与玉米种子耐储性紧密连锁的ssr标记及其在分子标记辅助育种中的应用
阅读说明：本技术 与玉米种子耐储性紧密连锁的ssr标记及其在分子标记辅助育种中的应用 (SSR (simple sequence repeat) marker closely linked with corn seed storage resistance and application thereof in molecular marker-assisted breeding ) 是由 邸宏 张�林 *** 封陈晨 周羽 曾兴 于 2019-07-11 设计创作，主要内容包括：本发明公开了与位于玉米种子耐储性相关主效QTL区段紧密连锁的分子标记及其应用；所述分子标记与位于玉米第10号染色体Bin10.03区域内玉米种子耐储性相关主效QTL区段cQTL-10紧密连锁,该分子标记为phi050和umc1648。本发明通过定位玉米种子耐储性的1个主效QTL区段,该区段包含包含2个QTL qRVI-10和qRSVI-10,分别影响相对活力指数和相对简易活力指数,发现了与玉米种子耐储性紧密连锁的2个SSR分子标记phi050和umc1648,本发明所提供的SSR分子标记可应用于提高玉米种子耐储能力的分子辅助育种。(The invention discloses a molecular marker closely linked with a major QTL (quantitative trait locus) segment related to the storage tolerance of corn seeds and application thereof; the molecular marker is closely linked with a maize seed storage-resistant related major QTL segment cQTL-10 in the Bin10.03 region of the maize chromosome 10, and the molecular marker is phi050 and umc 1648. According to the invention, 2SSR molecular markers phi050 and umc1648 which are closely linked with the storage tolerance of the corn seeds are discovered by positioning 1 main effect QTL section of the storage tolerance of the corn seeds, wherein the section comprises 2QTL qRVI-10 and qRSVI-10 and respectively influence the relative vitality index and the relative simple vitality index, and the SSR molecular markers provided by the invention can be applied to molecular assisted breeding for improving the storage tolerance of the corn seeds.)
技术领域
本发明涉及玉米种子耐储性相关的SSR分子标记，尤其涉及与位于玉米种 子耐储性相关主效QTL区段cQTL-10紧密连锁的分子标记，本发明进一步涉及 其所述分子标记在分子辅助育种中的应用，属于分子标记及其应用领域。
背景技术
种子耐贮性即种子耐受贮藏的能力，不同品种由于遗传基础不同而表现出 不尽相同的贮藏生理特征，综合表现在种子贮藏前和贮藏期间对环境的需求及 适应能力上。种子活力是指种子的潜在发芽能力或者是种胚所具有的生命力， 是衡量种子是否耐贮藏的重要特性之一。干燥条件下具有正常生理活性的种子 在一段时间内能够保持活力，不同类型种子的活力保持时间也存在差异，随着 贮藏时间的延长、贮存条件的不当以及内外环境的肋迫，种子劣变老化会不可 避免地发生。老化导致的种子活力下降，多表现在萌发能力下降或者不萌发、 幼苗生长缓慢或者停止生长、出现畸形苗、长成的幼苗存在根部和茎叶发育不 良、成熟株生育能力下降等，这些都会导致其种用价值发生明显下降，给用种 者造成严重的损失。
大多数情况下温度和含水量越低，种子保有生活力的时间越长，通过控制种子 贮藏的条件可以适当延缓其活力的下降，延长贮存时间。利用种子自身遗传因 素，结合分子育种技术改良种子的耐贮性，选育出自身活力高、耐贮藏的新品 种是解决问题的根本途径。
玉米是中国第一大饲料、粮食及工业原料作物，年需种量约9亿公斤左右， 实际年种子生产量约为10-11亿公斤，加上备荒种子和育种的种质资源，每年有 大量生产用种需要贮藏，因此提高种子耐贮能力对于玉米遗传育种及农业生产 具有重要价值。全国农业技术推广服务中心(https://www.natesc.org.cn)资料显 示，2016年玉米种子有效库存量为8亿公斤左右，2017年新产种子10.58亿公 斤，预计2018年需种量在11亿公斤左右，有7-8亿公斤种子需要进行贮藏。每 年因贮藏的条件和种子的自身原因导致发芽率下降丧失种用价值的种子量达 3-5亿斤，给种业和玉米生产造成严重损失。传统的低温、药剂、密闭、干燥等 方式虽然可延长种子寿命，但效用有限，且存在贮藏成本高及药剂残留等问题， 提高玉米自身耐贮性、选育耐贮玉米新品种是解决这一问题的关键。
随着分子生物学的发展，研究者利用分子标记技术、组学测序技术、相关 基因克隆与转化等方法，对种子耐贮性遗传机制的探究不断深入。
祝煜中等(2018年)以甜玉米品种“东甜88”和“农甜99”为试材，用SRAP 标记检测发现老化处理后种子遗传多样性降低，耐贮性好的种子遗传多样性降 低的少。李春雷(2015年)以郑单958和先玉335种子为试材，利用MSAP分 子标记技术从表观遗传学DNA甲基化的层面对玉米种子耐贮性进行了相关的 研究，发现种子耐贮性与CG水平的DNA甲基化相关性较高。
