一种检测诊断角膜营养不良致病基因的dna文库及其应用
阅读说明：本技术 一种检测诊断角膜营养不良致病基因的dna文库及其应用 (DNA library for detecting and diagnosing corneal dystrophy disease-causing gene and application thereof ) 是由 王开宇 赵烨 陈志伟 于 2019-10-22 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种检测诊断角膜营养不良致病基因的DNA文库及其应用,该文库包括24个角膜营养不良相关的致病基因,本发明优选24个角膜营养不良致病基因,设计探针池,建立针对24个角膜营养不良致病基因的目标区域文库,文库利用高通量测序技术进行测序,寻找致病突变,为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点,本发明涉及的24个基因检测区域能够检测包括上皮和上皮下角膜营养不良、前弹力层角膜营养不良、基质角膜营养不良、后弹力层及角膜内皮营养不良等多种常见角膜营养不良,对角膜营养不良的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。(The invention relates to a DNA library for detecting and diagnosing corneal dystrophy disease-causing genes and application thereof, wherein the library comprises 24 corneal dystrophy related disease-causing genes, the 24 corneal dystrophy disease-causing genes are preferably selected, a probe pool is designed, a target region library aiming at the 24 corneal dystrophy disease-causing genes is established, the library is sequenced by using a high-throughput sequencing technology, and disease-causing mutation is searched for, so that genetic and molecular biological bases are provided for clinical diagnosis. The 24 gene detection regions can detect various common corneal dystrophies including epithelial and sub-epithelial corneal dystrophy, anterior elastic layer corneal dystrophy, stromal corneal dystrophy, posterior elastic layer and corneal endothelial dystrophy, and have important significance and clinical value for diagnosis and differential diagnosis of corneal dystrophy.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种通过靶向高通量测序技术检测诊断角膜营养不良致病基因的DNA文库及其应用。
背景技术
角膜营养不良是一组具有遗传异质性的进行性角膜透明度丧失和视力下降的角膜病变的总称。该病多为染色体显性遗传，起病大多于20岁以前，双眼对称，病程缓慢，晚期病变累及全层角膜时，患者视力可完全丧失。目前该病无特效治疗药物，视力受严重影响者仅可通过角膜移植手术治疗或激光治疗，但术后仍可复发。
绝大多数角膜营养不良的病理学和形态组织学特征为异常物质在双眼角膜不同层的沉积，因此角膜营养不良的分型一直是根据裂隙灯下观察到沉淀物的形态、受累角膜层及组织病理学特征来确定的。随着认识的深入和分子遗传学特征的进展，和角膜营养不良相关的多个基因先后被发现。以形态学为基础来分类的不足逐渐显露出来，例如，同一基因突变所致的角膜营养不良会有不同表型，而不同的基因缺陷也可以导致同样的临床表现。2008年国际角膜营养不良分类委员会公布了新的角膜营养不良的分类，在之前解剖学分类的基础上，补充了相关的遗传学、临床和病理学特征的内容。另外，角膜营养不良致病基因的确定，为了解发病机制及探索新的治疗方法提供了理论依据。因此，全面、快速、准确地筛查致病基因是角膜营养不良精确诊断、预后判断、家庭咨询计划制定、个性化治疗的必须前提条件。
