮C1,2位脱氢酶，既是诱导酶、胞内酶，也是一种膜蛋白，其酶蛋白活性中心锚定在细胞内膜上。该蛋白中有两个疏水性氨基酸区段共同组成了它的跨膜区。具有黄素腺嘌呤二核苷酸结合位点。甾酮C1,2位脱氢酶能催化甾体微生物转化中A环发生的C1,2位脱氢反应。KsdD催化反应机理应遵从两步的单分子共轭碱消除(E1cb)理论：首先，3-酮基甾体底物C3位上的酮基与酶的亲电残基发生强烈的相互作用，造成了C-2(β)氢键的断裂，这个氢原子以质子的形式通过一个广义碱基脱除，形成一个烯醇化物的中间体或者负碳离子的中间体；之后，C1和C2位之间形成一个双键，同时，氢负离子从C1位转移到黄素辅酶。甾体化合物A环C1,2位引入双键后，其抗炎活性能成倍增加。例如，醋酸可的松经C1,2脱氢反应后生成的醋酸波尼松，其抗炎活性增加了3-4倍；目前临床上许多重要甾体化合物的生产过程中均涉及到微生物的甾体C1,2脱氢反应，包括氢化泼尼松、地塞米松、帕拉米松、倍他米松、曲安西龙、甲基强的松龙等大多数具有抗炎能力的肾上腺皮质激素。
对于氧化还原酶活性的检测活性的检测可通过加入人工受氢体,包括TTC(2,3,5一氯化三苯基四氮哩)、刃天青、亚甲基蓝、INT(碘硝基四哩紫)等,由人工受氢体的还原变色速率来确定脱氢过程的强度,其中,应用最为广泛的是TTC。TTC在脱氢酶活性检测方法操作过程需加有机试剂,且溶液显色浅,易退色,反应时间长。WST-1是一种类似于MTT的化合物，是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先，MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan(甲臢)不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；而WST-1和XTT、MTS产生的formazan(甲臢)都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-1产生的formazan(甲臢)比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次，WST-1比XTT和MTS更加稳定，使实验结果更加稳定。另外，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。
目前，甾酮C1,2位脱氢酶活性测试方法中包括主要有PMS-细胞色素C和PMS-NBT两种反应体系。PMS-细胞色素C体系主要为PMS-细胞色素C法和PMS-DCPIP法。PMS-NBT体系主要为PMS-NBT法。随着近些年人工受氢体四唑盐的不断升级，最新已研制到WST系列(如WST-1、WST-8)。并且对于一些常见的脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶)已用最新研制的四唑盐建立了相关酶活检测体系，而甾酮C1,2位脱氢酶活性检测方法还停留在初级阶段的四唑盐。所以，有必要针对不同的四唑盐建立最适于甾酮C1,2位脱氢酶活性检测体系。
(三)
发明内容
本发明目的本发明目的是提供一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一种甾体C1,2位脱氢酶酶活检测方法，所述方法包括：
(1)将适量甾体C1,2位脱氢酶底物与吩嗪硫酸甲酯、WST-1检测试剂混于缓冲液中；
(2)称取WST-1，加入95％酒精助溶，蒸馏水定容配制成0.4％的WST-1溶液，避光保存；吸取0.4％的WST-1溶液于容量瓶，加入Na2S2O4粉末，摇匀后再用乙酸乙酯定容至刻度；分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作为参比，在440nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线；
(3)将含甾体C1,2位脱氢酶的待测溶液加入缓冲溶液，混合均匀，置于甾体C1,2位脱氢酶最适反应温度和最适反应pH值下反应1～4小时，检测440nm的吸光度；
(4)对照甾体C1,2位脱氢酶标准曲线，计算得到待测溶液中甾体C1,2位脱氢酶浓度。
本发明利用WST-1检测试剂的颜色变化实时监测甾体C1,2位脱氢酶活力，提供了一种甾体C1,2位脱氢酶活力的检测方法。选用WST-1检测试剂检测体系，甾体C1,2位脱氢酶酶活检测呈现良好的线性剂量关系；通过反应物在440nm的吸光度值，进行甾体C1,2位脱氢酶的活力评价。
