阅读说明：本技术 一种引物组、探针、rpa试纸条试剂盒、鉴别方法 (Primer group, probe, RPA test strip kit and identification method ) 是由 沈永义 彭金玉 陈瑞爱 沈雪娟 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于病毒株鉴别方法技术领域,具体为一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物组和探针,包括第一引物组和第一探针；所述第一引物组中的上游引物如序列SEQ ID NO：1所示；所述第一引物组中的下游引物为5’端带有生物素的如序列SEQ ID NO：2所示的DNA分子；所述第一探针为5’端带有羧基荧光素、3’端带有C3-spacer基团的如序列SEQ ID NO：3所示的DNA分子。同时,还提供了一种用于检测MGF360-505R基因缺失株的引物组和探针；该引物组和探针组特异性强、灵敏度高,同时,本发明还提出了基于RPA-LFD技术和上述引物组和探针组的RPA试纸条试剂盒和鉴别方法。(The invention belongs to the technical field of virus strain identification methods, and particularly relates to a primer group and a probe for detecting a wild strain of African swine fever virus, which comprise a first primer group and a first probe; the upstream primer in the first primer group is shown as a sequence SEQ ID NO: 1 is shown in the specification; the downstream primer in the first primer group is a primer with biotin at the 5' end and shown as a sequence SEQ ID NO: 2; the first probe is a probe which is provided with carboxyfluorescein at the 5 'end and C3-spacer group at the 3' end and has a sequence shown in SEQ ID NO: 3. Meanwhile, a primer group and a probe for detecting MGF360-505R gene deletion strains are also provided; the primer group and the probe group have strong specificity and high sensitivity, and simultaneously, the invention also provides an RPA test strip kit and an identification method based on the RPA-LFD technology and the primer group and the probe group.)

一种引物组、探针、RPA试纸条试剂盒、鉴别方法

技术领域

本发明涉及病毒株鉴别方法技术领域，具体为一种引物组、探针、RPA试纸条试剂盒、鉴别方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)引起的家猪和野猪的一种急性、高度接触性传染病，临床以高热、食欲废绝、皮肤和内脏器官出血为主要特征，一般发病后2～10d死亡，严重时死亡率可达100％。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求必须报告的A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。非洲猪瘟在非洲、欧洲和美洲的数十个国家流行，造成巨大的经济损失且已蔓延至与欧洲接壤的多个亚洲国家。

从2018年第一例非洲猪瘟在我国爆发来，非洲猪瘟对我国养猪业造成重大的损失，严重影响我国的养猪业的健康发展。国内外研究表明非洲猪瘟病毒MGF360-505R基因敲除后，可以显著降低病毒毒性，敲除这两个基因的非洲猪瘟活病毒有望成为疫苗。目前CN201910348878.7和CN 201910700685.3分别公开了可作为疫苗的基因缺失减毒非洲猪瘟病毒及疫苗以及构建方法，经基因工程技术，将非洲猪瘟病毒的毒力基因缺失，获得MGF360-505R缺失和CD2V与MGF360-505R联合缺失的基因缺失病毒。经实验表明所述两种毒株均能提供对非洲猪瘟中国流行强毒株的100％免疫保护，可作为安全和有效的防控中国非洲猪瘟疫情的疫苗，具有极大的社会价值。但该疫苗的使用会导致常规方法检测非洲猪瘟病毒结果钧为阳性，无法区分野毒感染致阳性，还是疫苗接种导致阳性。

目前，ASF诊断方法有直接免疫荧光实验、间接免疫荧光实验、检测病毒核酸等方法。其中核酸检测方法因简单的操作和高度的敏感性而被广泛应用。相对于这些常用的检测技术，重组酶聚合酶扩增(RPA)技术可以在更短的时间内，准确的检测出ASFV。RPA技术主要依赖于三种酶：重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白和DNA聚合酶。整个RPA反应过程进行非常快，一般在恒定37℃反应20分钟即可扩增大量目的产物。RPA反应产物可通过测流免疫试纸条(LFD)进行快速检测。RPA-LFD技术具有特异性强、操作过程简单、无初始加热步骤、灵敏度高、检测快速等优点，为野外田间非洲猪瘟的检测提供了一种可能。

