阅读说明：本技术 膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用 (Application of membrane protein molecule ErbB4 in preparation of medicines for treating cerebral ischemic injury ) 是由 陈霞 魏金环 周雪莉 王守艳 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用,包括以下方面：建立损伤模型,对损伤模型进行膜蛋白分子ErbB4制备的药物治疗,即在损伤模型中促进ErbB4总表达和活性,可以抑制缺血对神经元的损伤。本发明还提供一种治疗脑缺血损伤药物,包括促进膜蛋白分子ErbB4总表达和活性的调节蛋白NRG1。本发明还提供膜蛋白分子ErbB4的总表达和活性的促进方法,包括以下过程：(1)建立脑缺血模型；(2)观察脑缺血模型中ERBB4总表达和活性片段表达；(3)膜分子ErbB4的活性及表达调控是否可影响胆固醇合成；(4)在脑缺血模型中增加NRG1,促进ERBB4总表达和活性。本发明的应用抑制缺血对神经元的损伤,对脑缺血损伤有保护作用。(The invention provides an application of a membrane protein molecule ErbB4 in preparing a medicament for treating cerebral ischemic injury, which comprises the following aspects: and (3) establishing a damage model, and carrying out drug treatment prepared from the membrane protein molecule ErbB4 on the damage model, namely promoting the total expression and activity of ErbB4 in the damage model, so that the damage of ischemia on neurons can be inhibited. The invention also provides a medicament for treating cerebral ischemic injury, which comprises regulatory protein NRG1 for promoting the total expression and activity of a membrane protein molecule ErbB 4. The invention also provides a method for promoting the total expression and activity of the membrane protein molecule ErbB4, which comprises the following steps: (1) establishing a cerebral ischemia model; (2) observing total expression and active fragment expression of ERBB4 in a cerebral ischemia model; (3) whether the activity and expression regulation of the membrane molecule ErbB4 can affect cholesterol synthesis; (4) increasing NRG1 in brain ischemia models promoted total ERBB4 expression and activity. The application of the invention inhibits the damage of ischemia to neurons and has protective effect on cerebral ischemia damage.)

膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和生物医药领域，具体涉及膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用、治疗脑缺血损伤药物、膜蛋白分子ErbB4的总表达和活性的促进方法。

背景技术

《中国脑卒中防治报告(2018)》统计数据指出，在过去30年里，我国脑卒中发病率急剧攀升，并呈现出低收入群体中快速增长、性别和地域差异明显以及年轻化趋势。报告中提出，脑卒中防治工程刻不容缓，必须进一步强化脑卒中防治工作的科研内涵。

脑卒中患者中缺血性脑卒中约占80%。缺血性脑卒中是指突然发生的脑组织局部供血动脉血流灌注减少或者血流供应完全中断，导致该组织供血、供氧、供糖等减少或完全停止，细胞破坏崩解。因此，重建血流或者增加缺血区域的血供是脑组织缺血修复的必要条件。重建血流或增加缺血区的血供是缺血脑组织修复损伤的必需条件，然而医学家们发现，对脑组织造成损伤的主要因素，不是缺血本身，而是这部分重新获得血液供应的脑组织内的细胞造成的损伤，称为“脑缺血再灌注损伤”。脑缺血后的病理损伤机制非常复杂，各种损伤机制之间的级联和网络关系尚不明确，针对脑缺血损伤机制中某一靶点开发的候选药物临床试验均失败。因此，亟需探寻新的防治靶点、治疗药物及治疗方法来治疗或防治脑缺血损伤。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用、治疗脑缺血损伤药物、膜蛋白分子ErbB4的总表达和活性的促进方法，以解决背景技术中所提出的问题。

为解决上述技术问题，本发明的实施例提供膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用。

进一步的，膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用包括以下方面：建立损伤模型，对损伤模型进行膜蛋白分子ErbB4制备的药物治疗，即在损伤模型中促进ErbB4总表达和活性，可以抑制缺血对神经元的损伤。

本发明的实施例另外提供一种治疗脑缺血损伤药物，其特征在于，包括促进膜蛋白分子ErbB4总表达和活性的调节蛋白NRG1。

本发明的实施例另外还提供膜蛋白分子ErbB4的总表达和活性的促进方法，其特征在于，包括以下过程：（1）建立脑缺血模型；（2）观察脑缺血模型中ERBB4总表达和活性片段表达；（3）膜分子ErbB4的活性及表达调控是否可影响胆固醇合成；（4）在脑缺血模型中增加NRG1，促进ERBB4总表达和活性。