反应原理：WST-1是一种黄颜色的染料。甾体C1,2位脱氢酶能够代谢还原WST-1，同时在PMS的联合作用下生成还原成水溶性的橙黄色甲臢产物，在440nm下测定吸光度，以WST-1还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算橙黄色甲臢的生成量，进而求出甾体C1,2位脱氢酶活性。
所述的WST-1的化学式为：
优选的，甾体C1,2位脱氢酶底物与助溶剂混合后再添加至缓冲液中，所述助溶剂为下列之一：DMSO、DMF、吐温80、乙醇。
反应液中甾体C1,2位脱氢酶底物浓度为10～100mM，吩嗪硫酸甲酯的浓度为5～25μM，WST-1的浓度为10～100mM。待测溶液中甾酮C1,2位脱氢酶酶活检测范围为10mU/L～100mU/L。优选的，所述甾体C1,2位脱氢酶底物可为雄烯二酮或胆固醇、甘氨胆酸、牛磺胆酸、薯蓣皂苷等，优选为雄烯二酮(AD)。
所述甾体C1,2位脱氢酶最适反应温度为30℃～40℃，最适反应pH值为8.0～10.0。
所述含甾体C1,2位脱氢酶的待测溶液可为含甾体C1,2位脱氢酶的菌液，来自放线菌门、变形菌门或厚壁菌门等。
本发明的有益效果主要体现在：本发明针对现有技术的缺点，如细胞毒性、对具有抗氧化性药物的假阳性反应，提供了一种甾体C1,2位脱氢酶活力检测方法，特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量的甾体C1,2位脱氢酶酶活性检测。
(四)附图说明
图1是实施例1中液相方法检测底物AD(或产物ADD)随反应时间变化图；
图2是实施例1中液相方法底物AD(或产物ADD)标准曲线；
图3是实施例2中MTT法检测水溶性橙黄色甲臢产物随反应时间吸光度变化图；
图4是实施例2中MTT水溶性橙黄色甲臢产物标准曲线；
图5是实施例3中TTC法检测有机溶剂复溶后红色甲臢产物随反应时间吸光度变化图；
图6是实施例3中TTC有机溶剂复溶后红色甲臢产物标准曲线；
图7是实施例4中铁氰化钾[K3Fe(CN)6]法检测普鲁士蓝随反应时间吸光度变化图；
图8是实施例4中铁氰化钾[K3Fe(CN)6]与Fe3+作用生成普鲁士蓝标准曲线；
图9是实施例5中WST-1法检测水溶性橙黄色甲臢产物随反应时间吸光度变化图；
图10是实施例5中WST-1水溶性橙黄色甲臢产物标准曲线。
(五)
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：HPLC法检测甾酮C1,2位脱氢酶活性
具体方法：IPTG诱导16小时的菌液(大肠杆菌BL21(DE3)，购自北京全式金生物科技有限公司，下同)，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用25mL pH7.2的PBS缓冲液洗涤二次，称取5g湿菌体重悬于25mL的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作5S间歇10S，工作时间30min。12，000r/min离心15min获得上清液。取0.2mL上清液，2mmol/L的PMS，1g/L的AD，500mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，总反应体系达10mL。30℃反应，隔一定时间取样加入HCl终止反应。
液相方法：Agilent-C18色谱柱(颗粒，X)，流动相：甲醇：水＝6.5:3.5(v/v)，流速为1mL/min。在254nm处测定UV吸光度，柱温为35℃。液相方法检测底物AD随反应时间变化图参见图1。
标准曲线绘制：用反应体系配制1g/L的底物AD(用5％DMSO助溶)，分别稀释到0.1～0.9g/L。进行HPLC检测，检测方法：安捷伦C18柱，流动相：甲醇：水＝6.5:3.5(v/v)，流速1mL/min，波长254nm，柱温35℃。所得标准曲线参见图2。
HPLC法的缺点是有“柱外效应”且灵敏度不够高，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。
实施例2：MTT法检测甾酮C1,2位脱氢酶活性
反应原理：MTT是一种黄颜色的染料。脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在PMS的作用下生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜，经异丙醇作用颗粒溶解显色。在570nm下测定吸光度，以MTT还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算蓝色(或蓝紫色)沉淀甲臜的生成量，进而求出脱氢酶活性。