所以本申请所要解决的技术问题是：如何提出一种基于RPA-LFD技术的鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的引物组、探针、RPA试纸条试剂盒、鉴别方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的RPA检测引物组和探针组，该引物组和探针组特异性强、灵敏度高，同时，本发明还提出了基于RPA-LFD技术和上述引物组和探针组的RPA试纸条试剂盒和鉴别方法。

在不做特殊说明的情况下，本发明的％、份均为重量百分比和重量份，M代表mol/L。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于检测非洲猪瘟病毒野毒株的引物组和探针，包括第一引物组和第一探针；

所述第一引物组中的上游引物如序列SEQ ID NO：1所示，该上游引物我们命名为：ASFV-MGF360-505R-F1；

ASFV-MGF360-505R-F1：5’TGTGCTATTGCCCATAAGGATCTACATCTAT3’(SEQ ID NO：1)；

所述第一引物组中的下游引物为5’端带有生物素的如序列SEQ ID NO：2所示的DNA分子；该下游引物我们命名为：ASFV-MGF360-505R-R1；

ASFV-MGF360-505R-R1：5’Biotin-CATACTCAGAATGCCTATTATATTTGTTGAATTG 3’(SEQ ID NO：2)；

所述第一探针为5’端带有羧基荧光素、3’端带有C3-spacer基团的如序列SEQ IDNO：3所示的DNA分子。该探针我们命名为ASFV-MGF360-505R-P1；

ASFV-MGF360-505R-P1：5’[FAM]TAACAGAATCGTACCCGATAAGTATCATCA[THF]TTTAGATATTCGCAT[C3-spacer]3’(SEQ ID NO：3)；

其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，C3-spacer指的是3个亚甲基，用于阻止链的延伸。

同时，本发明提供一种用于检测MGF360-505R基因缺失株的引物组和探针，包括第二引物组和第二探针；

所述第二引物组中的上游引物如序列SEQ ID NO：4所示；该上游引物我们命名为ASFV-MGF360-505RQS-F2；

ASFV-MGF360-505RQS-F2：5’TATTTAATCATTTAGAGAAGGTCATCATAGGAG 3’(SEQ IDNO：4)；

所述第二引物组中的下游引物为5’端带有生物素的如序列SEQ ID NO：5所示的DNA分子；该下游引物我们命名为ASFV-MGF360-505RQS-R2；

ASFV-MGF360-505RQS-R2：5’Biotin-CAGGATACGATTCACTACAATAGTGAGTAC 3’(SEQID NO：5)；

所述第二探针为5’端带有羧基荧光素、3’端带有C3-spacer基团的如序列SEQ IDNO：6所示的DNA分子；该第二探针我们命名为ASFV-MGF360-505RQS-P2；

ASFV-MGF360-505RQS-P2:5’[FAM]TTCAACGAGCAGGAAACAACTGTGTGCTTA[THF]TACAGCAACATACCC[C3-space r]3’(SEQ ID NO：6)。

其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，C3-spacer指的是3个亚甲基，用于阻止链的延伸。

同时，本发明提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的RPA试纸条试剂盒，所述试剂盒含有：

第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针；

所述第一引物组中的上游引物如序列SEQ ID NO：1所示；

所述第一引物组中的下游引物为5’端带有生物素的如序列SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

所述第一探针为5’端带有羧基荧光素、3’端带有C3-spacer基团的如序列SEQ IDNO：3所示的DNA分子；

所述第二引物组中的上游引物如序列SEQ ID NO：4所示；

所述第二引物组中的下游引物为5’端带有生物素的如序列SEQ ID NO：5所示的DNA分子；

所述第二探针为5’端带有羧基荧光素、3’端带有C3-spacer基团的如序列SEQ IDNO：6所示的DNA分子。

此外，本试剂盒还包括：阳性对照品和阴性对照品；

优选地，所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒MGF360-505R基因的质粒DNA；所述阴性对照品为去离子水。

在上述的区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的RPA试纸条试剂盒中，还包括DNA提取试剂、RPA扩增试剂和侧向流动试纸条。

在上述的区分非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的RPA试纸条试剂盒中，还包括醋酸镁、ddH₂O、5×Extration Buffer。

最后，本发明还提供一种RPA-LFD技术鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与MGF360-505R基因缺失株的快速区分方法，包括如下步骤：

