利用宏基因组技术辅助检测食品中是否含有c2z7型转基因玉米成分的方法
阅读说明：本技术 利用宏基因组技术辅助检测食品中是否含有c2z7型转基因玉米成分的方法 (Method for detecting whether C2Z7 type transgenic corn ingredient is contained in food or not by aid of metagenome technology ) 是由 杜杰 郑帅 刘婷婷 朴春梅 谢道昕 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用宏基因组技术辅助检测食品中是否含有C2Z7型转基因玉米成分的方法。本发明从宏基因组角度出发,开发和制定适合检测食物中C2Z7型转基因玉米成分、并能辅助判断其生物安全性的技术指标。本发明的意义在于,通过宏基因组的变化,找到转有aroA基因的玉米对摄食者内环境第一道屏障,即胃肠道系统的影响,并可以为评价此类玉米对于摄食者自身的生理状态的影响(好的或者坏的)提供间接判断依据。(The invention discloses a method for detecting whether C2Z7 type transgenic corn ingredients are contained in food or not by using metagenome technology. The invention develops and formulates a technical index which is suitable for detecting C2Z7 type transgenic corn components in food and can assist in judging the biological safety of the food from the perspective of metagenome. The significance of the invention lies in that the influence of the corn with aroA gene on the first barrier of the inner environment of a food taker, namely the gastrointestinal tract system, is found through the change of the metagenome, and an indirect judgment basis can be provided for evaluating the influence (good or bad) of the corn on the physiological state of the food taker.)
技术领域
本发明涉及一种利用宏基因组技术辅助检测食品中是否含有C2Z7型(CC2型) 转基因玉米成分的方法。
背景技术
根据***公约《生物安全议定书》的定义，转基因生物称做“改性活生物体”Living Modified Organisms，简称LMOs，或者叫“遗传饰变生物”Genetically ModifiedOrganisms，GMOs。LMOs或GMOs就是指凭借现代生物技术获得的遗传材料新异组合的活生物体，实际上就是将外源DNA导入生物体基因组，从而引起改变了自然状态下的遗传组成的生物。目前与公众关系最为密切的是各类转基因作物。转基因作物，是利用基因编辑技术，在原有农作物的基因中，加入其它生物的遗传基因信息(往往是处于生殖隔离的物种，无法用普通杂交方式获得其基因信息)，从而造成品质更好、或具有原有作物所不具备的品质的作物。
自1996年转基因作物商业化以来，全球已有26个国家种植了转基因作物，截至2016年种植面积达1.851亿公顷，作物种类以转基因大豆最多，相关国家则以美国的种植面积居首位，其国内转基因农作物种类也最多。我国对于转基因作物的安全性持非常谨慎的态度，在《农业转基因生物安全管理条例(2017年10月7日修订版)》等系列文件规范的指导下，开展了转基因作物的实验研发、种植和进口工作，目前批准种植的转基因作物为转Bt基因棉花和转基因抗病毒番木瓜，正在实验状态的包括转基因玉米和水稻，批准进口用作加工原料的包括转基因大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花。