临床上现有的角膜营养不良的常规诊断技术主要是裂隙灯检查。但是，裂隙灯检查对早期病变灵敏度差，并且部分患者的临床表现不典型，更不能在尚未表现出临床症状的情况下对患者进行诊断。因此，目前仅结合临床症状、裂隙灯检查不能把各种角膜营养不良精准地区分开来。特别是一些以角膜营养不良为表型之一的临床综合征，在未出现眼部临床表现前，很容易漏诊和误诊。因此基因诊断已成为解决该难题的唯一办法。目前，临床实验室检测基因突变大多采用传统的Sanger测序法，而如果对角膜营养不良相关的众多基因同时检测，不仅工作量巨大，而且导致检测效率低，更重要的是浪费珍贵的DNA样本、明显增加基因诊断的检测成本，严重制约了其在临床分子诊断中的大规模应用。因此，有必要寻求一种新的检测角膜5营养不良致病基因突变的方法，提高诊断准确率，降低成本和劳动强度并提高时效性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能够提高诊断准确率、降低成本和劳动强度的通过靶向高通量测序技术检测诊断角膜营养不良致病基因的DNA文库。
本发明的目的之二在于提供所述DNA文库的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种基于高通量测序技术诊断角膜营养不良的DNA文库，该文库包括24个角膜营养不良相关的致病基因，其中，所述24个角膜营养不良相关的致病基因如下表所示：
。
本发明提供的DNA文库覆盖包括上皮和上皮下角膜营养不良、前弹力层角膜营养不良、基质角膜营养不良、后弹力层及角膜内皮营养不良等多种常见类型角膜营养不良，包含24个角膜营养不良致病相关基因。这24个基因选择基于国际已报道和公认的临床致病基因数据库(OMIM数据库、HGMD数据库、ClinVar数据库)。这24个基因上的致病突变既可以单独致病，也可以联合致病导致更加严重和复杂的临床表型，本发明首次做到可以一次性全面的对它们进行测序。
本发明根据24个角膜营养不良致病基因，设计能覆盖上述基因外显子及毗邻±20bp内含子区域的探针池，利用探针靶向捕获建立含有24个角膜营养不良致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，明确角膜营养不良的遗传学病因，为临床诊断提供遗传学和分子生物学的理论依据。
所述DNA文库在制备诊断角膜营养不良的试剂盒中的应用。
所述应用包括下列步骤：
1)收集角膜营养不良患者的临床资料及临床生物样本，优选的，所述的临床生物样本是指来源于人体的各类样本，包括但不限于来自受试者的外周血、体液、组织器官样本，如受试者的唾液、毛发或口腔黏膜等。
2)提取样本的基因组DNA，优选的，提取方法包括DNA提取试剂盒或各种手工提取方法。
3)对提取的基因组DNA进行定量，并构建文库，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳；其中，构建文库包括如下步骤：
a)将基因组DNA进行片段化，优选的，所述片段化方法包括但不限于超声破碎、转座酶酶切和限制性内切酶酶切；
b)将片段化的基因组DNA进行末端修复的同时进行3'末端加A；
c)将3'末端加A的产物连接接头，以便进行有效连接产物的扩增，优选的，所述链接接头来自于高通量测序建库试剂盒；
d)将连接产物利用通用引物进行PCR扩增，加上完整的接头，优选的，所述通用引物来自于高通量测序建库试剂盒；
e)使用针对上述24个角膜营养不良相关基因的探针靶向捕获目标区域，优选的，所述捕获方法包括但不限于液相探针捕获和固相芯片杂交捕获；
f)将未捕获的文库清洗掉，仅保留目标区域文库；
j)获得目标区域捕获文库。
4)对文库进行定量操作，优选的，所述定量方法包括但不限于荧光定量方法和电泳。
5)利用测序设备对文库进行高通量测序，优选的，所述测序设备包括但不限于Novaseq系列、Hiseq系列、Nexeseq系列、BGIseq系列第二代核酸测序仪；
6)将得到的测序数据进行生物信息学比对，并通过变异解读得到致病位点相关信息。
一种诊断试剂盒，所述试剂盒包括所述的DNA文库。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.角膜营养不良是一类严重危害视觉健康的遗传性致盲疾病，是具有原发性、进行性、双眼性、致盲性的角膜病变。确定角膜营养不良的致病基因，不仅可以了解疾病相关蛋白的功能，还能为角膜营养不良患者提供更多有用的临床信息,例如，通过对致病基因的筛查和分析有助于对临床疑似病例和非典型表现型做出准确的诊断。本发明旨在探索角膜营养不良的遗传学病因，从而帮助了解发病机制，辅助临床诊断、预后判断、产前诊断和为今后的基因治疗奠定基础。
2.基因诊断有助于临床遗传咨询和产前诊断等。因角膜营养不良对个人视力健康的危害巨大，且疾病存在临床异质性和表现度差异，基因检测可为患者家属提供更多的遗传信息。通过临床遗传咨询，家属可了解自身的患病可能；患者父母或本人可通过基因检测指导生育，确保将来下一胎的健康。角膜营养不良多数为常染色显性遗传，但也有常染色体遗传模式，只有进行基因检测才能够提供准确的健康和生殖指导。发现家系中尚无症状的年幼致病基因携带者也有助于更早制定家庭医疗和康复计划。