S1：从样品中提取病毒DNA；

S2：将提取的病毒DNA分别用如权利要求3所述第一引物组和第一探针、第二引物组和第二探针置于RPA反应体系中进行RPA反应，分别获得扩增产物A1和A2

S3.分别将步骤S2中的扩增产物A1和A2与所述5×Extration Buffer充分反应，获得产物B1和B2；

S4.分别将步骤3中的产物B1和B2滴加至如权利要求3所述侧向流动试纸条的加样孔(P1和P2试纸条)，进行LFD反应，观察结果，确定病毒类型。

将扩增产物B1和B2分别滴加至试纸条的加样孔上，检测结果如下：

1)当P1试纸条检测区显色，且质控区也显色；P2的检测区显色，且质控区也显色，则待测样品中的病毒为野毒株与MGF360-505R基因缺失株的混合感染；

2)当P1试纸条检测区显色，且质控区也显色；P2的检测区不显色，且质控区显色，则待测样品中的病毒为野毒株感染；

3)当P1试纸条检测区不显色，且质控区显色；P2的检测区显色，且质控区也显色，则待测样品中的病毒为MGF360-505R基因缺失株；

4)当P1试纸条检测区不显色，且质控区显色；P2的检测区不显色，且质控区显色，则待测样品中没有病毒。

5)当质控区不显色，则试纸条无效，需要用新的试纸条重新测定。

在上述的方法中，步骤S2具体为：

取第一引物组中的上游引物、下游引物各2.1μL，上游引物、下游引物的浓度为10μmol/L；浓度为10μmol/L的第一探针0.6μL，Rehydration Buffer 29.5μL，RNase Inhibitor的ddH2O 12.2μL，DNA模板1μL，混合后加入RPA酶管中震荡混匀，再加入2.5μL的乙酸镁，起始反应得到扩增产物A1；

取第二引物组中的上游引物、下游引物各2.1μL，上游引物、下游引物的浓度为10μmol/L；浓度为10μmol/L的第二探针0.6μL，Rehydration Buffer 29.5μL，RNase Inhibitor的ddH2O 12.2μL，DNA模板1μL，混合后加入RPA酶管中震荡混匀，再加入2.5μL的乙酸镁，起始反应得到扩增产物A2。

在上述的方法中，所述步骤S3中，扩增产物A1和扩增产物A2的体积为10μL；5×Extration Buffer为80μL。

在上述的方法中，所述步骤S4中，产物B1和B2的体积为75μL，加样至加样孔中至少5min后读取结果。

在上述的方法中，所述步骤S4中，所述RPA酶管包含有重组酶uvs X、单链结合蛋白和DNA聚合酶；步骤S2所述的RPA反应条件为：将反应体系置于37℃水浴锅中反应20min，不需要经过高温变性、退火、延伸。。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.重组酶聚合酶扩增反应(RPA)，是使用特定的引物对与探针在恒温条件下对目的片段进行扩增。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。测流免疫试纸条技术(LFD)，是对RPA扩增产物进行试纸条检测，几分钟内即可观察扩增产物在侧流试纸条上的检测结果，不需复杂仪器设备，适合现场快速检测。

2.本项目通过巧妙设计引物与探针的区域，不仅可以简便迅速的鉴别检测的样品是否有非洲猪瘟病毒感染，以及感染的毒株是否有基因缺失，还能判断是否有野毒株和基因缺失株的混合感染，并且通过试纸条检测，裸眼即可观察结果。

3.本发明具有操作简单、特异性强、灵敏度高等优势，仅对非洲猪瘟病毒(ASFV)的DNA产生特异性的扩增反应，对猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)的核酸等均无扩增反应。

4.本发明为我国非洲猪瘟病毒的检测提供了新手段，该试剂盒临床应用操作便捷，实用性强，可用于生产实践中非洲猪瘟病毒的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化，也可用于专业实验室对非洲猪瘟病毒株的快速鉴定，可为提升我国非洲猪瘟的综合防控水平提供技术支撑。

