翘嘴鳜雄性分子标记引物及其应用
阅读说明：本技术 翘嘴鳜雄性分子标记引物及其应用 (Siniperca chuatsi male molecular marker primer and application thereof ) 是由 张勇 韩崇 李桂峰 李水生 韩林强 梁建辉 林浩然 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种翘嘴鳜雄性分子标记引物,所述引物至少包括引物对1、引物对2中一种,所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物,所述引物对2包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物,其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示,Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示,Contig-2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示,Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。该引物可对翘嘴鳜的性别进行快速准确地鉴定。同时还提供一种鉴别翘嘴鳜鱼性别的方法,该方法耗时短,效率高。(The invention provides a siniperca chuatsi male molecular marker primer, which at least comprises one of a primer pair 1 and a primer pair 2, wherein the primer pair 1 comprises a Contig-1 upstream primer and a Contig-1 downstream primer, and the primer pair 2 comprises a Contig-2 upstream primer and a Contig-2 downstream primer, wherein the nucleotide sequence of the Contig-1 upstream primer is shown as SEQ ID NO: 1, the nucleotide sequence of the Contig-1 downstream primer is shown as SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence of the Contig-2 upstream primer is shown as SEQ ID NO: 3, the nucleotide sequence of the Contig-1 downstream primer is shown as SEQ ID NO: 4, respectively. The primer can be used for rapidly and accurately identifying the sex of siniperca chuatsi. Meanwhile, the method for identifying the sex of the siniperca chuatsi is short in time consumption and high in efficiency.)
技术领域
本发明属于水产生物技术领域中鱼类性别鉴定技术，具体涉及翘嘴鳜雄性分子标记引物及其应用。
背景技术
近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，已有多种鱼类的性别特异标记被开发出来，如尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)以及红鳍东方鲀(Takifugurubripes)等，但是这些标记主要是通过微卫星(microsatellite，SSR)、限制位点相关DNA(restriction site associated DNA，RAD)和扩增片段长度多态性(amplifiedfragment length polymorphism，AFLP)等分子标记开发技术获得，这些分子标记开发方法耗时长，工作量大，成功率低。而高通量测序技术的出现为分子标记开发提供了一种新的高效手段，目前通过高通量测序的方法已成功开发出乌鳢及大黄鱼性别特异分子标记。
翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)，属于鲈形目(Perciformes)，鳜科(Sinipercidae)，鳜属(Siniperca)，俗称鳜鱼、桂花鱼，其英文名意为中国鲈(Chinese perch)、满洲鱼(Mandarin Fish)。翘嘴鳜为我国特有淡水名贵鱼类，其肉质鲜美，营养丰富，无肌间刺，深受国内外消费者喜爱。翘嘴鳜的生长过程呈性别二态性，同龄商品鱼，雌鱼的体重比雄鱼大约10-20％，因此翘嘴鳜全雌单性育种具有更高的经济效益。
尽管以往的染色体核型分析并没有发现明显的性染色体，但我们通过对雌雄基因组测序分析，发现雄性基因组有许多特异DNA片段，因此推测鳜鱼性别决定为雄性异配。而全雌鳜单性育种首先需要得到伪雄鱼，获得伪雄鱼的主要通过遗传雌鱼诱导性逆转的途径获得。而传统的方法是通过测交实验来判别父本的性染色体组成，即是XX伪雄鱼还是正常XY雄鱼。鳜鱼很难从外部形态上区分性别，而通过解剖识别性腺也至少需要三个月，且测交亲本单独养殖需要占用较多养殖资源，所以用测交的方法耗时，费力又费资源。迄今为止，国内外尚无能够成功鉴定翘嘴鳜遗传性别的分子标记的报道，因此，开发一种准确鉴定遗传雄性的分子标记在翘嘴鳜全雌育种中具有极大的生产应用价值。
发明内容
本发明第一目的在于提供翘嘴鳜雄性分子标记引物，该引物能在分子水平上鉴别雄性翘嘴鳜。
本发明第二目的在于提供一种翘嘴鳜鱼性别鉴定的方法，该方法耗时短，检测结果准确。
本发明第三目的在于提供一种翘嘴鳜雄性分子标记引物进行翘嘴鳜鱼全雌性育种的应用。
为实现上述第一目的，本发明采用以下技术方案：