Li等(Li T，Zhang Y，Wang D，et al.Regulation of Seed Vigor byManipulation of Raffinose Family Oligosaccharides in Maize and Arabidopsisthaliana[J]. Molecular Plant，2017，10(12):1540.)对与种子活力相关的ZmGOLS2、ZmRS和AtSTS基因进行研究，发现同时过表达ZmGOLS2和ZmRS基因和单独过表达 ZmGOLS2基因均提高了拟南芥种子活力，单独过表达ZmRS基因反而降低了拟 南芥种子活力。
玉米种子耐贮性的相关QTL定位也有报道，利用的群体材料包括暂时性分 离群体F2、永久性分离群体RIL、回交群体以及单倍体群体，表型检测方法包 括高温高湿老化法、热水浴老化法等，基因型检测方法包括SNP标记、SSR标 记等。Cheng等(Cheng X，GengG.QTL Analysis of Grain Storage Durability for Maize Under ControlledDeterioration Conditions Using SSR Markers[J].农业科学 与技术(英文版)，2012)将3个耐贮性相关QTL分别位于1、6和9染色体上， 贡献率分别为8.1％、23.0％和10.1％；兰海等(兰海，李新海，王凤格，等.玉 米种子休眠QTL定位[J].作物学报，2007，33(9):1474—1478)检测到贡献率为 2.45％-26.09％的7个QTL，分别位于1、3、5和10号染色体上，其中位于第1 染色体上的主效QTL贡献率达到26.09％；吕婷婷(吕婷婷.人工加速老化鉴定 玉米种子耐储性方法比较及相关性状的QTL初步分析[D].哈尔滨：东北农业大 学，2015)共检测到10个QTLs，分别位于1、2、5、7、8和10号染色体，表 型贡献率范围在4.37％-24.35％间；Hund等(Hund A，Fracheboud Y，Soldati A， et al.QTL controlling root and shoottraits of maize seedlings under cold stress[J]. Theoretical and AppliedGenetics，2004，109(3):618-629)找到20个QTL，其中 位于第5染色体与萌芽指数相关的主效QTL，贡献率为12％，与初生侧根长度 相关的QTL贡献率为14％；刘海英(刘海英.玉米种子活力相关性状的QTL定 位及遗传效应分析[D].河南农业大学，2012)检测到30个耐贮性相关QTL， 分布于1、2、3、4、5、8、9和10号染色体上，贡献率在6.3％-12.6％之间； Liu等(2011年)共找到了发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等4个相关 性状的16个QTL个；韩赞平(2014年)检测到172个种子活力相关的QTLs， 分布在除6号以外其他9条染色体上，解释性状遗传变异介于5.39％-12.11％之 间；赵瑞芳(赵瑞芳.不同条件下玉米种子活力相关性状的QTL定位分析[D].河 南农业大学，2012.)定位了与玉米种子活力相关的9个QTL，分布在1、4、5 和10号染色体上，其中位于第10号染色体上的位点为主效位点；Wang等(2015年)检测到49个与种子活力及耐贮性相关的QTLs，其中qGP5在两个定位群 体中均被检测出来[53]。宁洽(宁洽.基于SNP标记玉米种子活力相关性状研究 及发芽势、发芽率QTL分析[D].吉林农业大学，2017)在标准发芽条件下，检 测到4个与发芽势有关的QTL分别为qsgp2、qsgp1、qsgp3和qsgp4，分布于1、 6和7号染色体上，解释表型变异率17.25％、16.04％、8.65％和10.86％，；在低 温胁迫条件下检测到一个位于10号染色体与发芽势有关的qtlgp1，解释表型变 异为6.67％，一个与发芽率有关的qtlgr1，位于第6染色体，解释表型变异7.75％。
发明内容
本发明的目的之一是提供与玉米种子耐储性相关主效QTL区段紧密连锁的 分子标记；
本发明的目的之二是将所筛选得到的分子标记应用于玉米种子耐贮新品种 的分子辅助育种。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先提供了一种与玉米种子耐储性相关主效QTL区段紧密连锁的 SSR分子标记，所述SSR分子标记与位于玉米第10号染色体Bin10.03区域内玉 米种子耐储性相关主效QTL区段cQTL-10紧密连锁；优选的，所述SSR分子标 记为phi050和umc1648。
本发明通过遗传连锁图谱的构建和玉米种子耐储性相关QTL分析发现， 10号染色体上标记phi050和umc2043之间存在以相对发芽率、相对发芽势、相 对发芽指数、相对活力指数和相对简易活力指数为指标的5个耐贮性相关主效 QTL，分别为qRGP-10、qRGE-10、qRGI-10、qRVI-10和qRSVI-10，表型贡献 率分别为12.43％、20.11％、14.33％、10.08％和10.85，确定该区段为耐贮性相 关主效QTL区段。
本发明进一步将QTL重定位结果与F2:3群体定位结果重新进行一致性分析， 共确定2个与玉米种子耐贮性相关的一致性QTL区段，与之前相比区段缩小； 10号染色***于标记umc1648和phi050之间的一致性主效QTL区段cQTL-10 内，包含2个QTL qRVI-10和qRSVI-10，分别影响相对活力指数和相对简易活 力指数，表型贡献率分别为18.30％和17.91％，区段大小约为39.15Mb。
本发明进一步选取30株RIL群体中极端耐贮的家系DNA等量混合组成抗池，选 取30株RIL群体中极端不耐贮的家系DNA等量混合成感池，利用BSA法建池进行 分子标记的筛选。选取位于一致性主效QTL区段附近和内部的SSR标记检测抗池 和感池基因型，对基因型分离情况进行χ2检测，筛选出在亲本间、抗感池间中有 多态性并与QTL连锁紧密的SSR标记。将筛选出的分子标记在RIL群体的85个耐贮 家系中进行基因型检测，根据基因型检测结果与耐贮性表型检测之间的符合程度 及χ2检验结果筛选出耐贮性相关连锁标记。
