阅读说明：本技术 瑞戈非尼在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途 (Application of regorafenib in preparation of medicine for treating brain glioma ) 是由 黄灿华 王魁 蒋静文 张露 雷云龙 于 2018-07-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了瑞戈非尼在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途。实验结果表明,瑞戈非尼可以有效抑制脑胶质瘤细胞的增殖,并且可以杀死脑胶质瘤细胞,可单独使用,也可与其他药物联合使用,尤其是与替莫唑胺联合使用时具有协同增效的作用,为脑胶质瘤治疗提供了新的用药参考。(The invention discloses an application of regorafenib in preparing a medicament for treating brain glioma. Experimental results show that regorafenib can effectively inhibit the proliferation of brain glioma cells and kill the brain glioma cells, can be used independently or in combination with other medicines, particularly has a synergistic effect when used in combination with temozolomide, and provides a new medication reference for brain glioma treatment.)

瑞戈非尼在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途

技术领域

本发明涉及瑞戈非尼在制备治疗胶质瘤的药物中的用途。

背景技术

脑胶质瘤是指源自神经上皮的肿瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的颅内恶性肿瘤，具有很强的局部侵袭和迁移能力，年发病率为3～8人/10万人口，其发病率随年龄增大而增加。根据脑胶质瘤肿瘤细胞形态学与正常脑胶质细胞的相似程度，可分为：星型细胞瘤——星形细胞；少枝细胞瘤——少枝细胞；室管膜瘤——室管膜细胞；混合胶质瘤，例如少枝——星形细胞瘤，包含了混杂类型的胶质细胞。根据世界卫生组织(WHO)制定的分级系统可将脑胶质瘤分为1级(恶性程度最低、预后最好)到4级(恶性程度最高、预后最差)。其中，传统细胞病理学所谓的间变胶质瘤与WHO的3级相对应；胶质母细胞瘤与WHO的4级相对应。根据此分级系统，脑胶质瘤按肿瘤细胞在病理学上的恶性程度，可以进一步分类：低级别胶质瘤(WHO1～2级)为分化良好的胶质瘤；虽然这类肿瘤在生物上并不属于良性肿瘤，但是患者的预后相对较好；高级别胶质瘤(WHO3～4级)为低分化胶质瘤；这类肿瘤为恶性肿瘤，患者预后较差。

目前胶质瘤的治疗手段主要有手术切除、放射治疗、药物治疗等，新兴治疗方法如分子靶向疗法、免疫治疗、基因治疗等方法也在不断发展完善。目前胶质瘤的治疗水平有限，药物治疗是有效杀灭手术切除后残余肿瘤组织的辅助手段。治疗高级别胶质瘤的药物有多种，临床上根据胶质瘤的种类、分期、标志物的表达水平以及病人的生理状况进行治疗方案的制定。目前国内外常用的胶质瘤治疗药物有：替莫唑胺(TMZ)，是第二代烷化剂，为目前胶质瘤化疗的一线药物；亚硝脲类，以洛莫司汀、卡莫司汀等为主；丙卡巴肼；植物类药物，包括喜树碱、长春碱、鬼臼毒素等药物；铂类抗肿瘤药物，如顺铂、卡铂等；靶向VEGF的药物，如贝伐珠单抗等。

目前未见关于瑞戈非尼用于治疗胶质瘤的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供瑞戈非尼的新用途，具体的，本发明提供了瑞戈非尼在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途。

进一步地，所述脑胶质瘤为原发性胶质母细胞瘤、原发性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、混合性胶质瘤。

进一步地，所述脑胶质瘤细胞为人恶性胶质母细胞瘤U87MG细胞、人神经胶质细胞瘤U251细胞、人脑星形胶质母细胞瘤U118MG细胞、人脑星形细胞瘤H4细胞、胶质瘤患者原代分离细胞Primary GBM cell、大鼠神经胶质瘤C6细胞、小鼠永生化小胶质细胞BV2细胞。

进一步地，所述药物是抑制Ki67表达的药物。

进一步地，所述药物是抑制胶质瘤细胞生长的药物。

进一步地，所述药物是以瑞戈非尼为活性成分，再加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗胶质瘤的药物，它是以瑞戈非尼为活性成分，再加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种治疗胶质瘤的联合药物，它是以瑞戈非尼为活性成分，再加上其他治疗胶质瘤的药物制备而成的制剂。

进一步地，所述其他治疗胶质瘤的药物选自替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫司汀、丙卡巴肼、喜树碱、长春碱、鬼臼毒素等；优选地，所述药物选自替莫唑胺。

进一步地，所述制剂为口服制剂。

实验结果表明，瑞戈非尼可以有效抑制脑胶质瘤细胞的增殖，并且可以杀死脑胶质瘤细胞，可单独使用，也可与其他药物联合使用，尤其是与替莫唑胺联合使用时具有协同增效的作用，为脑胶质瘤治疗提供了新的用药参考。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的