目前检测转基因作物的技术，主要是针对作物本身特有的遗传信息，开展DNA 和RNA的检测，对转基因作物安全性的评价，包括对其包含和被摄入后进入生物体的核酸、蛋白等成分的结构、生物学效应的评价。
宏基因组是与人体共生的各种微生物的基因组之合，其主要部分是肠道微生物、尤其是肠道菌群的基因组。肠道菌群是肠道内各类细菌的集合体，其数量与人体细胞数量相当。人类在漫长的进化过程中，已经与肠道菌群形成了一种共生/寄生的关系，人体免疫状态和饮食习惯能够调节菌群的构成，而菌群的结构变化和代谢功能变化又会反作用于人体的生理和疾病过程。更重要的是，饮食成分改变引起的菌群结构变化能够在一周之内得以观察到。因此，从肠道菌群宏基因组角度入手，评估含有转基因玉米成分的饮食对于宏基因组的影响，可以建立比较灵敏和精确的检测指标，并可以辅助预测其对于宿主健康的影响。
C2Z7型转基因玉米，又叫CC2型，是在Z580型玉米的基础上，转入外源蛋白 aroA(即抗草甘膦，除草剂)的基因，该基因编码的草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用，且易于被微生物分解，在土壤中无残毒。玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制，因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最终达到增产增收的目的。此类基因及表达相应蛋白的玉米直接摄入人体后，是否会产生危害，目前尚需做全面深入的评估。目前已经商业化的检测手段，一般是使用酶联免疫反应试剂盒，从玉米种子中检测其蛋白成分，但无法判断其作为食物的生物学效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用宏基因组技术辅助检测食品中是否含有C2Z7型(CC2型)转基因玉米成分的方法。
本发明首先保护用于检测下表所示基因和菌种丰度的物质在辅助检测食品中是否含有C2Z7型转基因玉米中的应用；
本发明还保护辅助检测食品中是否含有C2Z7型转基因玉米的产品，包括用于检测下表所示基因和菌种丰度的物质；
本发明还保护一种辅助检测食品中是否含有C2Z7型转基因玉米的方法，包括如下步骤：
(1)对小鼠分别喂食普通饲料和待测饲料；所述待测饲料为待测食品与普通饲料的混合物；
(2)所述步骤(1)进行10周后，提取小鼠粪便的总DNA，进行高通量测序；
(3)对测序结果进行分析，得到样本特定基因和菌种丰度数值，按照下表所示标准范围进行判断；如果下表中所列标准范围均满足，则待测食品中含有或可能含有 C2Z7型转基因玉米；反之，待测食品中不含有C2Z7型转基因玉米；
所述特定基因和菌种及标准丰度范围为下表所示的基因和菌种及数值；
表
表
所述待测饲料为1体积份待测食品与3体积份普通饲料的混合物。
所述普通饲料具体可为北京华阜康生物科技股份有限公司的大小鼠饲料，产品编号：1032。
所述测序结果分析方法如下：
(1)对测序数据进行质控过滤；
(2)完成步骤(1)后，将过滤后得到的有效数据进一步使用SOAP denovo软件进行组装，得到Scaffolds序列；
(3)完成步骤(2)后，将Scaffolds序列从N连接处打断，得到不含N的Scaftigs 序列，过滤掉500bp以下的片段，余下的Scaftigs序列片段进一步用MetaGeneMark 软件进行开放阅读框预测和过滤，并用CD-HIT软件进行去冗余；
(4)完成步骤(3)后，以去冗余得到的代表性片段为基准，用有效数据结果去比对，获得各基因片段在各样本中的reads数，然后过滤掉reads数不超过2个的基因片段，余下的Clean Data片段，组成Unigenes列表，用于计算基因丰度等信息，并比对KEGG数据库，进行代谢通路的功能注释和丰度分析；
(5)完成步骤(4)后，采用DIAMOND软件，将Unigenes比对到NCBI的Microbe NR数据库，然后选取evalue≤最小evalue*10的比对结果，应用MEGAN软件的 LCA算法，对各序列进行物种注释，结合Unigenes丰度，获得各样本在各种属层级上的丰度信息和基因数目信息。
对测序数据进行质控过滤的步骤包括去除如下reads的步骤：
(a1)小于40bp的reads，N碱基含量超过10bp的reads；
