一种潜伏期胃癌诊断试剂盒
阅读说明：本技术 一种潜伏期胃癌诊断试剂盒 (Latent gastric cancer diagnostic kit ) 是由 廖兴华 黄凤 项园 刘美君 王根鑫 段圆圆 李佳蓬 李慧 张同存 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种潜伏期胃癌诊断试剂盒,包括检测人细胞毒素相关蛋白A表达水平的试剂和能够检测出微生物的试剂,本发明在检测细胞毒素相关蛋白A阳性基础上,抽提粪便中细菌基因组DNA,通过DGGE分析肠道微生物群落多样性,可以判断患胃癌的风险,为患者采取尽早诊断和干预提供有效的依据。(The invention provides a latent gastric cancer diagnostic kit, which comprises a reagent for detecting the expression level of human cytotoxin-related protein A and a reagent capable of detecting microorganisms.)
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种潜伏期胃癌诊断试剂盒。
背景技术
胃癌是世界范围内的一种重要癌症，2018年新病例超过1,000,000例，其中约有783,000例死亡(相当于全球每12例死亡1例)，使其成为第五大常见癌症和第三大死亡癌症。其中男性的发病率及死亡率均比女性高1.5-2倍。由于早期胃癌患者多无症状或仅有轻微症状，当临床症状明显时，病变已属中晚期，所以，要十分警惕胃癌的早期症状，以免延误诊治。
胃病检查的常用方法是胃镜检查，如发现异常，再进行组织切片的病理检查。胃镜检查会对患者造成一定的痛苦，同时需要精确的操作以及严格的消毒，否则会对患者造成损伤和交叉感染，并且胃镜检查费用较高，因而大多数潜伏期胃癌患者在无明显症状时不会选择定期多次进行胃镜检查，就可能导致延误治疗，危及生命。
胃癌的发病机制目前尚不清楚，但是有害环境、腌制保存食物的摄入和低水果的摄入会增加患胃癌的风险，饮酒和吸烟也是既定的危险因素，其中幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的感染是胃癌发病的主要危险因素，近90％的非贲门胃癌病例归因于这种细菌，世界卫生组织已将幽门螺杆菌定义为I类致癌物质。肠道微生物菌群的平衡受饮食、药物、环境等因素的影响，对于肠道内环境的稳定起着重要作用。人体肠道内的有益菌和致病菌通过相互竞争来维持肠道内的平衡，当致病菌大量增加，肠道黏膜免疫系统的平衡被打破，可能引起肠道炎症。肠道菌群失衡现已被认为是影响各类疾病发生发展的重要因素，因此可以通过调节肠道菌群来预防疾病，促进健康，改善症状，缩短病程。
通过对幽门螺杆菌几种特定基因的相关性研究，细胞毒素相关基因A(cagA)被认为是引起细胞癌变的主要毒力基因，由cagA基因编码的细胞毒素相关蛋白A进入胃上皮细胞后，可以与细胞内多种蛋白反应，使细胞功能紊乱，甚至使胃上皮细胞发生病变，从而致病。各项研究指出CagA阳性幽门螺杆菌的感染增加了萎缩性胃炎及胃癌发生的风险。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种潜伏期胃癌诊断试剂盒，既能检测人细胞毒素相关蛋白A表达水平，又能够检测出肠道微生物群落多样性，使得更准确判断患胃癌的风险，这种体外检测方法高效快捷、安全可靠。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种潜伏期胃癌诊断试剂盒，包括检测人细胞毒素相关蛋白A表达水平的试剂和能够检测出微生物的试剂，所述微生物包括核梭杆菌属(Fusobacterium nucleatum)、毛螺菌属(Lachnospira Bryant and Small)、韦荣球菌属(Veillonella)、产气荚膜梭菌属(Clostridium perfringens)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和粪链球菌属(Streptococcus faecium)中的一种或多种。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测人细胞毒素相关蛋白A表达水平的试剂为ELISA检测方法用试剂。
进一步，优选的，所述检测人细胞毒素相关蛋白A表达水平的试剂包括酶联物、洗涤液、样品稀释液、显色剂和封闭液。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述能够检测出微生物的试剂包括能够抽提出被测者粪便中细菌基因组DNA的试剂。
进一步，优选的，所述能够检测出微生物的试剂包括裂解液、洗脱液、蛋白酶、引物、DNA聚合酶和dNTPs。
第二方面，本发明提供了一种所述潜伏期胃癌诊断试剂盒在筛选或鉴定治疗胃癌药物中的应用。
第三方面，本发明还提供了一种检测微生物的方法，用于提供预测或诊断潜伏期胃癌时所需的信息，所述微生物包括核梭杆菌属(Fusobacterium nucleatum)、毛螺菌属(Lachnospira Bryant and Small)、韦荣球菌属(Veillonella)、产气荚膜梭菌属(Clostridium perfringens)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、埃希氏菌属(Escherichia)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和粪链球菌属(Streptococcus faecium)中的一种或多种。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述检测微生物的方法包括抽提被测者粪便中细菌基因组DNA的步骤。
本发明的潜伏期胃癌诊断试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)并不是感染CagA阳性幽门螺杆菌就一定会发展为胃癌，本发明试剂盒既能检测幽门螺杆菌CagA蛋白的表达水平，又能检测肠道微生物菌群的组成，在CagA判定为阳性的基础上检测肠道微生物群落是否失调才能更准确预测早期胃癌；