附图说明

图1为实施例2的非洲猪瘟病毒(ASFV)RPA-LFD试验结果。

图2为实施例2的非洲猪瘟病毒(ASFV)RPA产物电泳验证试验结果。

图3为实施例3的非洲猪瘟病毒(ASFV)RPA-LFD特异性试验结果。

图4为实施例3的非洲猪瘟病毒(ASFV)RPA产物特异性的电泳试验结果。

图5为实施例4的非洲猪瘟病毒(ASFV)RPA-LFD敏感性试验结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

引物设计

经过大量对比NCBI(美国国立生物信息中心)的GenBanK数据库中已公布的非洲猪瘟病毒MK333180.1(ASFV)的360-505R基因及其前后部分序列高度保守且具有特异性区域，设计ASFV 360-505R基因、ASFV 360-505R基因前后250bp为特异性引物对和探针组。

由此来提供了一种鉴别ASFV野生型毒株和360-505R基因缺失毒株的RPA引物与探针，具体为：

用于检测野毒株的引物组与探针1：

引物组1：

ASFV-MGF360-505R-F1：5’TGTGCTATTGCCCATAAGGATCTACATCTAT3’(SEQ ID NO：1)；

ASFV-MGF360-505R-R1：5’Biotin-CATACTCAGAATGCCTATTATATTTGTTGAATTG 3’(SEQ ID NO：2)；

探针1：

ASFV-MGF360-505R-P1:5’[FAM]TAACAGAATCGTACCCGATAAGTATCATCA[THF]TTTAGATATTCGCAT[C3-spacer]3’(SEQ ID NO：3)；

用于检测MGF360-505R基因缺失株的引物组与探针2：

引物组2：

ASFV-MGF360-505RQS-F2：5’TATTTAATCATTTAGAGAAGGTCATCATAGGAG 3’(SEQ IDNO：4)；

ASFV-MGF360-505RQS-R2：5’Biotin-CAGGATACGATTCACTACAATAGTGAGTAC 3’(SEQID NO：5)；

探针2：

ASFV-MGF360-505RQS-P2:5’[FAM]TTCAACGAGCAGGAAACAACTGTGTGCTTA[TH F]TACAGCAACATACCC[C3-spacer]3’(SEQ ID NO：6)。

其中，biotin表示生物素，FAM表示羧基荧光素，THF表示四氢呋喃连接子，C3-spacer指的是3个亚甲基，用于阻止链的延伸。

引物组和探针1通过RPA方法扩增ASFV野毒株的360-505R片段，片段长度分别为437bp、381bp。

引物组和探针1通过RPA方法扩增MGF360-505R基因缺失株，不能扩增出目的片段。

引物组和探针2通过RPA方法扩增MGF360-505R基因缺失株，片段长度分别为415bp、263bp。

引物组和探针2通过RPA方法扩增ASFV野毒株的360-505R基因，不能扩增出目的片段。

实施例2

RPA-LFD检测方法

材料与方法

1.1实施例1中引物

1.2样品DNA提取

对DNA提取没有特殊要求，可按常规方法或者DNA提取试剂盒提取。提取的DNA置-20℃保存备用或立即用于RPA扩增。

1.3阳性质粒

以GenBanK数据库中已公布的ASFV的缺失360-505R基因的部分序列人工合成基因，与pUC57载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含50mg/L硫酸卡纳霉素的LB培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒，将阳性的质粒命名pUC57-360-505RQS。

人工比对已公布的360-505R基因及其两侧的部分序列后设计引物ASFV-360-505R-F1/R1扩增包含360-505R基因的一段序列，与pJET1.2克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒，将阳性的质粒分别命名为pJET1.2-360-505R。

1.4 RPA-LFD实验

按照以下步骤进行RPA-LFD实验

S1.按照核酸提取试剂盒说明书从样品中提取病毒核酸；

S2.以核酸为模板，用实施例1所述的引物组1和2以及探针1和2分别对样品进行RPA反应，获得扩增产物；采用50μL反应体系：上、下游引物(10μmol/L)各2.1μL，RPA探针(10μmol/L)0.6μL，Rehydration Buffer 29.5μL，RNase Inhibitor的ddH2O 12.2μL，DNA模板1μL，混合后加入RPA酶管中震荡混匀，再加入2.5μL的乙酸镁，起始反应。其中，RPA酶管中包含有重组酶uvs X、单链结合蛋白和DNA聚合酶。RPA扩增反应的反应条件为：37℃加热器中反应20min。