在2个耐贮性相关一致性QTL区段cQTL-7和cQTL-10的边界附近和内部， 选择umc1295、umc1671、phi328175、umc1367、phi054、umc1648和phi050 等共9个标记进行选择效率的检测。结果发现分子标记umc1295、phi082、 umc1367、phi054和umc2043仅在两亲本间存在多态性，而在抗感池中无多态 性；而umc1671、phi328175、phi050和umc1648在亲本间以及抗感池间均具有 多态性，亲本间多态标记的有效传递率为44.44％。本发明利用抗池和感池内的 单株对筛选到的差异标记进行单株基因型分析，用χ2适合性测验来评价标记与 玉米种子耐贮性位点的关联性。χ2适合性检测分析表明，标记umc1671、 phi328175、phi050和umc1648与玉米种子耐贮性主效位点具有显著的相关性， χ2检测值分别为0.862、1.690、0.133和1.286，均小于3.84(p＝0.05水平，n＝1)， 可用于对玉米种子耐贮性主效位点的筛选；而其余5个标记χ2检测值均大于 3.84(p＝0.05水平)。结合4个标记在85个耐贮家系的基因型检测结果，及耐贮 性表型检测结果，进行符合率分析。4个标记的基因型和耐贮性表型符合率分别 为83.12％、80.82％、88.89％和82.93％，平均为83.94％(见表3-8)，其中标记 umc1648的符合率最高。最终确定4个来自于亲本东156的标记umc1671、phi328175、phi050、umc1648为玉米种子耐贮性相关连锁标记。
本发明还提供了用于扩增所述分子标记的引物，其中，用于扩增分子标记umc1648的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增 分子标记phi050的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。
本发明进一部用开发出的2个耐贮性相关连锁标记umc1648和phi050对 141份美国玉米自交系进行基因型检测。2个标记单独检测为耐贮的自交系分别 有8份、13份、10份和9份。在耐贮性连锁标记检测中鉴定为含有qRGE-7主 效QTL的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、N532、N209、Tx110；其 中ND248、ND252、ND246、SD65在耐贮性表型检测中鉴定为耐贮性最强的自 交系，N532、N209、Tx110在耐贮性表型检测中鉴定为耐贮性较强。
上述试验结果证明，本发明筛选出的与位于玉米第10号染色体Bin10.03区 域内玉米种子耐储性相关主效QTL区段cQTL-10紧密连锁的分子标记phi050 和umc1648可用于玉米种子耐贮新品种的选育。
本发明通过定位玉米种子耐储性的1个主效QTL区段，该区段包含3个QTL qRGP-7、qRGE-7和qRGI-7，分别影响相对发芽率、相对发芽势和相对发芽指 数，发现了与玉米种子耐储性紧密连锁的2个分子标记，可用于筛选玉米种子 耐储能力分子标记辅助育种。
本发明整体技术方案的详述
玉米种子耐储性相关QTL的分析和定位
本发明以玉米耐贮自交系东156和不耐贮自交系东237为亲本，通过单粒传 法自交7代，获得了含有288个家系的RIL群体，用于种子耐贮性QTL分析和 标记开发。
利用Icimapping 4.1软件对SSR基因型数据库进行遗传连锁图的构建，先用“group”命令对部分标记分组，再用“order”命令确定各连锁群标记排列顺序 (LOD＝3.0)，选用“Kosambi”函数将重组值转换成图距(cM)。参考玉米SSR Bin map，用“map”指令构建遗传连锁图谱。
结合表型数据库和基因型数据库，运行Icimapping 4.1软件，采用复合区间作 图法对耐贮相关性状进行QTL分析。相应的运行参数为Window size＝5.00cM， Model：ICIMADD，LOD：3.0。以LOD>3.0作为可检测QTL位点存在的阈值。
将定位到的主效QTL位点与课题组前期利用F2:3群体定位结果相对比，确定一 致性主效QTL区段。根据一致性主效QTL所在的区段增加SSR标记，采用复合区间 作图法进行玉米种子耐贮性相关QTL重定位，缩小耐贮性相关主效QTL所在区间。
遗传连锁图谱的构建
在MaizeGDB基因组数据库中选择1349个均匀分布于玉米10条染色体上的 SSR标记，在东156和东237两个亲本间进行多态性检测，共筛选出226个在亲本间 存在多态性且条带清晰的引物，用于遗传连锁图谱的构建。
依据226个SSR标记对RIL群体检测的基因型数据库，借助Icimapping4.1 软件构建遗传图谱(LOD＝3.0)拟合226个SSR标记位点，覆盖玉米10条染色 体，全长3467.4cM，平均标记间距为15.34cM，1-10号染色体的标记数目分 别是28、30、28、28、20、20、16、20、20和16个。
玉米种子耐贮性相关的QTL分析
结合RIL群体基因型检测结果和种子耐贮性表型检测结果，采用复合区间 作图法进行玉米种子耐贮性相关QTL分析，共检测到影响相对发芽率、相对发 芽势、相对发芽指数等6个玉米种子耐贮性相关指标的17个QTL，分布于玉米 的1、2、7、9和10号染色体上，单个QTL所解释的表型变异从最低的2.33％ 到最高的20.11％；其中9个QTL的加性效应值为正值，东156的等位基因对这 些位点起到增效作用，占QTL数的52.94％；而东237的等位基因对其余的8 个QTL位点起到增效作用，占QTL总数的47.06％。
10号染色体上标记phi050和umc2043之间存在以相对发芽率、相对发芽势、 相对发芽指数、相对活力指数和相对简易活力指数为指标的5个耐贮性相关主 效QTL，分别为qRGP-10、qRGE-10、qRGI-10、qRVI-10和qRSVI-10，表型贡 献率分别为12.43％、20.11％、14.33％、10.08％和10.85％；两个耐贮性相关主 效QTL区段的增效作用均来自于东156。
