阅读说明：本技术 锁阳总多糖在制备治疗哮喘药物中的应用 (Application of cynomorium songaricum total polysaccharide in preparation of medicine for treating asthma ) 是由 辛贵忠 陈琳 刘丽芳 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了锁阳总多糖在制备治疗哮喘药物中的应用,实验证明锁阳总多糖能够明显改善屋尘螨致敏哮喘小鼠肺组织的病理变化,抑制炎性因子的增加,可用于制备预防或治疗哮喘药物。锁阳总多糖用于哮喘的防治,安全无毒副作用,有良好的应用前景。(The invention discloses application of cynomorium songaricum total polysaccharide in preparation of a medicine for treating asthma, and experiments prove that the cynomorium songaricum total polysaccharide can obviously improve pathological changes of lung tissues of house dust mite allergic asthma mice and inhibit increase of inflammatory factors, and can be used for preparing medicines for preventing or treating asthma. The cynomorium songaricum total polysaccharide is used for preventing and treating asthma, is safe, has no toxic or side effect, and has good application prospect.)

锁阳总多糖在制备治疗哮喘药物中的应用

技术领域

本发明属于天然药物的用途，具体涉及了锁阳总多糖在制备治疗哮喘药物中的应用。

背景技术

支气管哮喘(简称哮喘，Asthma)是一种慢性气道疾病，其主要表现为气道阻塞可逆性、气道高反应性、嗜酸性细胞和CD4+T辅助(Th)2型细胞炎性浸润和气道重塑，症状多为喘息、呼吸困难、胸闷和咳嗽等。哮喘属于自身免疫性疾病，近几年，宿主机体和肠道菌群产生的“内源性代谢物”在哮喘的发生、发展中占据重要地位，尤其是脂质代谢物。短链脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸，是由大肠微生物发酵未消化或部分消化的膳食纤维产生的，对宿主免疫系统的发育和功能具有广泛的影响。哮喘病的发病机制至今尚未阐明，临床上主要针对慢性期气道炎症进行抗炎治疗，主要为西药，但考虑到哮喘多因素致病的特点，西药在治疗哮喘疾病中存在明显的局限性，而中药由于其“多组分、多靶点、整体调节”的作用特点，在哮喘病的防治方面具有独特优势。

膳食纤维是植物或类似碳水化合物的可食用部分，具有三个或三个以上单体单元的可食用碳水化合物聚合物，包括多糖，低聚糖，木质素和相关的植物物质。其对人类小肠中的消化和吸收具有抗性，但可以被肠道菌群发酵。现已发现膳食纤维对肠道菌群的组成、多样性和丰富度有巨大影响，肠道微生物及其代谢产物可以保护肠上皮和肌肉免受病原体侵袭，在许多生理过程、慢性疾病中起着重要作用。将膳食纤维引入临床作为饮食辅助干预治疗也是现下的研究热点，赋予了“药食同源”新的含义。

锁阳来源于锁阳科植物锁阳CynomoriumsongaricumRuhr.的干燥肉质茎，为我国药典收载品种，具有补肾阳，益精血，润肠通便的功效。其水提物中富含多种化学成分，如多糖、黄酮、三萜类、甾体类、生物碱、皂苷。多糖类物质是锁阳中含量丰富的大分子物质，迄今对锁阳多糖的研究尚浅，因此我们建立并优化了水溶性锁阳多糖的精制工艺，得到锁阳总多糖组分，并首次发现其具备缓解哮喘活性，迄今为止尚未发现有关锁阳多糖防治哮喘的文献报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于精制得到水溶性锁阳总多糖在制备预防或治疗哮喘药物或辅助治疗药物中的应用。

技术方案：锁阳总多糖在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用。

所述锁阳总多糖为锁阳总多糖或含有锁阳总多糖的制剂。

所述制剂由锁阳总多糖添加药学上可接受的辅料制成。

所述制剂为口服制剂。

所述药学上可接受的辅料选自填充剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、溶剂或矫味剂中的一种或几种。