(a2)与测序接头序列overlap超过15bp的reads；
(a3)源自小鼠(宿主)的reads。
所述测序平台具体可为Illumina Novaseq6000高通量测序平台。
所述小鼠具体可为BALB/C-Tg(NFκB-RE-luc)-Xen小鼠。
本发明还保护记载有以上任一所述方法的载体在辅助检测食品中是否含有C2Z7型转基因玉米中的应用。
本发明还保护记载有以上任一所述方法的载体在制备用于辅助检测食品中是否含有C2Z7型转基因玉米的产品中的应用。
本发明还保护以上任一所示的菌种和基因作为标志物在辅助检测食品中是否含有 C2Z7型转基因玉米中的应用。
本发明从宏基因组角度出发，开发和制定适合检测食物中C2Z7型转基因玉米成分、并能辅助判断其生物安全性的技术指标。本发明的意义在于，通过宏基因组的变化，找到转有aroA基因的玉米对摄食者内环境第一道屏障，即胃肠道系统的影响，并可以为评价此类玉米对于摄食者自身的生理状态的影响(好的或者坏的)提供间接判断依据。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
7610玉米品系(76-100型)是以PHBA6玉米为父本，以昌7-2型玉米为母本，杂交获得的品系。PHBA6玉米是由美国先锋公司(Pioneer Hi-Bred International,Inc.)培育的品种，其父本为PHZ51型玉米，母本为PHG47型玉米，记载于文献(具体记载于文献补充材料列表)：Schaefer C M,Bernardo R.Population structure and SNP diversity ofhistorical Minnesota maize inbreds[J].Crop Sci.53:1529–1536。Agronomy Org.。昌7-2 型玉米记载于文献：张文英,华福平,申为民,et al.优良玉米自交系昌7—2的选育及其利用[J].河南职业技术师范学院学报,2001(4):17-19.；上述材料公众可以从北京市心肺血管疾病研究所获得。
Z580型(郑58)玉米：记载于文献：张发林.玉米优良自交系郑58的育成和应用[J].作物杂志,2001(4):31-31.；公众可以从北京市心肺血管疾病研究所获得。
52C7型(Bt506)玉米：记载于农业农村部公告第111号-7-2018：转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米Bt506及其衍生品种定性PCR方法；公众可以从北京市心肺血管疾病研究所获得。
C2Z7型(CC-2)玉米：记载文献：宋新元，武奉慈，刘金文等.转基因抗除草剂玉米CC-2生存竞争能力研究.作物杂志，2014，6:64-66；公众可以从北京市心肺血管疾病研究所获得。
本发明使用普通清洁级8周龄雌性BALB/c背景的NF-κB反应元件-荧光素酶转基因小鼠(BALB/C-Tg(NFκB-RE-luc)-Xen，美国Caliper Life Sciences公司)作为实验小鼠，购自南京大学模式动物研究所。
实施例1、C2Z7型转基因玉米检测方法的建立
1、实验小鼠以12小时明-暗循环饲养条件，先使用普通饲料同笼喂养1周，以确保小鼠适应饲养环境，并达到相似的肠道菌群基础水平。之后将小鼠随机分为如下5 组(每组至少5只，每组进行两个批次的实验)，持续喂养不同饲料10周。
普通饲料组：喂食正常小鼠饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司的大小鼠饲料，产品编号：1032)。
含有普通玉米7610成分的饲料组：喂食混合饲料(将1体积份7610玉米的粉末和3体积份正常小鼠饲料混合)。
含有普通玉米Z580成分的饲料组：喂食混合饲料(将1体积份Z580玉米的粉末和3体积份正常小鼠饲料混合)。
含有转基因玉米C2Z7成分的饲料组：喂食混合饲料(将1体积份转基因玉米C2Z7的粉末和3体积份正常小鼠饲料混合)。
含有转基因玉米52C7成分的饲料组：喂食混合饲料(将1体积份转基因玉米52C7的粉末和3体积份正常小鼠饲料混合)。
正常小鼠饲料成分见表1。四种玉米材料主要营养成分信息见表2。
表1正常小鼠饲料成分
表2四种品系玉米的主要营养成分含量