玉米种子耐贮性相关主效QTL重定位
利用RIL群体进行的QTL定位结果与之前F2:3群体定位结果相比对，发现 2个一致性主效QTL区段，分别位于7号染色体7.05的cQTL-7和10号染色体 10.03的cQTL-10。一致性QTL区段cQTL-7和cQTL-10分别位于7号染色体 umc1295和umc2333间，大小约为9.73Mb以及10号染色体phi054和umc2043 间，大小约为93.13Mb。在2个一致性主效QTL区段cQTL-7和cQTL-10的边 界附近及内部进行SSR标记的加密，其中7号染色体的cQTL-7区段增加9个 标记，10号染色体的cQTL-10区段增加22个标记，重新进行遗传连锁图谱的 构建和QTL分析。加密后SSR标记总数增加至257个，将基因型检测结果与耐 贮性表型检测结果相结合，采用复合区间作图法对耐贮性相关QTL重新进行分 析，定位结果在7和10号两条染色体上发生改变。
10号染色体上检测到9个QTL，分别为影响相对发芽率的qRGP-10、影响 相对发芽势的qRGE-10、影响相对发芽指数的qRGI-10，均位于phi054和 umc2043之间，贡献率分别为14.19％、17.99％和18.26％，加性效应值分别为 0.1466、0.1786和0.1142；3个影响相对活力指数的qRVI-10-1、qRVI-10-2和 qRVI-10-3，分别位于标记phi050和phi054之间、phi054和umc2043之间、 umc1930和umc1648之间，贡献率分别为22.39％、12.80％和19.71％，加性效 应值分别为0.1418、0.1425和0.1381；3个影响相对简易活力指数的qRSVI-10-1、qRSVI-10-2和qRSVI-10-3，分别位于标记phi050和phi054之间、phi054和umc2043之间、umc1930和umc1648之间，贡献率分别为19.59％、19.78％和 14.36％，加性效应值分别为0.1567、0.1571和0.1495。这9个位点的增效作用 均来自东156。
其中，在10号染色体上贡献率均大于10％的3个主效QTL qRGP-10、 qRGE-10和qRGI-10仍被定位于phi054-umc2043区段；2个贡献率均大于15％ 的主效QTL qRVI-10和qRSVI-10，被定位到umc1648-phi050区段，确定该区段 为耐贮性相关主效QTL区段，其增效作用来自于东156。
本发明进一步将QTL重定位结果与F2:3群体定位结果重新进行一致性分析， 共确定2个与玉米种子耐贮性相关的一致性QTL区段，与之前相比区段缩小； 10号染色***于标记umc1648和phi050之间的一致性主效QTL区段cQTL-10 内，包含2个QTL qRVI-10和qRSVI-10，分别影响相对活力指数和相对简易活 力指数，表型贡献率分别为18.30％和17.91％，区段大小约为39.15Mb。
连锁标记的开发和应用
选取30株RIL群体中极端耐贮的家系DNA等量混合组成抗池，选取30株RIL群 体中极端不耐贮的家系DNA等量混合成感池，利用BSA法建池进行标记的筛选。
选取位于一致性主效QTL区段附近和内部的SSR标记检测抗池和感池基因型， 对基因型分离情况进行χ2检测，筛选出在亲本间、抗感池间中有多态性并与QTL 连锁紧密的SSR标记。
将筛选出的分子标记在RIL群体的85个耐贮家系中进行基因型检测，根据基因 型检测结果与耐贮性表型检测之间的符合程度及χ2检验结果，筛选出耐贮性相关 连锁标记。
在2个耐贮性相关一致性QTL区段cQTL-7和cQTL-10的边界附近和内部， 选择umc1295、umc1671、phi328175、umc1367、phi054、umc1648和phi050 等共9个标记进行选择效率的检测。构建由30个RIL群体中极端耐贮家系DNA 等量混合组成的抗池，由30个RIL群体中极端不耐贮家系DNA等量混合成组 成的感池，利用上述9个SSR标记在抗感池间进行基因型检测。结果如图3-4 所示，标记umc1295、phi082、umc1367、phi054和umc2043仅在两亲本间存在 多态性，而在抗感池中无多态性；而umc1671、phi328175、phi050和umc1648 在亲本间以及抗感池间均具有多态性，亲本间多态标记的有效传递率为44.44％。 利用抗池和感池内的单株对筛选到的差异标记进行单株基因型分析，用χ2适合 性测验来评价标记与玉米种子耐贮性位点的关联性。
χ2适合性检测分析表明，标记umc1671、phi328175、phi050和umc1648与 玉米种子耐贮性主效位点具有显著的相关性(见表3-7)，χ2检测值分别为0.862、 1.690、0.133和1.286，均小于3.84(p＝0.05水平，n＝1)，可用于对玉米种子耐贮 性主效位点的筛选；而其余5个标记χ2检测值均大于3.84(p＝0.05水平)。
结合4个标记在85个耐贮家系的基因型检测结果，以及耐贮性表型检测结 果，进行符合率分析。4个标记的基因型和耐贮性表型符合率分别为83.12％、 80.82％、88.89％和82.93％，平均为83.94％，其中标记umc1648的符合率最高。 由此，本发明最终确定4个来自于亲本东156的标记umc1671、phi328175、phi050、 umc1648为玉米种子耐贮性相关连锁标记。
用开发出的4个耐贮性相关连锁标记umc1671、phi328175、umc1648和 phi050对141份美国玉米自交系进行基因型检测。4个标记单独检测为耐贮的自 交系分别有8份、13份、10份和9份。
含有7号染色体影响相对发芽势的qRGE-7的自交系有ND248、ND252、 ND246、SD65、N532、N209、Tx110、LH181、PHPR5、ICI581；含有10号染 色体影响相对活力指数的qRVI-10的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、 N532、N209、Tx110、LH192、PHJ90、3IIH6、OQ403；同时含有2个主效QTL 的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、N532、N209、Tx110。