S3.将S2扩增反应的两个产物与权利要求5中所述5×Extration Buffer充分反应。所述的反应体系包括：10μL扩增产物，80μL的5×Extration Buffer，充分混匀。

S4.将S3中的两个产物滴加至侧向流动试纸条加样孔，观察结果，确定病毒类型。所述反应体系为：75μL滴加至侧流试纸反应孔中，进行LFD检测，5min内读取结果。

按照上述方法对构建的阳性质粒样品进行检测。C表示质控带；T表示检测带。1：引物组和探针1+阴性对照；2：引物组和探针1+待测样品；3：引物组和探针2+待测样品；4：引物组和探针2+阴性对照。

图1-(a)待测样品为无基因缺失的野毒株；

图1-(b)待测样品为360-505R基因缺失；

图1-(c)待测样品为360-505R基因缺失株和野毒株混合。

实验结果见附图1-(a)、1-(b)、1-(c)。

1.5 RPA反应产物的核酸电泳验证实验

按照以下步骤进行RPA电泳实验

S1.将1.4中S2的RPA扩增产物按照体积比1：1加入酚氯仿溶液(酚:氯仿:异丙醇体积比25:24:1)进行纯化，以12000rmp/min的转速离心8min，取上清。

S2.取10μL步骤S1的上清液，加入1μL10xloading buffer混合后点样于2％的琼脂糖凝胶孔中，以120V电压于1×TAE电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。

实验结果如图2；注：M：DL2000 Maker；1：引物组和探针1+阴性对照；2：引物组和探针1+待测样品；3：引物组和探针2+待测样品；4：引物组和探针2+阴性对照。

图2-(a)待测样品为无基因缺失的野毒株；图2-(b)待测样品为360-505R基因缺失；图2-(c)待测样品为360-505R基因缺失株和野毒株混合。

RPA电泳验证结果与RPA-LFD实验结果一致。

实施例3

特异性试验

按照实施例2中1.4建立的RPA-LFD检测方法对1：360-505R基因阳性质粒；2：猪瘟病毒(CSFV)；3：猪伪狂犬病毒(PRV)；4：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；5：猪细小病毒(PPV)；6：阴性对照(去离子水)进行检测。

C表示质控带；T表示检测带。结果如附图3所示。

按照实施例2中1.5建立的核酸凝胶电泳方法对RPA产物进行鉴定。注：1：360-505R基因阳性质粒；2：猪瘟病毒(CSFV)；3：猪伪狂犬病毒(PRV)；4：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；5：猪细小病毒(PPV)；6：阴性对照(去离子水)。

C表示质控带；T表示检测带。结果如附图4所示。

从附图3、图4中可以看出，对应的360-505R基因阳性质粒试纸条检测为阳性，且该泳道在对应的片段大小的位置都能看到清晰的条带；而其他猪常见传染病，比如2：猪瘟病毒(CSFV)；3：猪伪狂犬病毒(PRV)；4：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)；5：猪细小病毒(PPV)；以及6：阴性对照(去离子水)对应的试纸条检测为阴性，且对应的泳道都没有显示出条带。说明该检测方法具有较好的特异性。

实施例4

敏感性试验

将阳性模板pJET1.2-360-505R稀释成10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶拷贝/μL等7个浓度梯度。

按照实施例2中1.4建立的RPA-LFD方法对上述不同模板浓度进行检测。结果如附图5所示。从附图5中可以看出，阴性对照(去离子水)、10⁰的试纸条仅质控带显色，检测带不显色；10¹-10⁶拷贝的试纸条检测带和质控带均显色，说明该方法的敏感性可达到10¹拷贝/μL。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

序列表

<110> 华南农业大学

肇庆大华农生物药品有限公司

<120> 一种引物组、探针、RPA试纸条试剂盒、鉴别方法

<141> 2019-11-18

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tgtgctattg cccataagga tctacatcta t 31

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

catactcaga atgcctatta tatttgttga attg 34

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

taacagaatc gtacccgata agtatcatca tttagatatt cgcat 45

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tatttaatca tttagagaag gtcatcatag gag 33

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

caggatacga ttcactacaa tagtgagtac 30

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttcaacgagc aggaaacaac tgtgtgctta tacagcaaca taccc 45