具体实施方式

，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：人脑胶质瘤细胞在加入瑞戈非尼的培养基处理24小时后的MTT结果。

图2：人脑胶质瘤细胞在加入瑞戈非尼的培养基处理24小时后的Edu结果。

图3：人脑胶质瘤细胞在加入瑞戈非尼的培养基处理24小时后的LDH结果。

图4：皮下胶质瘤裸鼠模型注射瑞戈非尼后，生长受到显著抑制的示意图，其中，A：注射生理盐水14天后，皮下胶质瘤的外面观；B：注射瑞戈非尼10天后，胶质瘤的外面观。

图5：皮下胶质瘤组织的免疫组织化学染色结果(Ki67染色，指示肿瘤细胞增殖)，左：注射生理盐水14天后，皮下胶质瘤组织的Ki67染色；右：注射瑞戈非尼14天后，皮下胶质瘤组织的Ki67染色。

图6：原位胶质瘤模型的HE染色：上：注射生理盐水21天后，原位胶质瘤组织的HE染色；下：注射瑞戈非尼21天后，原位胶质瘤组织的HE染色。

图7：原位胶质瘤裸鼠模型的生存期：黑色：注射生理盐水后，原位胶质瘤裸鼠模型的生存期；蓝色：注射瑞戈非尼后，原位胶质瘤裸鼠模型的生存期。

图8：皮下胶质瘤裸鼠模型注射瑞戈非尼或联合应用替莫唑胺后，生长受到抑制的示意图，其中，A：注射生理盐水14天后，皮下胶质瘤的外面观；B：注射替莫唑胺14天后，胶质瘤的外面观；C：注射瑞戈非尼14天后，胶质瘤的外面观；D：注射瑞戈非尼联合应用替莫唑胺14天后，胶质瘤的外面观。

具体实施方式

实施例1、瑞戈非尼对脑胶质瘤的抑制作用

(1)瑞戈非尼抑制脑胶质瘤细胞生长的实验

MTT实验：细胞(恶性胶质母细胞瘤U87MG细胞，人神经胶质细胞瘤U251细胞，人脑星形胶质母细胞瘤U118MG细胞，人脑星形细胞瘤H4细胞，胶质瘤患者原代分离细胞PrimaryGBM cell，大鼠神经胶质瘤C6细胞，小鼠永生化小胶质细胞BV2细胞)传代至第3至第6代时，消化并重新计数细胞，按5000个细胞/孔，接种于96孔板，培养基为DMEM培养基,边缘孔用PBS填充。细胞贴壁后(约24h)培养基换成含不同浓度的瑞戈非尼(0，5，10，15，20，30μM)培养基继续孵箱培育。于加药后第24h，加入10μL MTT(5mg/mL)，染色4h。去除培养液，加150μl/孔DMSO。测OD值：用酶标仪测490nm处OD值。采用单因素方差分析，重复至少3次实验，最终结果取其均值。结果如图1所示。(抑制率＝阴性对照OD均值—加药孔OD均值/阴性对照OD均值)。从图1可以看出，瑞戈非尼可以有效抑制脑胶质瘤细胞的细胞活力，而对正常胶质细胞的杀伤能力较小。

EdU实验：细胞(人恶性胶质母细胞瘤U87MG细胞，人神经胶质细胞瘤U251细胞)传代至第3至第6代时，消化并重新计数细胞，按5000个细胞/孔，接种于96孔板，培养基为DMEM培养基,边缘孔用PBS填充。细胞贴壁后(约24h)培养基换成含不同浓度的瑞戈非尼(0，5，10，15，20，30μM)培养基继续培育。于加药后第23h，加入100μL含50μM的EdU继续培养24h后固定，加入染色液反应30min，染核，观测。绿色荧光为增殖阳性细胞，统计细胞增殖率，最终结果取其均值。结果如图2所示。从图2可以看出，瑞戈非尼可以有效抑制脑胶质瘤细胞的增殖。

LDH实验：细胞(人恶性胶质母细胞瘤U87MG细胞，人神经胶质细胞瘤U251细胞)传代至第3至第6代时，消化并重新计数细胞，按5000个细胞/孔，接种于96孔板，培养基为DMEM培养基,边缘孔用PBS填充。细胞贴壁后(约24h)培养基换成含不同浓度的瑞戈非尼(0，5，10，15，20，30μM)双无培养基(无血清无抗生素)继续培育24h。吸取上清，检测LDH的活性，LDH活性与细胞死亡正相关，上清液中的LDH活性越高，表明细胞死亡越多。结果如图3所示。从图3可以看出瑞戈非尼可有效杀伤脑胶质瘤细胞。

(2)瑞戈非尼对胶质瘤生长的影响

实验动物为BALB/c nu/nu裸小鼠(简称为裸鼠)，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，隔离器屏障环境(SPF)级别环境下饲养。实验用裸鼠共12只，雌雄不限，鼠龄(35±3.2)d，体重(20.5±2.1)g。