对141份美国玉米自交系种子进行人工老化处理后检测种子耐贮性相关的 表型数据。参试材料在6个耐贮性相关指标中表现出较大的变异幅度，差异极 显著(P<0.01)；除相对幼苗长以外其他各耐贮性相关指标的变异系数均大于35％， 其中相对发芽势的变异系数最大，高达68.63％。
依据6个耐贮性相关性状指标的相对值，采用系统聚类法，将141份玉米 自交系的种子按耐贮性分成5类，根据聚类分析结果可见，第Ⅰ类耐贮性最强 的自交系包括N193、ND250、ND252等23份；第Ⅱ类耐贮性较强的自交系包 括912、W8555、N209等35份；第Ⅲ类耐贮性中等的自交系包括N544、3IIH6、 N543等32份；第Ⅳ类耐贮性较弱的自交系包括Mo48、RS710、MBWZ等33 份；第Ⅴ类耐贮性最弱的自交系包括OQ403、CQ702RC、MM402A等20份。
在耐贮性连锁标记检测中鉴定为同时含有qRGE-7、qRVI-102个主效QTL 的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、N532、N209、Tx110；其中ND248、 ND252、ND246、SD65在耐贮性表型检测中鉴定为耐贮性最强的自交系，N532、 N209、Tx110在耐贮性表型检测中鉴定为耐贮性较强。
上述试验结果证明，本发明筛选出的与位于玉米第10号染色体Bin10.03区 域内玉米种子耐储性相关主效QTL区段cQTL-10紧密连锁的SSR分子标记可 用于玉米种子耐贮新品种的选育。
附图说明
图1基于F7:8RIL群体构建的玉米遗传连锁图谱；相对发芽率：★；相对发 芽势：
RGP:★；RGE
图2玉米种子耐贮性相关指标相对值的频率分布图；(a)相对发芽率RGP；(b) 相对发芽势RGE；(c)相对发芽指数RGI；(d)相对活力指数RVI；(e)相对苗长 RSL；(f)相对简易活力指数RSVI
图3重新构建的7和10号染色体遗传连锁图谱；相对发芽率：★；相对发 芽势：
相对简易活力指数：◆
RGP:★；RGE:
图4耐贮性连锁标记的筛选；小写字母(a-i)分别表示标记：(a)：umc1295； (b)：umc1671；(c)：phi328175；(d)：phi082；(e)：umc1367；(f)：phi050； (g)：phi054；(h)：umc1648(i)：umc2043.数字(1-4)分别表示：(1)：东 237；(2)：东156；(3)：抗池；(4)：感池。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构 成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下 可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落 入本发明的保护范围。
实施例1玉米种子耐储性相关QTL的定位
1试验材料
以玉米耐贮自交系东156和不耐贮自交系东237为亲本，通过单粒传法自交 7代，获得了含有288个家系的RIL群体，用于种子耐贮性QTL分析和标记开 发。其中东156种子耐贮性强，籽粒硬粒型，在自然贮藏条件下8年发芽率仍 保持在90％以上；东237耐贮性差，籽粒半马齿型，自然条件下贮藏1年发芽 率降至80％左右。两个自交系均为东北农业大学玉米研究所选育和保存。
2试验方法
2.1基因型检测
2.1.1玉米叶片总DNA的提取
采用CTAB小量法对亲本东156、东237及288个RIL群体家系3叶1心 期的幼苗叶片总DNA进行提取，单株按顺序编号。利用紫外分光光度计进行 DNA浓度和质量的测定，稀释到25ng/μL后-20℃保存用于SSR标记分析。
2.1.2SSR引物的筛选
选取分布于玉米10条染色体上的1349个SSR标记，引物序列来源于 MaizeGDB数据库(http://www.maizegdb.org/)，进行RIL群体亲本间多态性检测， 将筛选出的多态性标记用于F7单株的基因型检测。
PCR扩增体系为：体系总量10μL，其中含有ddH2O 6μL、10×Taq Buffer 1 μL、dNTP(2.5mM/mL)0.6μL、Primer-F(20u)0.1μL、Primer-R(20u)0.1μL、 Taq(5U/μL)0.2μL、DNA(20ng/μL-50ng/μL)2μL，将所有的反应物按体系混 匀后，加入15uL矿物油覆盖，于PCR仪上进行扩增；
扩增程序为：阶段1设置94℃，5min，1次循环；阶段2设置94℃，45s， 35次循环；阶段3设置62℃，2min，35次循环；阶段4设置72℃，60s，35 次循环；阶段5设置72℃，10min，1次循环；阶段6设置8℃用于保存。
扩增产物的检测：用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物。上样量 为2.0uL PCR扩增产物，以PBR322为分子量Marker，电泳缓冲液为1×TBE， 恒定功率85W预电泳约60分钟。
硝酸银银染显影：
固定：将胶片用注射器针头划下置于大约70cm×50cm×15cm的塑料盒内， 加入1.8L的冰醋酸溶液(10％)，轻轻摇动10min。
漂洗：用2L超纯水漂洗3次，每次15s。
银染：加入1.5L新配的染色液(0.1％AgNO3)，轻轻晃动10min。
漂洗：用2L超纯水漂洗，时间不超过10s。
显影：将凝胶板放入新配的1.5L显影液(22.5gNaOH，1mL甲醛)中， 轻轻晃动，直至带纹比较清晰。
样品每个SSR位点上有三种带型，与东156一致的带型为2，与东237一致 的带型记为0，杂合型记为1，缺失记为-1，建立基因型数据库。
2.1.3种子耐贮性相关表型检测
2.1.3.1人工老化方法