所述口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液。

锁阳总多糖为锁阳总多糖提取物的主要成分，锁阳总多糖提取物中糖含量在70％以上。

锁阳总多糖提取物在制备预防和/或治疗哮喘药物中的应用。

所述的锁阳总多糖提取物的制备方法，具体包括以下步骤：

称取过筛的锁阳药材粉末，加入乙醇回流脱脂，过滤，沉淀烘干，将烘干后的沉淀加水加热回流提取，重复提取多次，合并提取液浓缩，加入乙醇过夜沉淀，离心后得沉淀固体，冻干得锁阳粗多糖；水溶解锁阳粗多糖，过滤后收集滤液；滤液与木瓜蛋白酶反应后，取上清液与H₂O₂反应，流水透析，浓缩，加入乙醇过夜沉淀，离心后得沉淀固体，冻干，得锁阳总多糖提取物固体。

所述锁阳总多糖提取物中多糖的分子量范围为36464～24KDa。

有益效果：本发明公开了锁阳总多糖能够明显改善屋尘螨致敏哮喘小鼠肺组织的病理变化，抑制炎性因子的增加，可用于制备预防或治疗哮喘药物。锁阳总多糖用于哮喘的防治，安全无毒副作用，有良好的应用前景。

附图说明

图1为锁阳总多糖脱蛋白实验单因素考察结果；

图2为锁阳总多糖脱色实验单因素考察结果；

图3为锁阳总多糖高效分子排阻色谱；

图4为小鼠BALF中炎症细胞分类计数结果；

图5为小鼠肺组织切片HE染色结果；

图6为小鼠血清中IgE检测结果。

具体实施方式

实例1：锁阳总多糖提取物的制备方法

称取粉碎后过80目筛的锁阳药材50g于提取容器中，加入5倍体积乙醇，回流脱脂3小时，过滤除去上清后，烘干样品。将烘干后的样品至于圆底烧瓶中，加入单蒸水1.25L，100℃加热回流提取4小时，重复提取4次。合并四次提取液浓缩150mL，加入乙醇600mL，4℃过夜沉淀，离心后得沉淀固体，冻干得多糖固体，称重，得粗多糖5.65g。称取1g锁阳粗多糖，溶于200ml蒸馏水中，70℃下加热搅拌溶解，过滤后收集滤液。调节pH值至7，用10％(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒温反应2.5小时后，沸水浴5分钟，冷却至室温，离心除去多余的酶(4000rpm/min,5min)，得上清液。将上清液pH值调至8，用15％(V/V)的30％H₂O₂在55℃下，恒温反应1.5小时后，将样品溶液装入透析袋，流水透析36小时，浓缩至10mL，加入乙醇40mL，4℃过夜沉淀，离心后得沉淀固体，冻干得锁阳总多糖提取物固体，称重，得0.468g，糖含量为71.4％。

采用高效液相色谱法进行相对分子量分析，以Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器。色谱条件为：H₂O为流动相，流速1ml/min，样品浓度为1mg/ml每次进样35μl，检测时间30min。依次以标准分子量多糖DextranT-5、T-10、T-20、T40、T70绘制保留时间与各分子量对数关系标准曲线，再测样品的保留时间，根据标准曲线求得样品的分子量。结果见图3，所得多糖的分子量范围为36464～24KDa。

本发明的工艺参数由单因素实验(图1，图2)及正交实验(表1，表3)确定，结果见表2、表4。根据上述结果分析得出，影响锁阳总多糖脱蛋白效率的因素，主次顺序为pH＞酶含量＞温度＞时间，即酶含量10％，反应温度55℃，pH7，反应时间2.5h时，脱蛋白效率最高。影响锁阳总多糖脱色效率的因素，主次顺序为pH＞温度≈时间＞H₂O₂含量，H₂O₂含量为15％，反应温度为65℃，pH 8，反应时间为1.5h时，脱色效率最高。