MTT标准曲线制作：称取MTT 0.4g，加入500μL95％酒精助溶，蒸馏水定容至100mL，配制成0.4％的MTT溶液。0.4％的MTT溶液避光保存。吸取250μL0.4％的MTT溶液于10mL容量瓶，加入少许Na2S2O4粉末，摇匀后产生蓝紫色晶体三苯基甲膳(TF)，再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作为参比，在570nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线，参见图4。
具体方法:IPTG诱导16小时的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用25mLpH7.2的PBS缓冲液洗涤二次，称取5g湿菌体重悬于25mL的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作5S间歇10S，工作时间30min。12，000r/min离心15min获得上清液。取0.1mL上清液，0.1mgPMS，1.5mgMTT，0.1mL浓度为1g/L的AD，50mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，总反应体系达3mL。30℃反应60min，加入HCl终止反应，检测570nm波长下吸光值变化情况，将一分钟内还原1μmol MTT所需的酶量定义为一个酶活单位U。XTT法检测水溶性橙黄色甲臢产物随反应时间吸光度变化图参见图3。
结论：该方法缺点是，生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜，需要有机溶剂复溶。
实施例3：TTC法检测甾酮C1,2位脱氢酶活性
反应原理：TTC(2，3，5-氯化三苯基四唑)无色，一种人造受氢体，在细胞呼吸过程中接受氢，还原成红色晶体三苯基甲膳(TF)。采用有机溶剂(如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等)进行萃取。在485nm下测定萃取液吸光度，以TTC还原量表示脱氢酶活性，根据标准曲线计算三苯基甲膳生成量，进而求出脱氢酶活性。
TTC标准曲线制作：称取TTC 0.4g，加入500μL95％酒精助溶，蒸馏水定容至100mL，配制成0.4％的TTC溶液。0.4％的TTC溶液避光保存，发红不能使用。吸取250μL0.4％的TTC溶液于10mL容量瓶，加入少许Na2S2O4粉末，摇匀后产生红色晶体三苯基甲膳(TF)，再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作为参比，在485nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线，参见图6。
具体方法:IPTG诱导16小时的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用25mLpH7.2的PBS缓冲液洗涤二次，称取5g湿菌体重悬于25mL的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作5S间歇10S，工作时间30min。12，000r/min离心15min获得上清液。取0.1mL上清液，加入0.002mL浓度为1M/L的PMS，0.5mL浓度为1mM/L的TTC溶液，0.1mL浓度为1g/L的AD，50mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，总反应体系达1mL。30℃反应60min，加入HCl终止反应，检测485nm波长下吸光值变化情况，将一分钟内还原1μmol TTC所需的酶量定义为一个酶活单位U。TTC还原法检测随催化反应时间红色甲臢产物吸光度变化图参见图5。
结论：该方法缺点是，生成红色晶体三苯基甲膳(TF)，需要有机溶剂复溶，使操作复杂。
实施例4：铁氰化钾[K3Fe(CN)6]还原法检测甾酮C1,2位脱氢酶活性
反应原理：铁氰化钾[K3Fe(CN)6]为红色固体盐可溶于水，水溶液带有黄绿色荧光。脱氢酶催化反应将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，K4Fe(CN)6再与Fe3+作用生成普鲁士蓝，在700nm波长测定吸光值，以检测普鲁士蓝的生成量，作为脱氢酶的还原力，吸光值愈高表示脱氢酶活力愈强。