取大小均匀、无破损的玉米种子用1％次氯酸钠消毒液消毒30min后，放入 小网袋内，置于水浴锅内老化45min，温度58±1℃；自来水冲洗3遍蒸馏水冲 洗3遍；室温晾干2-3d，平衡水分后进行标准发芽试验。
2.1.3.2标准发芽实验
参照《农作物种子检验规程》中GB/T3543.4-1995技术规定的方法进行标准 发芽试验，每盒50粒种子，试验设置老化处理组和对照组，每组3次重复，每 个重复50粒种子，每天记录发芽数，第4d开始计算种子发芽势，第7d结束计 算发芽率和发芽指数，然后测量幼苗长度，计算活力指数。
2.1.3.3种子耐贮相关指标的测定
测量指标包括发芽率(GE)、发芽势(GP)、发芽指数(GI)、活力指数(VI)、 幼苗长(SL)、简易活力指数(SVI)，具体检测方法根据颜启传等的《种子活力 测定的原理和方法》[67]中的测定方法，计算公式如下所示：
发芽势(GE)＝发芽试验播种第4d的发芽种子数/供试种子数×100％；
发芽率(GP)＝发芽试验播种第7d长成的正常幼苗数/供试种子数×100％；
发芽指数(GI)＝∑Gt/Dt，式中Dt为相应的发芽天数，Gt为与Dt相对应的 不同时间的发芽数；
活力指数(VI)＝GI×S，式中S为发芽试验播种第7d幼苗长度(cm)，GI 为发芽指数；
简易活力指数(SVI)＝GP×S，式中S为发芽试验播种第7d幼苗长度(cm)， GP为发芽率；
苗长(cm)SL：根尖至梢间之间，在发芽试验播种第7d，随机取各家系幼 苗10株进行测定；
为了避免家系间种子原始活力高低对耐贮性评价的影响，本研究采用各表型 性状的相对值为耐贮评价指标。各表型性状的相对值＝老化发芽试验的性状值/ 标准发芽试验的性状值，所有指标取3次重复平均值。
建立群体的耐贮性表型数据库，利用软件SPSS19.0、Microsoft Excel 2010对数据进行方差、平均值、标准差、变幅、变异系数等分析。
2.1.4玉米种子耐贮性相关QTL分析
2.1.4.1遗传连锁图谱的构建
利用Icimapping 4.1软件对SSR基因型数据库进行遗传连锁图的构建，先用“group”命令对部分标记分组，再用“order”命令确定各连锁群标记排列顺序 (LOD＝3.0)，选用“Kosambi”函数将重组值转换成图距(cM)。参考玉米SSR Bin map，用“map”指令构建遗传连锁图谱。
2.1.4.2QTL分析
结合表型数据库和基因型数据库运行Icimapping 4.1软件，采用复合区间作图法对耐贮相关性状进行QTL分析。相应的运行参数为Window size＝5.00cM，Model：ICIMADD，LOD：3.0。以LOD>3.0作为可检测QTL位点存在的阈值。
将定位到的主效QTL位点与课题组前期利用F2:3群体定位结果相对比，确定一 致性主效QTL区段。根据一致性主效QTL所在的区段增加SSR标记，采用复合区间 作图法进行玉米种子耐贮性相关QTL重定位，缩小耐贮性相关主效QTL所在区间。
3结果与分析
3.1遗传连锁图谱的构建
在MaizeGDB基因组数据库(http://www.maizegdb.org/)中选择1349个均匀分布于玉米10条染色体上的SSR标记，在东156和东237两个亲本间进行多态性检测， 共筛选出226个在亲本间存在多态性且条带清晰的引物，用于遗传连锁图谱的构建， 筛选出的引物名称、位点及序列见表1。
表1多态性SSR引物
依据226个SSR标记对RIL群体检测的基因型数据库，借助Icimapping4.1 软件构建遗传图谱(LOD＝3.0)。图中拟合226个SSR标记位点，覆盖玉米10 条染色体，全长3467.4cM，平均标记间距为15.34cM，1-10号染色体的标记 数目分别是28、30、28、28、20、20、16、20、20和16个，构建好的遗传连 锁图谱见图1。
3.2RIL群体F7:8家系种子耐贮性相关表型检测
对热水浴老化法处理后的RIL群体288个家系种子进行标准发芽试验，测 定耐贮性相关表型数据。从表2可知，参试家系在6个耐贮性相关指标中均表 现出较大的变异幅度，差异极显著(P<0.01)。除相对幼苗长以外其他各耐贮性相 关指标的变异系数均大于40％，其中相对发芽势的变异系数最大，高达57.07％。
对RIL群体的6个性状进行次数分布分析，结果如图2所示，相对发芽率、 相对发芽势、相对活力指数等6个耐贮性相关性状值均呈正态分布，适用于种 子耐贮性的表型评价。
表2 RIL群体家系耐贮性相关指标的统计分析
3.3玉米种子耐贮性相关的QTL分析
结合RIL群体基因型检测结果和种子耐贮性表型检测结果，采用复合区间 作图法进行玉米种子耐贮性相关QTL分析。如图1和表3所示，共检测到影响 相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数等6个玉米种子耐贮性相关指标的17 个QTL，分布于玉米的1、2、7、9和10号染色体上，单个QTL所解释的表型 变异从最低的2.33％到最高的20.11％。其中9个QTL的加性效应值为正值，东 156的等位基因对这些位点起到增效作用，占QTL数的52.94％；而东237的等 位基因对其余的8个QTL位点起到增效作用，占QTL总数的47.06％。
7号染色体上标记umc1295和phi082之间存在以相对发芽率、相对发芽势 和相对发芽指数为指标的3个耐贮性相关主效QTL，分别为qRGP-7、qRGE-7 和qRGI-7，表型贡献率分别为10.52％、12.23％和14.34％；10号染色体上标记 phi050和umc2043之间存在以相对发芽率、相对发芽势、相对发芽指数、相对 活力指数和相对简易活力指数为指标的5个耐贮性相关主效QTL，分别为 qRGP-10、qRGE-10、qRGI-10、qRVI-10和qRSVI-10，表型贡献率分别为12.43％、 20.11％、14.33％、10.08％和10.85％；两个耐贮性相关主效QTL区段的增效作用均来自于东156。
3.4玉米种子耐贮性相关主效QTL重定位
利用RIL群体进行的QTL定位结果与之前F2:3群体定位结果相比对，发现2 个一致性主效QTL区段，分别位于7号染色体7.05的cQTL-7和10号染色体10.03 的cQTL-10，两个区段内定位的QTL见表4。