一种翘嘴鳜雄性分子标记引物，所述引物至少包括引物对1、引物对2中一种，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，所述引物对2包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Contig-2上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
具体的，各引物从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-1上游引物：5’-GCTGCTTTGAAGTCTGATACATG-3’；
Contig-1下游引物：5’-TGGTTTGTCAGATTGCACCTGTA-3’；
Contig-2上游引物：5’-CATCTCCTCTTAACAGGGACCAT-3’；
Contig-2下游引物：5’-TCCGGTTATCCAGAGGAGGTGAT-3’。
为实现上述第二目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用上述翘嘴鳜雄性分子标记引物进行翘嘴鳜鱼性别鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)设计引物对1和引物对2；
(2)翘嘴鳜鱼DNA样品制备；
(3)以步骤(2)中的DNA为模板，采用引物对1或引物对2进行PCR扩增，扩增反应结束后，进行电泳检测，若电泳结果显示具有特异性DNA特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为雄性翘嘴鳜鱼，若电泳结果显示不具有特异性条带，此时所检测的翘嘴鳜鱼DNA样品为雌性翘嘴鳜鱼。
步骤(2)中DNA样品制备采用柱式离心法提取翘嘴鳜鱼DNA。
步骤(3)中采用引物对1或引物对2进行PCR扩增时，20μl PCR反应体系中包含DNA50 ng，Contig-1上游引物和Contig-1下游引物各0.8μl或Contig-2上游引物和Contig-2下游引物各0.8μl，2×Taq MasterMix 10μl，其余用ddH2O补充。
步骤(3)中采用引物对进行PCR扩增时，PCR反应程序是：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。
步骤(3)进行电泳检测时，采用质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段的长度。
步骤(3)电泳结果显示的特异性条带，采用引物对1出特异性条带的分子大小是374bp；采用引物对2出特异性条带的分子大小是489bp。
为实现上述第三目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用上述翘嘴鳜雄性分子标记引物进行翘嘴鳜鱼全雌性育种的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明基于雌雄翘嘴鳜的基因组高通量测序数据，利用基因组组装和比对等分析方法，快速、准确的筛选出翘嘴鳜雄性分子标记，首次设计了鉴别翘嘴鳜性别的雄性分子标记引物，该引物可对翘嘴鳜的性别进行快速准确地鉴定。
(2)本发明方法建立了一种利用翘嘴鳜雄性分子标记引物进行翘嘴鳜鱼性别鉴定的方法，利用两对特异性引物对，完成一个PCR反应就可以鉴别翘嘴鳜鱼性别，相较于传统通过测交实验来判别父本的性别，耗时短，效率高，节约资源。
附图说明
图1为雄鱼特有候选片段长度分布情况示意图；
图2为Y染色体候选片段获取示意图；
图3为Y染色体特有片段长度分布情况示意图；
图4为仅在雄性样本中检测到扩增片段，在雌性样本中未检测到扩增片段的2对引物的PCR产物电泳图
图5为在雌雄样本中检测到非特异扩增片段的4对引物的PCR产物电泳图；
图6为引物Contig-1F/R的雌雄个体(48尾)检测PCR产物电泳图；
图7为引物Contig-2F/R的雌雄个体(48尾)检测PCR产物电泳图。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
本实施例提供翘嘴鳜鱼雄性分子标记引物，引物包括引物对1或引物对2，所述引物对1包括Contig-1上游引物和Contig-1下游引物，所述引物对2包括Contig-2上游引物和Contig-2下游引物，其中Contig-1上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，Contig-2上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，Contig-1下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
具体的，各引物从5’-3’的核苷酸序列如下：
Contig-1上游引物：5’-GCTGCTTTGAAGTCTGATACATG-3’；
Contig-1下游引物：5’-TGGTTTGTCAGATTGCACCTGTA-3’；
Contig-2上游引物：5’-CATCTCCTCTTAACAGGGACCAT-3’；
Contig-2下游引物：5’-TCCGGTTATCCAGAGGAGGTGAT-3’。
本发明中上述翘嘴鳜鱼雄性分子标记引物通过以下方式获得，其步骤包括：
一)测序文库构建及重测序
1.鳜鱼DNA样品制备：
繁殖期间剪取鳜鱼雌性24尾和雄性4尾个体尾鳍，依次按雌鱼F1-F24、雄鱼M1-M4编号，采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，背景康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品，并用1％琼脂糖凝胶电泳和微量分光光度计(NanoDrop2000)进行质量和浓度检测，达到高通量测序的要求。
2.测序文库构建和高通量测序：
取雌鱼F1-F3、雄鱼M1-M3 DNA样品，分别构建350-500bp片段测序文库，利用IlluminaHiseq X Ten平台进行双末端(Pair-End)PE150测序，分别获得雌、雄基因组测序clean data：94,431,090,900bp和94,469,916,300bp。
从F4-F24共21份DNA样品中，取等量混匀成雌鱼DNA混合池，构建350-500bp片段测序文库，利用IlluminaHiseq X Ten平台进行双末端PE150测序，获得雌鱼DNA混合池测序clean data：36,249,884,100bp。
文库构建步骤具体参考Novogene NGS DNA Library Prep Kit说明书，测序由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。