3.本申请的DNA文库是发明人在多年开展高通量基因检测服务积累大量中国角膜营养不良临床病例的基础上，查阅大量文献，并采用ClinGen等权威数据库提供的疾病-基因相关性筛选方法，从众多的角膜营养不良致病基因中选择的24个基因。所选基因兼顾了全面性、准确性和科学性。本发明优选24个角膜营养不良致病基因，设计探针池，建立针对24个角膜营养不良致病基因的目标区域文库，文库利用高通量测序技术进行测序，寻找致病突变，为临床诊断提供遗传学和分子生物学依据。本发明具有准确、快速、灵活、低成本的特点，本发明涉及的24个基因检测区域能够检测包括上皮和上皮下角膜营养不良、前弹力层角膜营养不良、基质角膜营养不良、后弹力层及角膜内皮营养不良等多种常见角膜营养不良，对角膜营养不良的诊断和鉴别诊断有着重要的意义和临床价值。
4.本发明中采用高通量测序技术对目标区域捕获文库进行测序，能够在一次测序反应中同时检测本发明中涉及的24个相关致病基因的全部外显子及其毗邻区域。与传统测序技术相比，本发明的检测效率显著提高、成本显著降低，在角膜营养不良的基因挖掘和致病基因筛查方面具有巨大优势，是高效、可信、经济的角膜营养不良基因检测技术。
5.综合来看，本发明中涉及的DNA文库及其应用具有准确、灵活、快速、低成本的特点；经过临床评估，该发明对角膜营养不良具有很好的辅助诊断价值。
附图说明
图1为实施例1中对先证者样本的24个角膜营养不良基因建立目标区域靶向DNA文库的质控信息。
图2为实施例1中对先证者样本的24个角膜营养不良基因的目标区域进行测序的数据覆盖信息。
图3为实施例1中对先证者样本的24个角膜营养不良基因的目标区域进行测序的数据量信息。
图4为实施例1中视力下降家系的家系图谱，图中箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者及视力检测有异常者，空心图标表示为健康个体。
具体实施方式
本发明提供了一种检测诊断角膜营养不良致病基因的DNA文库及其应用，下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，根据本发明的一个实施例，通过高通量测序平台进行测序，优选Illumina Hiseq平台，并进行数据分析，确定疑似角膜营养不良患者是否存在致病基因变异。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第四版或者相关资料进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例1：
本实施例是采用Illumina公司的Hiseq测序平台对受检人外周血基因组DNA进行检测，具体实施步骤如下：
1.样本来源
来自中国福建省的一个视力下降家系，其中先证者为52岁男性，约20年前开始反复出现眼红、眼痛、畏光、流泪等角膜上皮糜烂症状，视力逐渐下降。裂隙灯检查：双眼角膜中央上皮下和基质浅层可见边缘不规则的椭圆形混浊。先证者25岁女儿无明显临床症状，但裂隙灯检查结果显示双眼角膜中央上皮下散在点状混浊，先证者23岁儿子及先证者妻子的眼部检查未见异常。该患者的家系谱如图4所示，箭头指向的是先证者，实心图标表示为患者，空心图标表示为健康个体。获得所有参与者的知情同意书，从该实施例家系成员的肘静脉采集静脉血10ml(EDTA抗凝处理)，用于检测。
2.标本基因组DNA的提取：
按照商家提供的说明书操作，使用Magen公司的基因组DNA提取试剂盒(HiPureBlood&Tissue DNA Kit)从外周血样本中提取基因组DNA，使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间，使用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。
3.基因组扩增文库的建立：
按照商家提供的说明书操作，使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus LibraryPreparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增，最后对获得文库进行定量和质检，具体实施步骤如下：
1)基因组DNA片段化反应，反应体系如下：
试剂名称
用量(μL)
基因组DNA(100ng)
1
NF H<sub>2</sub>O
16.5
KAPA Frag Buffer
2.5
KAPA Frag Enzyme
5
总体积
25
反应条件：37℃反应12min。
2)末端修复和3'末端加A反应，反应体系如下：
试剂名称
用量(μL)
步骤1)中片段化后DNA
25
KAPA End Repair&A-Tailing Buffer
3.5
KAPA End Repair&A-Tailing Enzyme Mix
1.5
总体积
30
反应条件：20℃反应1min；65℃反应30min；20℃恒温。