表1脱蛋白实验因素水平

表2锁阳总多糖脱蛋白正交实验结果

表3脱色实验因素水平

表4锁阳总多糖脱色正交实验结果

实例2：锁阳总多糖对哮喘的活性研究

一、实验材料

1.1实验仪器

离心机，正置生物显微镜，酶标仪，研磨仪，数字病理切片扫描仪，超低温冰箱

1.3实验动物

清洁级C57BL/6J雌性小鼠60只，6-8周龄，体重18-20g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号为：SCXK(沪)2017-0005。

1.4实验溶液的配制

(1)0.01M PBS溶液：称取0.2g KCl，7.9g NaCl，1.44g Na₂HPO₄和1.8gK₂HPO₄，溶于800mL去离子水中，用HCl调节溶液的pH至7.4，最后使用去离子水至1L，冷藏备用。

(2)***(DXM)溶液(阳性药)：精密称量***1.3mg，溶解于13ml生理盐水中(0.02mg/20g/200μl)。

(3)锁阳总多糖溶液：按照53mg/kg/日的剂量，以纯净水溶解锁阳总多糖提取物，纯净水体积以每只小鼠每天消耗5mL为标准计算，每日现配。

(4)1％戊巴比妥钠(麻醉剂)：精密称量戊巴比妥钠0.35g，溶解于35ml生理盐水中(100μl/只)。

(5)致敏剂：配制8mg/ml的HDM母液，用生理盐水稀释40倍，即0.2mg/ml为所需浓度。精密移取母液0.4ml，加入15.6ml生理盐水配制成16ml的稀释液(10μg/50μl/只)，于-20℃保存。

二、实验方法

2.1HDM诱导的哮喘模型的建立

将小鼠适应性喂养7天后，随机分为正常对照组(Control)，模型组(Model)，多糖组(CSP)，阳性药组(DXM)。除空白组外，所有组别在第0、3、5、10、12、14天用HDM诱导哮喘模型，具体操作为腹腔注射100μl麻醉剂，待小鼠麻醉后，取50μl致敏剂，滴鼻和气管滴注双效致敏。多糖组每天饮水给药，阳性药组在10-16天腹腔注射200μl***溶液。

2.2哮喘小鼠模型观察

在实验期间，每天观察小鼠呼吸状态。

2.3样品采集

禁食12h后，摘眼球取血，收集小鼠血液，静置30min后，3000rpm，10min离心取上清，分装于200μL EP管，-80℃存放备用。取血后脱颈椎处死，小鼠仰卧于手术操作台上，固定四肢，75％酒精对颈部消毒，充分暴露小鼠气管，在喉部附近***18G气管插管针(针头稍磨平)，针头***一定位置，切勿超过气管分叉处。用0.8mL预冷的PBS反复灌洗3次，收集肺泡灌洗液到2mLEP管中(回收率80％视为合格)，1000rpm，4℃离心，收集上清液，-80℃存放备用，下层细胞进行瑞氏-吉姆萨染色。待收集完BALF，沿颈部剪开胸腔皮肤，打开胸腔，暴露心肺，取气管和肺组织。将右肺上叶置于中性***溶液固定，用于HE染色。

2.4统计学处理

使用SPSS软件进行统计学分析，两个独立样本比较采用t检验，采用平均数±标准差(X±SD)表示，*p<0.05表示与对照组相比，样本差异显著，**p<0.01表示与对照组样本相比，差异极显著，^#p<0.05表示与模型组相比，样本差异显著，^##p<0.01表示与模型组相比，样本差异极显著。

2.4检测项目

2.4.1细胞分类计数：BALF离心后的下层细胞加入15μLPBS，涡旋或移液枪吹打重悬，移取10μL于载玻片上点样，37℃烘干。将载玻片置于染色盒上，进行瑞氏-吉姆萨染色。每张片子滴加A液150μL，染1min，加入B液450μL，染10min，洗耳球不断吹匀，用水轻轻冲洗15s，晾干。正置显微镜下观察400个细胞，计算巨噬细胞，嗜酸性粒细胞和淋巴细胞所占比例。