2、完成步骤1后，采集小鼠的新鲜粪便样本。粪便样本采集使用常规抓取小鼠后按摩腹部的方法，在洁净台中采集新鲜粪便颗粒到无菌Ep管中，采集后即刻冰浴，然后转入-80℃冰箱中待用。每只小鼠至少采集0.2g粪便颗粒，一次采集不足量者，通过在同一天的多个时间点反复采集达到总采集量。
3、完成步骤2后，提取粪便的总DNA。粪便DNA的提取使用北京康为世纪生物科技有限公司的粪便样本DNA提取试剂盒(CW2092)，每次提取200mg左右粪便样本中的总DNA，提取步骤按照试剂盒的说明书进行。获得的DNA溶液使用 NanoDrop2000分光光度计检测浓度和OD值，并用2μL DNA样本跑1％琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA质量。若DNA溶液的浓度大于5μg/mL(总量至少有0.1μg)，OD 260/280值在1.8–2.0之间，且凝胶电泳成像上没有明显的DNA降解碎片，则该样本为合格样本，保存在-80℃冰箱直至测序。不合格的样本重新进行DNA提取。
4、建库和测序
质量合格的DNA样本使用Illumina Novaseq6000高通量测序平台进行测序，按照其标准化程序进行，即：用Covaris超声波破碎仪将DNA样本随机打断成长度约为350 bp的片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备(文库构建采用
5、原始数据分析
(1)对下机数据进行质控过滤，去除如下reads：
①小于40bp的reads，N碱基含量超过10bp的reads；
②与测序接头序列overlap超过15bp的reads；
③源自小鼠(宿主)的reads(采用Bowtie2软件比对小鼠数据库)。
最终得到有效数据(Clean Data)。
(2)过滤后的Clean Data，进一步使用SOAP denovo软件进行组装(K-mer设定为55)，得到Scaffolds序列。
(3)将Scaffolds序列从N连接处打断，得到不含N的Scaftigs序列(各样本的Clean Data序列用Bowtie2软件比对至该Scaftigs序列，找出未被利用上的reads，将这些reads进行混合组装，然后再进一步获得相应的Scaftigs序列)，过滤掉500bp以下的片段，余下的Scaftigs序列片段进一步用MetaGeneMark软件进行Open Reading Frame预测和过滤，并用CD-HIT软件进行去冗余。
(4)以去冗余得到的代表性片段为基准，用Clean Data结果去比对，获得各基因片段在各样本中的reads数，然后过滤掉reads数不超过2个的基因片段，余下的Clean Data片段，组成Unigenes列表，用于计算基因丰度等信息，并比对KEGG数据库，进行代谢通路的功能注释和丰度分析。
(5)进一步采用DIAMOND软件，将Unigenes比对到NCBI的Microbe NR数据库，然后选取evalue≤最小evalue*10的比对结果，应用MEGAN软件的LCA算法，对各序列进行物种注释，结合Unigenes丰度，获得各样本在各种属层级上的丰度信息和基因数目信息，并作进一步统计分析。
6、统计和筛选出C2Z7型转基因玉米食物成分特异性菌种指标和宏基因指标
(1)基于Unigenes列表中各基因在各样品中的丰度信息，以及各样本在细菌分类各层级上的丰度，进行进行Metastat统计分析(以P<0.05作为统计学显著性，以 q<0.05进行校正筛选)，找出每种玉米成分饮食相比正常小鼠饲料造成的有显著丰度变化的基因和菌种。
(2)先将两批小鼠样本的测序结果合并起来，根据喂食分组进行统计，再进一步按批次、根据喂食分组分别做统计，最后将三次统计结果汇总取交集，保留每种玉米在每次统计结果中相比正常小鼠饲料组都有显著性变化、且变化趋势一致(均比正常饮食组升高、或均降低)的基因和菌种。
(3)横向比较四种玉米成分饮食相比正常小鼠饲料造成的显著变化基因/菌种，将其中只在C2Z7型转基因玉米成分饮食组显著升高/降低的基因和菌种，作为检测食物中含有C2Z7型转基因玉米成分的宏基因指标，具体的基因/菌种丰度范围及相对正常小鼠饲料的变化趋势见表3和表4。在应用这些指标时，分别给予前述小鼠品系喂养正常小鼠饲料和待测食物成分饲料，在前述时间段后取材检测宏基因组，若获得的基因和菌种变化趋势及丰度范围符合表3和表4的所有指标，则可以认为待测食物成分饲料中含有C2Z7型转基因玉米。
表3菌种指标
表4宏基因组指标