进一步的，所述步骤（1）中的脑缺血模型可采用大鼠MCAO/R损伤模型或OGD/R细胞损伤模型中的一种。

其中，所述大鼠MCAO/R损伤模型的建立包括以下步骤：鼠称重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定，颈正中切口，眼科镊分离皮下组织，暴露出大鼠气管，先将右侧颈总动脉分离，再将颈内动脉和颈外动脉分别分离，注意分离过程中要避免损伤迷走神经；由颈总动脉分叉处向头端依次游离，同时结扎右侧颈总动脉近心端，使其主干游离备用，接着分离右侧颈内、颈外动脉，用无损伤动脉夹固定颈内、颈外动脉，靠近颈总动脉结扎处远心端做一个切口，用显微镊持线栓迅速***切口，推进18-20mm 时可感阻力存在，表明线栓头端已通过大脑中动脉的起始处，并阻断中动脉部分血流的来源；结扎固定切口远心端血管，防止线栓脱落，缝合大鼠皮肤；大鼠缺血2h 后，将所留线头轻轻提拉至颈总动脉切口处，实现大脑中动脉的血流再灌注；操作期间大鼠肛温维持在 36.5-37.5℃之间，假手术组除不插线栓外，其余步骤同上；按照造模成功判断标准判断是否造模成功，参照Zea Long评分标准，分别于大鼠术后清醒时、再灌注开始前后评分：0分：无神经损害症状；1分：不能完全伸展左侧前爪；2分：向左侧转圈；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自发行走。

其中，所述OGD/R细胞损伤模型的建立方法包括以下步骤：采用三气培养箱进行模型的建立，通过直接通入N2的方式精确控制三气培养箱内CO₂和O₂浓度，同时剥夺神经元培养基中的糖，从而造成培养神经元缺氧缺糖的环境，模拟在体脑缺血的情况；海马神经元悬液接种于细胞培养皿中培养成熟，弃去培养皿中的细胞培养基并用无糖培养基代替；然后置于低氧工作站中，工作站内含有1%O₂、5%CO₂、94%N₂，进行缺氧培养45min；培养皿移出三气培养箱，然后将无糖培养基换成含糖细胞培养基并置于原细胞培养箱正常培养0h、6h、12h、18h、36h 进行检测。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明利用大鼠中动脉栓塞/复灌诱导的脑缺血损伤模型和氧糖剥夺/复氧复糖损伤模型，首次观察到缺血损伤后ERBB4总表达和活性片段表达均降低，本发明中膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用，通过促进膜蛋白分子ErbB4的表达，抑制缺血对神经元的损伤；本发明治疗脑缺血损伤药物中包括促进膜蛋白分子ErbB4总表达和活性的调节蛋白NRG1，NRG1能够促进ErbB4的总表达和活性；本发明的膜蛋白分子ErbB4的总表达和活性的促进方法，在脑缺血模型中增加NRG1，促进ERBB4总表达和活性，促进胆固醇合成增加，从而抑制缺血对神经元的损伤，抑制缺血损伤引起的行为学改变，对脑缺血损伤有保护作用。

附图说明

图1为本发明中大鼠脑缺血损伤模型中膜分子ErbB4表达及活性变化；其中，图1A为脑组织切片TTC染色图；图1B为复灌不同时间对海马组织中ErbB4 mRNA表达的影响；图1C为复灌不同时间对海马组织中ErbB4蛋白表达的影响；图1D为 ErbB4蛋白表达灰度统计图；# P＜0.05，### P＜0.001 vs. Sham. * P＜0.05，** P＜0.01 vs. MCAO/R0h。

图2为本发明中促进ErbB4活性可抑制缺血神经元的损伤的分析图；其中，图2A为OGD / R损伤不同时间对原代培养海马神经元ErbB4 mRNA表达的影响；图2B为ErbB4蛋白表达灰度统计图；图2C为 ErbB4 siRNA及NRG1对OGD/R损伤原代培养海马神经元细胞活力影响的示意图；图2D为ErbB4 siRNA及NRG1对原代培养海马神经元OGD/R损伤后细胞凋亡影响的示意图；## P＜0.01，### P＜0.001 vs. Control. * P＜0.05，** P＜0.01， ***P＜0.001 vs. OGD/R0h。

图3为本发明中促进ErbB4活性可增加胆固醇合成，抑制缺血神经元的损伤的分析图；其中，图3A为 ErbB4 siRNA及NRG1调控ErbB4蛋白的表达图（western blot检测）；图3B为 ErbB4 siRNA及NRG1对OGD/R损伤原代海马神经元胆固醇合成主要酶表达影响的示意图；图3C为ErbB4 siRNA及NRG1调控ErbB4蛋白表达灰度统计图；# P＜0.05，### P＜0.001vs. Control. * P＜0.05，** P＜0.01， *** P＜0.001 vs. OGD/R18h。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

本发明实施例提供膜蛋白分子ErbB4在制备治疗脑缺血损伤药物中的应用，包括以下方面：建立损伤模型，对损伤模型进行膜蛋白分子ErbB4制备的药物治疗，即在损伤模型中促进ErbB4总表达和活性，可以抑制缺血对神经元的损伤。