表4两个不同群体检测到的一致性QTL
注：LOD值(LOD)：采用阈值LOD值≥3.0来判定QTL的存在；加性效应(A)：加性效应值为“+”值时， 表明东156的等位基因在该位点起增效作用；贡献率(PVE)：解释表型变异的百分数
一致性QTL区段cQTL-7和cQTL-10分别位于7号染色体umc1295和umc2333间，大小约为9.73Mb，以及10号染色体phi054和umc2043间，大小 约为93.13Mb。
在2个一致性主效QTL区段cQTL-7和cQTL-10的边界附近及内部进行SSR 标记的加密，其中7号染色体的cQTL-7区段增加9个标记，10号染色体的 cQTL-10区段增加22个标记，重新进行遗传连锁图谱的构建和QTL分析。增加 的标记名称见表5。
表5增加的分子标记
加密后SSR标记总数增加至257个，将基因型检测结果与耐贮性表型检测 结果相结合，采用复合区间作图法对耐贮性相关QTL重新进行分析，定位结果 在7和10号两条染色体上发生改变，见图3。
7号染色体上检测到4个QTL，分别为影响相对发芽率的qRGP-7、影响相 对发芽势的qRGE-7、影响相对发芽指数的qRGI-7、影响相对简易活力指数的 qRSVI-7均位于umc1671和phi328175之间，贡献率分别为11.72％、14.63％、10.04％ 和2.27％。除qRSVI-7外，其他3个QTL位点的增效作用均来自东156。该染色 体上贡献率均大于10％的3个主效QTL qRGP-7、qRGE-7和qRGI-7，被定位于 同一个标记区段(umc16171-phi328175区段)，确定该区段为耐贮性相关主效QTL 区段，其增效作用来自于东156。
10号染色体上检测到9个QTL，分别为影响相对发芽率的qRGP-10、影响 相对发芽势的qRGE-10、影响相对发芽指数的qRGI-10，均位于phi054和umc2043 之间，贡献率分别为14.19％、17.99％和18.26％，加性效应值分别为0.1466、0.1786 和0.1142；3个影响相对活力指数的qRVI-10-1、qRVI-10-2和qRVI-10-3，分别位 于标记phi050和phi054之间、phi054和umc2043之间、umc1930和umc1648 之间，贡献率分别为22.39％、12.80％和19.71％，加性效应值分别为0.1418、0.1425 和0.1381；3个影响相对简易活力指数的qRSVI-10-1、qRSVI-10-2和qRSVI-10-3， 分别位于标记phi050和phi054之间、phi054和umc2043之间、umc1930和 umc1648之间，贡献率分别为19.59％、19.78％和14.36％，加性效应值分别为 0.1567、0.1571和0.1495。这9个位点的增效作用均来自东156。
在10号染色体上贡献率均大于10％的3个主效QTL qRGP-10、qRGE-10和 qRGI-10，仍被定位于phi054-umc2043区段；2个贡献率均大于15％的主效QTL qRVI-10和qRSVI-10，被定位到umc1648-phi050区段，确定该区段为耐贮性相关 主效QTL区段，其增效作用来自于东156。
表6重定位检测到的QTLs
注：LOD值(LOD)：采用阈值LOD值≥3.0来判定QTL的存在；加性效应(A)：加性效应值为“+” 值时，表明东156的等位基因在该位点起增效作用；贡献率(PVE)：解释表型变异的百分数
3.5耐贮性相关一致性主效QTL区段的再次比对分析
将QTL重定位结果与F2:3群体定位结果重新进行一致性分析，共确定2个与 玉米种子耐贮性相关的一致性QTL区段，与之前相比区段缩小
7号染色***于标记umc1671和phi328175之间的一致性QTL主效区段 cQTL-7内，包含3个QTL qRGP-7、qRGE-7和qRGI-7，分别影响相对发芽率、 相对发芽势和相对发芽指数，表型贡献率分别为11.72％、14.63％和10.04％，区 段大小约为7.97Mb。
10号染色***于标记umc1648和phi050之间的一致性主效QTL区段 cQTL-10内，包含2个QTL qRVI-10和qRSVI-10，分别影响相对活力指数和相对 简易活力指数，表型贡献率分别为18.30％和17.91％，区段大小约为39.15Mb。
试验例1分子标记的开发和验证试验
1.试验材料
141份美国玉米自交系，东北农业大学玉米研究所2012年引自美国中北部植 物引种站(North Central Regional Plant Introduction Station)(见表7)，用于发掘 耐贮性好的玉米新种质资源。
表7 141份外引美国自交系的系谱
2.试验方法
2.1连锁标记的开发
选取30株RIL群体中极端耐贮的家系DNA等量混合组成抗池，选取30株RIL 群体中极端不耐贮的家系DNA等量混合成感池，利用BSA法建池进行标记的筛 选。
选取位于一致性主效QTL区段附近和内部的SSR标记检测抗池和感池基因型， 对基因型分离情况进行χ2检测，筛选出在亲本间、抗感池间中有多态性并与QTL 连锁紧密的SSR标记。扩增体系和方法以及扩增产物的检测如前所述。
将上述筛选出的分子标记在RIL群体的85个耐贮家系中进行基因型检测，根 据基因型检测结果与耐贮性表型检测之间的符合程度及χ2检验结果，筛选出耐贮 性相关连锁标记。
2.2分子标记在育种上的应用
2.2.1分子标记检测
CTAN小量法提取141份美国玉米自交系基因组DNA，用开发的玉米种子 耐贮性相关SSR标记进行基因型检测，筛选出含有耐贮相关主效QTL的自交系。 2.2.2人工老化法种子耐贮性表型检测和材料筛选
141份美国玉米自交系用高温高湿(HH)法进行人工老化处理。根据Zeng (2002年)利用的人工加速老化种子法并加以修改[102]，选取籽粒大小均匀、无 破损的种子用1％次氯酸钠消毒液消毒30min后，放入小网袋内；置于干燥器内 的筛网上，筛网下加水，水面与筛网面相距2cm；用凡士林密封干燥器平衡水分， 置于45℃的恒温培养箱内老化72h；种子取出后室温晾干3d，使水分降至原来 状态后进行标准发芽试验。