3)接头链接反应，反应体系如下：
反应条件：20℃反应20min。
4)第一次PCR扩增反应，反应体系如下：
试剂名称
用量(μL)
步骤3)获得的DNA
16
KAPA HiFi HotStart Ready Mix(2×)
20
T5*Primer(10μM)
1.5
T8*Primer(10μM)
1.5
总体积
39
反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)×6cycles；72℃1min；12℃保存。
5)DNA定量和质检：
使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度，配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。
4.基于探针杂交捕获构建目标区域靶向文库：
按照商家提供的说明书操作，文库的构建采用IGT公司的文库构建试剂盒，探针根据候选的24个角膜营养不良致病基因序列设计，合成并生物素标记，具体实施步骤如下：
1)探针杂交：
将步骤3获得的PCR产物5μg与5μL Cot-1human DNA混合，涡旋振荡；根据总体积，加入2.5×Ampure XP beads，混匀离心，室温静置5min；上述磁珠用80％的乙醇离心清洗2次，用杂交液洗脱并进行杂交反应，杂交液的体系如下：
杂交条件：95℃反应10min；65℃过夜。
2)使用80μL链霉亲和素标记的磁珠(M-270Streptavidin beads)，通过生物素与链霉亲和素结合，将杂交有样品目标序列的探针捕获到磁珠上。利用200μL的1×Bead WashBuffer依次在65℃和室温洗涤三次，每次3min，最后磁珠用20μL NF Water重悬。
3)对捕获到的目标序列进行第二次PCR扩增反应，反应体系如下：
试剂名称
用量(μL)
KAPA HiFi Hot start Readymix(2×)
25
X Gen Library Amplification primer-Ts Mix
5
步骤2)获得的带磁珠DNA
20
总体积
50
反应条件：98℃45s；(98℃15s,60℃30s,72℃30s)7cycles；72℃1min；4℃保存。
4)PCR产物定量和质检：
使用Nanodrop one测量PCR扩增产物的浓度和条带分布情况；配置2％琼脂糖凝胶，将获得PCR扩增产物与上样缓冲液混合，电泳观察条带的位置、亮度、均一性，条带大小在200-800bp之间为合格。
5.测序数据的生信分析和变异解读：
使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScanmpileup2indel检测确定24个角膜营养不良相关致病基因区域的变异。利用Remove RunCommon Variants和Remove Global Common Variants软件去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等，并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行变异功能预测。根据《ACMG遗传变异分类标准与指南》，分析得到对角膜营养不良诊断有意义的突变位点。
6.测序结果说明及分析
通过本发明中提供的一种检测诊断角膜营养不良致病基因的DNA文库，一次性对4个受检者24个角膜营养不良相关基因进行测序。以先证者为例，经质控分析，所得DNA文库大小主要分布在200-800bp，平均长度为346bp，浓度和片段大小符合测序要求，提示文库构建质量合格(如图1)。DNA文库包括24个基因的编码区长度为60171bp，非编码区长度为5455bp，共计65626bp。其中编码区的测序覆盖度50×超过98％，20×超过99％(如图2)。总共获得201691的片段读长数据(Total Reads)，匹配率(Aligned)为88.82％(如图3)。以上测序结果满足变异解读的数据要求。经过对测序数据的分析，发现与受检者临床表型相关的，角膜营养不良相关基因变异，如下表所示：
经过本实施例，发现受检者和受检者女儿的外周血携带TGFBI基因的c.535C>T(p.R179*)杂合变异，最终明确患者为角膜营养不良患者，为临床诊断提供了依据。尚无症状的先证者女儿同样携带致病基因变异，是遗传自先证者，未来会发生角膜营养不良症状，可有针对性的进行视力保护，如有生育计划，可进行第三代试管婴儿或产前诊断，保证出生健康后代。无症状的先证者儿子未携带致病基因变异，患角膜营养不良的风险显著降低(如图4)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“该实施例”、“实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中，且不做特定指代。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。