本发明的实施例另外提供一种治疗脑缺血损伤药物，包括促进膜蛋白分子ErbB4总表达和活性的调节蛋白NRG1。

本发明的实施例另外还提供膜蛋白分子ErbB4的总表达和活性的促进方法，其特征在于，包括以下过程：（1）建立脑缺血模型；

脑缺血模型可采用大鼠MCAO/R损伤模型或OGD/R细胞损伤模型中的一种。

其中，所述大鼠MCAO/R损伤模型的建立包括以下步骤：鼠称重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后固定，颈正中切口，眼科镊分离皮下组织，暴露出大鼠气管，先将右侧颈总动脉分离，再将颈内动脉和颈外动脉分别分离，注意分离过程中要避免损伤迷走神经；由颈总动脉分叉处向头端依次游离，同时结扎右侧颈总动脉近心端，使其主干游离备用，接着分离右侧颈内、颈外动脉，用无损伤动脉夹固定颈内、颈外动脉，靠近颈总动脉结扎处远心端做一个切口，用显微镊持线栓迅速***切口，推进18-20mm 时可感阻力存在，表明线栓头端已通过大脑中动脉的起始处，并阻断中动脉部分血流的来源；结扎固定切口远心端血管，防止线栓脱落，缝合大鼠皮肤；大鼠缺血2h 后，将所留线头轻轻提拉至颈总动脉切口处，实现大脑中动脉的血流再灌注；操作期间大鼠肛温维持在 36.5-37.5℃之间，假手术组除不插线栓外，其余步骤同上；按照造模成功判断标准判断是否造模成功，参照Zea Long评分标准，分别于大鼠术后清醒时、再灌注开始前后评分：0分：无神经损害症状；1分：不能完全伸展左侧前爪；2分：向左侧转圈；3分：行走时向左侧倾倒；4分：不能自发行走。

其中，所述OGD/R细胞损伤模型的建立方法包括以下步骤：采用三气培养箱进行模型的建立，通过直接通入N₂的方式精确控制三气培养箱内CO₂和O₂浓度，同时剥夺神经元培养基中的糖，从而造成培养神经元缺氧缺糖的环境，模拟在体脑缺血的情况；海马神经元悬液接种于细胞培养皿中培养成熟，弃去培养皿中的细胞培养基并用无糖培养基代替；然后置于低氧工作站中，工作站内含有1%O₂、5%CO₂、94%N₂，进行缺氧培养45min；培养皿移出三气培养箱，然后将无糖培养基换成含糖细胞培养基并置于原细胞培养箱正常培养0h、6h、12h、18h、36h 进行检测。

观察脑缺血模型中ERBB4总表达和活性片段表达；

本发明的膜分子ErbB4总蛋白及水解后各片段即活性在缺血复灌损伤神经元中的发生明显变化。与假手术大鼠比较，缺血大鼠脑组织中的ErbB4总蛋白表达及其活性片段（分子量为80×10³KD）开始出现下降趋势；再灌注损伤6h后，出现明显下降趋势，伴随再灌注损伤时间的延长，当MCAO再灌注损伤12h时ErbB4蛋白表达及活性降至最低，再灌注损伤24h后有所回升，如图1所示。

ErbB4基因编码蛋白的相对分子质量为180×10³ KD，一方面，ErbB4可作为酪氨酸激酶被配体活化，引起相应信号通路活化；另一方面，ErbB4可经过一系列特定蛋白酶水解产生一段含有酪氨酸激酶活性相对分子质量为80×10³ KD的膜蛋白片段。该跨膜片段进一步被水解并最终被转运到细胞核中直接激活某些基因转录，调控ErbB4可以调控缺血损伤病理的多个环节；因此，通过本发明的药物通过调控ErbB4，可以调控缺血损伤。

膜分子ErbB4的活性及表达调控是否可影响胆固醇合成；

本发明ErbB4膜分子的活性与表达调控可影响胆固醇合成，从而调控缺血损伤细胞的存活。胆固醇是生物膜的重要成分。生物膜是生命活动中绝对重要的结构，胆固醇主要以游离形式存在于其中。在细胞质膜中含量较高，内质网和其它细胞器中较少。神经细胞缺血后，胆固醇流出增加，膜结构破坏，是细胞损伤原因之一。促进胆固醇合成，减少胆固醇流出可抑制细胞损伤。SREBP-2主要是促进胆固醇的合成。

如图3B所示，本发明膜分子ErbB4活化后可诱导SREBP-2表达和胆固醇合成途径限速酶HMGCR，从而促进胆固醇合成，促进损伤神经元存活。

在脑缺血模型中增加NRG1，促进ERBB4总表达和活性。

如图2、图3所示，与正常对照组相比较，OGD/R18h损伤原代海马神经元后，ErbB4的蛋白表达量明显下降；与OGD/R18h组进行比较，ErbB4 siRNA 对原代海马神经元进行干扰处理后，OGD/R18h损伤后的ErbB4的蛋白表达量进一步下降；而OGD/R18h+NRG1组ErbB4的蛋白表达明显上升。ErbB4 siRNA能显著抑制原代海马神经元OGD/R损伤后ErbB4的蛋白表达，而ErbB4被NRG1激活后，其蛋白表达明显提高。此外，ErbB4 siRNA增加了OGD/R损伤原代培养海马神经元的细胞凋亡，而ErbB4激活后细胞凋亡明显减少，说明ErbB4对脑缺血再灌注损伤神经元有保护作用。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。