阅读说明：本技术 Y染色体微缺失检测引物组及试剂盒 (Y chromosome microdeletion detection primer group and kit ) 是由 张惠丹 于 2019-12-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了Y染色体微缺失检测引物组及试剂盒,针对19个Y染色体微缺失突变位点,选择X/Y连锁锌指蛋白基因(ZFX/Y)为内对照位点。本发明可以在可操作性、灵敏度、节省时间方面解决现有技术的不足,技术实验设计灵活,覆盖突变位点多,更适合中国人,结果准确,检测速度快,适合批量筛查。(The invention discloses a Y chromosome microdeletion detection primer group and a kit, aiming at 19Y chromosome microdeletion mutation sites, an X/Y linkage zinc finger protein gene (ZFX/Y) is selected as an internal control site. The invention can solve the defects of the prior art in the aspects of operability, sensitivity and time saving, has flexible technical experiment design, more mutation sites, accurate result and high detection speed, is more suitable for Chinese people and is suitable for batch screening.)

Y染色体微缺失检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明属于生物基因检测技术领域，涉及Y染色体微缺失检测引物组及试剂盒。

背景技术

全世界约有15％的夫妇不育，其男性不育的因素约占50％。Y染色体微缺失是除了克氏综合征导致男性特发性不育的第二大因素。1976年，科学家发现了无***症因子(AZF)，他们认为AZF是Y染色体长臂控制***生成的基因位点。随后又有大量研究证实在Y染色体Yq11.23上存在着控制***生成的基因，且将AZF划分成3个区域，即AZFa、AZFb和AZFc，其每个区域中又包含若干AZF候选基因，如AZFa区域的USP9Y和DBY，AZFb区域的RBMY1和HSFY，AZFc的DAZ等，这些基因的缺失或异常均有可能使***生成异常，从而导致男性不育。即使有些AZF缺失患者可以通过正常生殖或辅助生殖技术孕育下一下，但是AZF缺失会传给他们的男性后代。因此Y染色体微缺失检测在临床上的应用有非常重要的意义。

现在临床上多采用欧洲男科协会/欧洲分子遗传学质量网推荐的6位点。6位点多适用于欧美人群，对于中国人可能存在漏检的情况。

发明内容

本发明的目的在于提供Y染色体微缺失检测引物组及试剂盒，可以在可操作性、灵敏度、节省时间方面解决现有技术的不足问题。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了Y染色体微缺失检测引物组，分别针对19个Y染色体微缺失突变位点，其中：