K3Fe(CN)6标准曲线制作：称取K3Fe(CN)6 0.4g，加入蒸馏水定容至100mL，配制成0.4％的K3Fe(CN)6溶液。吸取250μL0.4％的K3Fe(CN)6溶液于10mL容量瓶，加入少许Na2S2O4粉末，摇匀后产生K4Fe(CN)6，再用蒸馏水定容至刻度，摇匀。分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即得到K4Fe(CN)625μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，用加入Fe3+作用生成普鲁士蓝，以空白作为参比，在700nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线，参见图8。
具体方法:IPTG诱导16小时的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用25mLpH7.2的PBS缓冲液洗涤二次，称取5g湿菌体重悬于25mL的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作5S间歇10S，工作时间30min。12，000r/min离心15min获得上清液。取0.1mL上清液，0.1mg PMS，0.21mL浓度为61Mm/L的铁氰化钾[K3Fe(CN)6]，0.1mL浓度为1g/L的AD，500mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液，总反应体系达3mL。30℃反应60min，加入HCl终止反应，检测700nm波长下吸光值变化情况，将一分钟内还原1μmol铁氰化钾[K3Fe(CN)6]所需的酶量定义为一个酶活单位U。铁氰化钾[K3Fe(CN)6]法检测普鲁士蓝随反应时间吸光度变化图参见图7。
结论，该方法缺点是，对酶有毒害作用。相同体系下，低浓度铁氰化钾使酶活降低至少一半；高浓度铁氰化钾使酶失活，使检测结果不准确。
实施例5：WST-1法检测甾酮C1,2位脱氢酶活性
反应原理：甾酮C1,2位脱氢酶脱掉底物(AD)上的两个氢原子生成ADD时，FAD+接收氢原子转变为FADH2，后者再通过递氢体PMS还原显色试剂，而显色试剂在紫外波长下有特征吸收峰，所以可通过检测紫外波长下吸光值变化来检甾酮C1,2位脱氢酶的酶活力。因此，甾酮C1,2位脱氢酶可以通过加入人工受氢体的办法进行检测。检测试剂选用WST-1检测试剂体系，在电子受体PMS产生440nm处有吸收值物质。
WST-1标准曲线制作：称取WST-1 0.4g，加入500μL95％(v/v)酒精助溶，蒸馏水定容至100mL，配制成0.4％(w/w)的WST-1溶液。0.4％的WST-1溶液避光保存。吸取250μL0.4％的WST-1溶液于10mL容量瓶，加入少许Na2S2O4粉末，摇匀后产生可溶性三苯基甲膳(TF)，再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。分别取0.25mL、0.5mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于10mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TF25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作为参比，在440nm下测定萃取液吸光度，绘制标准曲线，参见图10。
具体方法:IPTG诱导16小时的菌液，4℃，8000r/min离心10min收集菌体，用25mLpH7.2的PBS缓冲液洗涤二次，称取5g湿菌体重悬于25mL的该缓冲液中。冰浴中40％功率超声破碎，工作5S间歇10S，工作时间30min。12,000r/min离心15min获得上清液。取0.1mL上清液，25μM/L PMS，40Μm/L WST-1，50Μm/L AD，50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液，总反应体系达1mL。30℃反应60min，加入HCl终止反应，检测440nm波长下吸光值变化情况，将一分钟内还原1μmol WST-1所需的酶量定义为一个酶活单位U。
WST-1法检测水溶性橙黄色甲臢产物随反应时间吸光度变化图参见图9。
各种方法的优缺点参见下表1：
结论：在电子藕合试剂吩嗪硫酸甲酯存在的情况下WST-1检测试剂可以被甾酮C1,2位脱氢酶还原，生成高度水溶性的橙黄色的甲攒产物(formazan)，在440nm处有紫外吸收，特异性强(针对甾体1,2位脱氢酶及其底物的结果更稳定)、灵敏度高(OD600在0.2下也可检测，其他方法检测结果不准确)、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量的甾酮C1,2位脱氢酶活性检测。
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