设置老化处理组和对照两组，每组3次重复，每次重复50粒，标准发芽试验 方法、测量指标及测量方法如前所述。
利用软件SPSS19.0、Microsoft Excel 2010对数据进行方差、平均值、标准差、 变幅、变异系数等描述性分析；采用系统分类法对141份美国玉米自交系种子耐 贮性进行聚类分析；确定耐贮美国玉米自交系，结合基因型检测结果验证开发出 的连锁标记的可用性；筛选含有耐贮性相关主效QTL，且表型鉴定为耐贮的自交 系为耐贮材料。
3.试验结果
3.1连锁标记的开发
在2个耐贮性相关一致性QTL区段cQTL-7和cQTL-10的边界附近和内部， 选择umc1295、umc1671、phi328175、umc1367、phi054、umc1648和phi050等 共9个标记进行选择效率的检测。构建由30个RIL群体中极端耐贮家系DNA 等量混合组成的抗池，由30个RIL群体中极端不耐贮家系DNA等量混合成组 成的感池，利用上述9个SSR标记在抗感池间进行基因型检测。结果如图4所 示，标记umc1295、phi082、umc1367、phi054和umc2043仅在两亲本间存在多 态性，而在抗感池中无多态性；而umc1671、phi328175、phi050和umc1648在 亲本间以及抗感池间均具有多态性，亲本间多态标记的有效传递率为44.44％。 利用抗池和感池内的单株对筛选到的差异标记进行单株基因型分析，用χ2适合 性测验来评价标记与玉米种子耐贮性位点的关联性。
χ2适合性检测分析表明，标记umc1671、phi328175、phi050和umc1648与 玉米种子耐贮性主效位点具有显著的相关性(见表22)，χ2检测值分别为0.862、 1.690、0.133和1.286，均小于3.84(p＝0.05水平，n＝1)，可用于对玉米种子耐贮 性主效位点的筛选；而其余5个标记χ2检测值均大于3.84(p＝0.05水平)。
表8耐贮性相关标记在RIL群体中的χ2检测
结合4个标记在85个耐贮家系的基因型检测结果，以及耐贮性表型检测结 果，进行符合率分析。4个标记的基因型和耐贮性表型符合率分别为83.12％、 80.82％、88.89％和82.93％，平均为83.94％(见表9)，其中标记umc1648的符 合率最高。最终确定4个来自于亲本东156的标记umc1671、phi328175、phi050、 umc1648为玉米种子耐贮性相关连锁标记。
表9各标记基因型检测与RIL群体家系表型检测的符合程度
3.2连锁标记检测
用开发出的4个耐贮性相关连锁标记umc1671、phi328175、umc1648和phi050 对141份美国玉米自交系进行基因型检测，结果见表10。4个标记单独检测为耐 贮的自交系分别有8份、13份、10份和9份。
含有7号染色体影响相对发芽势的qRGE-7的自交系有ND248、ND252、 ND246、SD65、N532、N209、Tx110、LH181、PHPR5、ICI581；含有10号染 色体影响相对活力指数的qRVI-10的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、 N532、N209、Tx110、LH192、PHJ90、3IIH6、OQ403；同时含有2个主效QTL 的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、N532、N209、Tx110。
表10含有耐贮性相关主效QTLs的美国自交系
3.3 141份美国自交系人工老化法种子耐贮性表型检测
对141份美国玉米自交系种子进行人工老化处理后检测种子耐贮性相关的表 型数据。从表11可知，参试材料在6个耐贮性相关指标中表现出较大的变异幅 度，差异极显著(P<0.01)；除相对幼苗长以外其他各耐贮性相关指标的变异系数 均大于35％，其中相对发芽势的变异系数最大，高达68.63％。
表11 141份美国玉米自交系耐贮性相关性状的相对值统计分析
依据6个耐贮性相关性状指标的相对值，采用系统聚类法，将141份玉米自 交系的种子按耐贮性分成5类，聚类分析结果见表12。第Ⅰ类耐贮性最强的自 交系包括N193、ND250、ND252等23份；第Ⅱ类耐贮性较强的自交系包括912、 W8555、N209等35份；第Ⅲ类耐贮性中等的自交系包括N544、3IIH6、N543 等32份；第Ⅳ类耐贮性较弱的自交系包括Mo48、RS710、MBWZ等33份；第 Ⅴ类耐贮性最弱的自交系包括OQ403、CQ702RC、MM402A等20份。
在耐贮性连锁标记检测中鉴定为同时含有qRGE-7、qRVI-10 2个主效QTL 的自交系有ND248、ND252、ND246、SD65、N532、N209、Tx110；其中ND248、 ND252、ND246、SD65在耐贮性表型检测中鉴定为耐贮性最强的自交系，N532、 N209、Tx110在耐贮性表型检测中鉴定为耐贮性较强。证明开发出的连锁标记可 用且这些自交系可用于玉米种子耐贮新品种的选育。
表12 141份美国玉米自交系的聚类结果
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 与玉米种子耐储性紧密连锁的SSR标记及其在分子标记辅助育种中的应用
<130> HLJ-4006-190405A
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 1
ctgcagtacg tgagcctgta cg 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 2
gcttgagctg tgaggaagtt ttg 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 3
taacatgcca gacacatacg gacag 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artifical sequence
<400> 4
atggctctag cgaagcgtag ag 22