所述突变位点为AZFa区的sY82、sY84、sY86、sY88位点时，所述引物组包括：

sY82-F CAGTGTCCACTGATGGATGA，

sY82-R ATCCTGCCCTTCTGAATCTC；

sY84-F AGAAGGGTCTGAAAGCAGGT，

sY84-R GCCTACTACCTGGAGGCTTC；

sY86-F GTGACACACAGACTATGCTTC，

sY86-R ACACACAGAGGGACAACCCT；

sY88-F CACCCAGCCATTTGTTTTAC，

sY88-R TTGTAATCCAAATACATGGGC；

所述突变位点为AZFb区的sY121、sY123、sY124、sY127、sY133、sY134位点时，所述引物组包括：

sY121-F CCTGTGACTCCAGTTTGGTC，

sY121-R AGTTCACAGAATGGAGCCTG；

sY123-F GGGGTTTATACTGACCTGCC，

sY123-R CCGTGTGTTGCTGGGCTGTC；

sY124-F ACTGTGGCAAAGTTGCTTTC，

sY124-R CAGGCAGGACAGCTTAAAAG；

sY127-F GGCTCACAAACGAAAAGAAA，

sY127-R CTGCAGGCAGTAATAAGGGA；

sY133-F TGATGATTGCCTAAAGGGAA，

sY133-R ATTTCTCTGCCCTTCACCAG；

sY134-F GTCTGCCTCACCATAAAACG，

sY134-R ACCACTGCCAAAACTTTCAA；

所述突变位点为AZFc区的sY145、sY152、sY153、sY157、sY239、sY242、sY254、sY255、sY277位点时，所述引物组包括：

sY145-F ACAGGAGGGTACTTAGCAGT，

sY145-R AAGACAGTCTGCCATGTTTCA；

sY152-F ACAGGAGGGTACTTAGCAGT，

sY152-R AAGACAGTCTGCCATGTTTCA；

sY153-F TGCAGGGTACTTAGCAGTA，

sY153-R ATTAGACAGTCTGCCATGA；

sY157-F CCTGCTGTCAGCAAGATACA，

sY157-R CTTAGGAAAAAGTGAAGCCG；

sY239-F CATGTTTCACAGCAAGATACA，

sY239-R CTTAATAAAACGAAGCCG；

sY242-F TCTGCCACTAAACTGTAAGCTCC，

sY242-R ACACAGTAGCAGCGGGAGTT；

sY254-F GAACCGTATCTACCAAAGCAGC，

sY254-R GGGTGTTACCAGAAGGCAAA；

sY255-F GTTACAGGATTCGGCGTGAT，

sY255-R CTCGTCATGTGCAGCCAC；

sY277-F GTTACAGTCTGCCATGTTT，

sY277-R ACAGAATGGAGCCACATT。

优选地，所述引物组还包括针对X/Y连锁锌指蛋白基因(ZFX/Y)内对照位点的引物组：

ZFX/Y-F ACCRCTGTACTGACTGTGATTACAC，

ZFX/Y-R GCACYTCTTTGGTATCYGAGAAAGT。

本发明还提供了包括上述引物组的Y染色体微缺失检测试剂盒。

本发明的有益效果如下：

技术实验设计灵活，覆盖突变位点多，更适合中国人，结果准确，检测速度快，适合批量筛查。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明做进一步说明，应当理解的是，以下实施例并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

发明人依据Clinvar、HGMD、OMIM、DisGeNET、PheGenI、dbNSFP、UniProtKB等专业遗传数据库，并查阅知网等中文数据库收集了中国人常见的突变，最终确定了Y染色体微缺失突变位点19个：

AZFa区的sY82、sY84、sY86、sY88；

AZFb区的sY121、sY123、sY124、sY127、sY133、sY134；

AZFc区的sY145、sY152、sY153、sY157、sY239、sY242、sY254、sY255、sY277。

另外，选择X/Y连锁锌指蛋白基因(ZFX/Y)为内对照位点。

根据位置信息，发明人采用不同的引物设计软件，如Vector NTI Suit、Dnasis、Primr premier、Oligo、Omiga、Dnastar等设计引物详见表1。

表1.针对不同位点的引物序列及其PCR分组

实施例10名不育男性患者的Y染色体微缺失的基因检测

本申请从苏州绘真医学检验所收集了10例主诉为不育男性患者的血液样品(均已签署知情同意书)。

1、DNA提取

使用Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega)或NucleoSpin Tissue(MN)等试剂盒或类似产品，提取10例血样中的DNA(样品编号1-10)。用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。

2、PCR试剂配制

19个STS位点分5组扩增(A、B、C、D、E)，分组信息见表2，并在每组中加上内对照引物ZFX/Y。

表2.PCR扩增分组

PCR扩增反应体系如下：

将样品按照2.5μl/管的量逐一加入到相应的PCR反应管中，盖紧盖子后以2000rpm转速离心10秒钟，使反应液体集中在PCR反应管的底部。

3、PCR扩增

将PCR反应管放入PCR仪，设定好热盖功能。并按照如下温度的热循环条件进行：

表3.PCR扩增条件

4、信号收集

35个循环阶段收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，并保存相关文件。

5、扩增结果确认

a)质控品每个检测通道，一般Ct起跳在32之前，可能会因不同的仪器，不同的阈值设置而发生波动。

b)阴性对照的通道检测应无曲线起跳，任何一组任何一个通道检测有信号起跳，则此次结果无效，建议排查污染原因，重做。

c)实验结果判断：阳性结果首先应出现典型的S型扩增曲线，然后再根据检测通道的相应检测指标Ct值进行结果判断。

6、结果分析

我们检测了10例样品，结果阳性率为80％。见表4。

表4. 10例样品PCR扩增结果

7、结果验证

我们采用某公司Y染色体微缺失6位点试剂盒的方法对10例样品进行了验证。见表5。

表5.本申请与现有试剂盒检测结果比较

由此可见，本申请提供的试剂盒结果准确，覆盖突变位点更多。