胰蛋白酶消化收集U87细胞，以10⁷cells/mL密度重悬于无血清无抗生素的双无培养基中，以100μL/部位注射至裸鼠背部皮下。待肿瘤生长至150mm³，开始给药。实验组腹腔注射瑞戈非尼100μL(20mg/天/次)，连续注射14d。对照组注射相同剂量的生理盐水。观察肿瘤生长情况，至14天后，取出瘤体，成像。结果如图4所示。

实验结果显示：在胶质瘤的皮下动物模型中，瑞戈非尼处理后，肿瘤生长显著减慢。

(3)Ki67在皮下胶质瘤细胞中的表达

①组织的获取及处理：6对裸鼠皮下胶质瘤体。

②固定样本，包埋，切片(2-3μm)，于65℃烘箱中烘烤2h；

③过二甲苯I和II，各20min；过梯度酒***化，100％，3min；95％，3min；80％，3min；70％，3min；将片子放入蒸馏水清洗2次，每次5min，放在摇床上缓慢摇动；

④抗原修复：将切片放入抗原修复盒中，往盒中加入抗原修复液淹没切片，放入高压锅内煮沸，上汽3-5min后，自然冷却；将片子放入蒸馏水清洗2次，每次5min，放在摇床上缓慢摇动；过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3％H₂O₂，室温10min(避光)；将片子放入蒸馏水清洗2次，每次5min；

⑤正常血清封闭：将切片从抗原修复盒中取出，擦净切片面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态)，滴加50微升正常山羊血清处理，置于保湿盒中30min；

⑥滴加一抗：用滤纸吸去血清，直接滴加50微升一抗，4℃冰箱过夜；将切片放入抗原修复盒中用PBS洗3次，每次5分钟；

⑦滴加50微升二抗，置于保湿盒中，37℃烘箱放置40min；将切片放入抗原修复盒中用PBS洗3次，每次5分钟；滴加50微升三抗，置于保湿盒中，37℃烘箱放置40min；将切片放入抗原修复盒中用PBS洗3次，每次5分钟；

⑧DAB显色，镜下观察；自来水冲洗10-15min；苏木素复染，返蓝，自来水冲洗10-15min；

⑨中性树胶封片，置于通风橱中风干后镜检。

结果见图5，从图5可以看出，瑞戈非尼处理后的小鼠肿瘤组织中，Ki67的表达更少，表明瑞戈非尼的处理使肿瘤体内增殖速度减慢。

(4)裸鼠原位胶质瘤模型的HE染色

取所构建的原位胶质瘤裸鼠模型脑部，固定，包埋，切片；Mayer氏苏木素染色，20s；自来水冲洗，5-10min；75％盐酸酒精处理5s；自来水冲洗30s；依红复染，1-2min；自来水漂洗30s；85％酒精漂洗，1次，1-2min；95％酒精漂洗，2次，每次1-2min；100％酒精漂洗，2次，每次1-2min；二甲苯漂洗，2次，每次5-10min；中性树胶封片。镜检。结果见图6。从图6可以看出，瑞戈非尼处理可有效减缓颅内胶质瘤的生长，进而减小颅内胶质瘤的肿瘤大小。

(5)裸鼠原位胶质瘤模型的生存期

在构建了原位胶质瘤裸鼠模型后，随机分为两组，A：对照组，注射100μL溶剂(生理盐水+蓖麻油+乙醇)。B：实验组，注射瑞戈非尼100μL(20mg/天/次)。统计裸鼠的生存期情况，绘制曲线，结果见图7。从图7可以看出，瑞戈非尼可有效增加裸鼠的生存时间。

(6)瑞戈非尼与其他药物联合使用对胶质瘤细胞生长的抑制作用

实验动物为BALB/c nu/nu裸小鼠(简称为裸鼠)，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，隔离器屏障环境(SPF)级别环境下饲养。实验用裸鼠共12只，雌雄不限，鼠龄(35±3.2)d，体重(20.5±2.1)g。

胰蛋白酶消化收集U87细胞，以10⁷cells/mL密度重悬于双无培养基中，以100μL/部位注射至裸鼠背部皮下。

待肿瘤生长至150mm，开始给药。A：对照组，注射100μL生理盐水。B：实验组，注射替莫唑胺100μL(10mg/天/次)。C：实验组：注射瑞戈非尼100μL(10mg/天/次)。D：实验组，注射瑞戈非尼(10mg/天/次)联合替莫唑胺(10mg/天/次)共100μL。连续给药14天，观察肿瘤生长情况，至14天后，取出瘤体，成像。结果如图8所示。

从图8可以看出，瑞戈非尼可以显著增加替莫唑胺对胶质瘤细胞生长的抑制作用，两者共同使用具有协同增效的作用。

综上，瑞戈非尼可以有效抑制脑胶质瘤细胞的增殖，并且可以杀死脑胶质瘤细胞，可单独使用，也可与其他药物联合使用，尤其是与替莫唑胺联合使用时具有协同增效的作用，为脑胶质瘤治疗提供了新的用药参考。