(2)医院中常用的微生物鉴定方法是采用传统培养法，耗时长、培养要求高、影响因素多，更重要的是，很难模拟自然环境的条件，因而有些无法得到其纯培养物，此外，培养法只能培养活的细菌，而死的细菌却无法计数，然而，本发明通过检测粪便中细菌基因组DNA鉴定微生物菌群，得到的菌种多，结果更准确，且该检测方法方便快捷、灵敏度高。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
登记受试者信息，选取肠上皮化生异型增生患者男女各25人作为患者组，该患者组50人在此后均被确诊患有胃癌，健康男女各25人作为对照组，两组人的年龄均在42岁-48岁之间。
S1、检测细胞毒素相关蛋白A(CagA)
采集患者组与对照组待测者尿样，利用武汉默沙克公司的人细胞毒素相关蛋白A(CagA)ELISA试剂盒检测尿液中的CagA蛋白含量。
样品制备：用无菌管收集10mL尿液，4℃条件下2000-3000r/min离心20min，仔细收集上清，如保存过程中有沉淀，需再次离心。
浓缩样品稀释液的稀释：将浓缩样品稀释液用蒸馏水进行10倍稀释待用。
加样：在酶标包被板上分别设置空白孔、标准孔和待测样品孔，空白孔和标准孔里分别对应准确加入50μL已稀释的样品稀释液和50μL标准品，待测样品孔先加入40μL已稀释的样品稀释液，再加入10μL待测样品。加样时尽量不触及孔壁，加样后轻轻晃动使之均匀。
孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30min。
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍后备用。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，拍干。
加酶：每孔加入酶联物50μL，空白孔除外。
孵育：用封板膜封板后置37℃孵育30min。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，拍干。
显色：每孔加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。
终止：每孔加封闭液50μL，终止反应，此时孔里颜色立刻变为黄色。
测定：以空白孔调零，450nm波长处测量各孔的吸光度(OD)，测定应在加终止液后15min内进行。
实验结果：
当CagA大于150mg/L时判定为阳性，肠上皮化生异型增生患者的CagA含量明显高于健康对照组，已达到显著性差异(P＜0.05)，细胞毒素相关蛋白A的高表达会显著提高患胃癌的可能性。
S2、检测肠道微生物
1)分别称取患者组和对照组待测者各200mg粪便样品装入无菌试管中置于冰上，利用Foregene公司的DNA提取试剂盒提取所有样本的细菌基因组DNA，提取后的DNA样品冻存于-20℃冰箱。
2)PCR扩增
针对菌群基因组的16S rRNA基因V3可变区序列进行扩增，所用的通用引物序列如下：上游引物：GC-341F(5’-GC夹-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、下游引物：518R(5’-ATTACCGCGGCTGG-3’)，其中“GC夹”40bp，其序列为CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。
利用上海翊圣生物公司PCR试剂盒进行PCR扩增。PCR扩增体系(50μL)：8μL 10×ExPCR mixture Buffer(Mg2+)，5μL 1％BSA，5μL dNTPs，上下游引物各1μL，3μL模板DNA，0.5μLEx TaqDNA聚合酶(5U/μL)，去离子水26.5μL。PCR反应条件：95℃预变性6min；95℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s；30个循环；72℃充分延伸10min。反应结束后产物冰上或4℃保存。PCR结束后，用5μL PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测PCR是否成功。
3)变性梯度凝胶电泳(DGGE)
取PCR产物20μL与5μL 6×Loading Buffer混合均匀后，利用变性梯度凝胶电泳系统进行DGGE电泳分析。根据预实验，变性胶的浓度梯度设为30％-55％，电泳在60℃恒温水浴下进行，以140V 20min高压冲击后转为低压60V，所用的电泳缓冲液为1×TAE Buffer。电泳结束后，利用EB染色液在摇床上染色10min，于凝胶成像系统检测。
4)DGGE图谱分析
切取具有差异性的条带于无菌EP管中，用无菌水清洗3次，将上清液吸净，再次加入50μL 3dH2O，-20℃冰箱过夜保存。次日，90℃水浴10min，10000×g离心5min，取上清3μL为模板，上游引物为无GC夹的341F，其余组分及条件同步骤2)进行PCR扩增。扩增的PCR产物进行1％的琼脂糖电泳，对扩增出的DNA条带按照TIANGEN公司的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行切胶回收。纯化后DNA样品送至TaKaRa(武汉)测序，测序结果在NCBI数据库进行比对。应用Quantity One软件对DGGE图谱进行条带数目、相似性分析和聚类分析。
实验结果：
对患者组和对照组进行的16S rDNA V3区PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，其结果显示PCR产物均为200bp，且无非特异性扩增片段。
将PCR产物进行DGGE电泳，对差异性条带进行分析，鉴定患者组和对照组肠道微生物群落组成。通过测序和NCBI数据库比对，患者组和对照组肠道微生物优势菌群差异如下表所示。
由上表显示，肠上皮化生异型增生患者菌群失调严重，其中男性患者较女性患者严重。因此，可以通过检测肠道微生物群落多样性判断患胃癌的风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。