2.4.2HE染色：

a.固定：4％多聚甲醛固定至少24h以上；

b.脱水，透明：依次放入70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇中各1h，最后二甲苯透明处理；

c.浸蜡，包埋：软蜡中浸1h，硬蜡中浸泡30min，包埋结束后切成5μm的薄片进行染色。

d.苏木素-伊红(HE)染色：二甲苯浸泡脱蜡10min×2次，依次在100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇浸泡各1min水化，清水冲洗；苏木素染色10min，清水冲洗；1％盐酸乙醇浸泡10s，清水冲洗；伊红染色30s，清水冲洗；梯度乙醇脱水(85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、100％乙醇各2min)；浸泡在二甲苯I中5min，二甲苯Ⅱ中5min，透明切片；最后中性树胶封片。

e.NanoZoomer数字病理切片扫描仪观察：观察肺组织切片肺泡壁有无充血、炎细胞浸润；有无肺气肿；肺内血管、支气管周围有无炎细胞浸润；肺内小支气管壁杯状细胞数量有无增多，管腔内有无炎性渗出等。

2.4.3血清样本IgE的测定：按照ELISA试剂盒说明书操作。

三、实验结果

3.1哮喘小鼠的呼吸状态变化

小鼠在每次滴注致敏剂后，表现出强烈的咳喘反应，说明气道滴注成功，从第10天可观察到小鼠呼吸急促、咳喘、弓背等状态，此为哮喘临床表现，说明造模成功。

3.2BALF中巨噬细胞、嗜酸性细胞和淋巴细胞比例

从图4中可以看出，BALF中嗜酸性细胞和淋巴细胞百分比，模型组显著高于空白对照组(p＜0.01)，表明哮喘组建模成功，炎症细胞淋巴细胞、嗜酸性细胞等百分比上升，且细胞总数会明显增多，提示肺部正发生炎症反应。多糖组和阳性药组的嗜酸性细胞和淋巴细胞百分比，相较于模型组有显著降低(p＜0.01)。说明锁阳总多糖对哮喘的肺部炎症有缓解作用。

3.3哮喘小鼠肺组织HE结果

肺组织HE染色结果显示，空白对照组小鼠表现为支气管、肺泡结构清晰，未见炎症(图5-a)。模型组小鼠较空白对照组表现出炎症反应，支气管周围可见炎性细胞浸润，以单核细胞为主，可见嗜酸性细胞，支气管、肺泡结构不清楚，上皮细胞脱落坏死，支气管腔内有渗出物等(图5-b)。多糖组和阳性药组均表现炎症减轻(图5-c,d)，说明锁阳总多糖对哮喘肺部的炎症有缓解作用。

3.4血清IgE检测结果

由图6可知，模型组小鼠血清中的IgE异常升高，明显高于空白对照组(P＜0.01)，阳性药组和多糖组小鼠的IgE水平均显著降低(P＜0.05)，说明锁阳总多糖起到缓解气道炎症的作用。

四、实验结论

综合小鼠形态学表现，以及各项病理指标结果，可以证明哮喘模型的成功建立，且锁阳总多糖对于哮喘的炎症反应有缓解作用。

实例3：锁阳总多糖制剂的制备

锁阳总多糖提取物固体20mg，与淀粉50mg、糊精50mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入硬脂酸镁混合，制成片剂。

锁阳总多糖提取物固体20mg，与糊精等颗粒剂常用的辅料采用常规技术制成颗粒剂，再灌入硬胶囊皮中制成胶囊剂。

锁阳总多糖提取物固体20mg，与糖粉20mg、水5mg采用常规技术制成糖浆剂，再加入淀粉70mg采用常规技术制备成丸剂。

锁阳总多糖提取物固体20mg，与淀粉70mg、糊精10mg、糖粉10mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，湿法制粒制备成颗粒剂。

锁阳总多糖提取物固体20mg，与淀粉50mg、水50mg混合采用常规技术制成口服液。