二)Y染色体特异DNA片段的富集
1.包括雄鱼基因组组装：
运用SOAPdenovo v2.04-r240(https://github.com/aquaskyline/SOAPdenovo2)中all方法对雄鱼M1测序reads进行基因组组装,共获得1037309scaffolds,总大小819033064bp,其中N50＝28567bp。
2.雄鱼候选DNA片段获得：
用雌鱼F1-F3测序reads和雄鱼M1-M3测序reads采用bwa v0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件的aln方法进行比对到雄鱼基因组，过滤掉雄鱼测序reads不能双端比对上的reads，挑选出雄鱼测序reads都能比对上，但是雌鱼测序reads比对不上的区域，这些区域就是雄鱼特异的DNA片段(图1和图2)。
3.雄性特异DNA片段的富集：
以雄性基因组作为reference,雌鱼DNA混合池测序reads为query，采用bwav0.7.17-r1188(http://bio-bwa.sourceforge.net/)软件的aln方法进行序列比对,找出没有任何reads覆盖到的雄鱼特异DNA片段。有27条DNA片段没有任何一条雌鱼DNA混合池的read能比对得上，这些雄鱼DNA片段的长度主要分布于300-600bp，占总数的66.7％；长度≧300bp的Contig占总数的100％。这27条Contig中包含来自Y染色体的特异DNA片段(图3)。
三)Y染色体分子标记的筛选
1.引物设计与合成：
基于上述27条雄鱼Contig序列，随机选取其中6条Contig序列，采用Primer5软件(软件使用参照Primer PREMIER Version5.0 for Windows and Power Macintosh)设计PCR引物，引物按Contig-xxF/R编号(xx代表Contig号码)，如Contig-1的引物编号为Contig-1F/R(F代表上游引物，R代表下游引物，下同)。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
2.Y染色体分子标记的筛选及确认：
选择上述6对引物对雌雄各4尾个体进行PCR检测，PCR扩增反应总体系20μl，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng。PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，2对引物仅在雄性个体中获得扩增条带，在雌性个体中均未检测到扩增片段(图4)，两对引物分别是Contig-1F/R和Contig-2F/R，代表它们对应的Contig是Contig-1和Contig-2；其余4对引物，则在雌雄个体的扩增产物中存在非特异性杂带和无法准确判断的弥散条带(图5)，难以严格区分雌雄性别。
通过6对引物在雌雄各4个个体中的PCR扩增，确认了其中2条Contig：Contig-1和Contig-2是Y染色体特异片段，是鳜鱼的雄性分子标记。
实施例2
本实施例提供利用鳜鱼雄性分子标记引物进行翘嘴鳜鱼性别鉴定的方法，包括下述步骤：
(1)设计上述翘嘴鳜雄性分子标记引物，具体过程参照实施例1；
(2)翘嘴鳜鱼DNA样品制备：
从广东省佛山市三水白金水产种苗有限公司获得目测已性成熟的鳜鱼，经解剖得到雌、雄性别鳜鱼各24尾。分别剪取尾鳍，同样采用常规柱式离心法(通用型柱式基因组提取试剂盒，北京康为世纪生物科技有限公司)，参照说明书操作步骤制备DNA样品。
(3)PCR扩增验证：
采用引物Contig-1F/R和Contig-2F/R对上述雌、雄各24个鳜鱼DNA样品进行PCR验证。PCR扩增反应总体系20μl，包括康为世纪2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)10μl，上、下游引物(10μmol/L)各0.8μl，模板DNA 50ng，其余用ddH2O补充。
PCR反应程序为：首先94℃预变性2min；再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；再72℃终延伸5min。
PCR反应结束后，产物经质量百分含量为1％的琼脂糖凝胶电泳，结果：引物Contig-1F/R和Contig-2F/R在24尾雄鱼DNA样品中均能扩增出条带，此时，采用引物Contig-1F/R扩增出特异性条带的分子大小是374bp；采用Contig-2F/R扩增出特异性条带的分子大小是489bp。在24尾雌鱼DNA样品中均不能扩增出条带(图6：Contig-1F/R扩增结果图和图7：Contig-2F/R扩增结果图)。表明分子标记Contig-1F/R和Contig-2F/R可用于鉴定鳜鱼的性别鉴定。
实施例3
本实施例提供利用上述翘嘴鳜雄性分子标记引物进行翘嘴鳜鱼全雌性育种的应用，包括以下步骤：
(1)待翘嘴鳜鱼苗养殖至10日龄，用包含100mg/kg的雄激素17α-甲基***的鳗鱼料投喂饵料鱼，再将摄食激素料的饵料鱼投喂鳜鱼。持续投喂两个月，养殖期间采用自然光照，培育水温为26-28℃，饱食投喂。
(2)采用实施例2中的方法对投喂雄激素的鳜鱼进行筛选，得到遗传型为XX雄鱼，即伪雄鱼，具体过程参照实施例2。
(3)将标记鉴定出的XX伪雄鱼继续养到性成熟，在繁殖季节与正常XX雌鱼进行交配，获得的后代即为全雌鱼。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
序列表
<110> 中山大学
广东梁氏水产种业有限公司
<120> 翘嘴鳜雄性分子标记引物及应用
<130> 2019
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgctttga agtctgatac agt 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggtttgtca gattgcacct gta 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catctcctct taacagggac cta 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccggttatc cagaggaggt gat 23