阅读说明：本技术 一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法 (Fluorescence detection method for identifying multiple clinical drug-resistant bacteria ) 是由 徐兆超 龙双双 苗露 于 2018-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法,属于生物分析检测领域。该方法通过单一小分子荧光探针实现多种临床分离的耐药菌的鉴别,具体按照如下步骤进行：(1)细菌培养；(2)细菌收集：在10000-14000rpm条件下离心5-10分钟,弃上清,用20mM、pH＝7.4的HEPES缓冲液清洗细菌2-3次,最后用HEPES重悬细菌；(3)在待检测细菌中加入荧光探针,用荧光光谱仪检测,以荧光增强(△S/S<Sub>0</Sub>)和荧光比率变化(I<Sub>482</Sub>/I<Sub>375</Sub>)作为探针响应的二维信号,用于鉴别不同种类细菌。本发明利用单一小分子荧光探针能够灵敏识别细菌表面的微小变化的性能,实现对不同耐药细菌表面的识别,具有操作简单,检测灵敏快速,普适性强的特点,性能优于已有的耐药细菌检测法。(The invention provides a fluorescence detection method for identifying multiple clinical multiple drug-resistant bacteria, which belongs to the field of biological analysis and detection and comprises the following steps of (1) bacteria culture, (2) bacteria collection, namely centrifugation for 5-10 minutes under the conditions of 10000 and 14000rpm, supernatant abandoning, washing the bacteria for 2-3 times by using HEPES buffer solution with the concentration of 20mM and the pH value of 7.4, and finally resuspending the bacteria by using HEPES, (3) adding a fluorescence probe into the bacteria to be detected, detecting by using a fluorescence spectrometer, and enhancing the fluorescence (△ S/S) 0 ) And change in fluorescence ratio (I) 482 /I 375 ) Two-dimensional signals as probe responses for the identification of different species of bacteria. The invention can sensitively identify the property of micro-change on the surface of bacteria by using the single small-molecule fluorescent probe, realizes the identification on the surfaces of different drug-resistant bacteria, and has the characteristics of simple operation, sensitive and quick detection and strong universalityThe performance is better than the existing drug-resistant bacteria detection method.)

一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法

技术领域

本发明属于生物分析检测领域，具体涉及一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法。

背景技术

医院感染是指患者在医院住院期间发生的感染，包括患者住院期间发生的感染或者是在医院内获得出院后又发生感染。医院感染已经成为住院患者最大的威胁，而细菌感染被认为是医院感染最主要的原因之一。引起细菌感染的菌株大多为对抗菌药物耐药的菌株，甚至为多重耐药菌株，例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是临床分离中常见的耐药性革兰阳性球菌，其分离率已高达50％以上；而革兰阴性菌中，以表达超广谱β-内酰胺酶(CTX-M-ESBLS)的耐药细菌最为常见，如大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌等。我国对抗菌药物的长期过度使用导致各种耐药细菌的产生，尤其多重耐药细菌引起的各种医院感染人数已占住院患者病原菌感染总人数的30％左右。多重耐药菌感染后给临床治疗带来相当大的困难，甚至引起较高的死亡率。有效的控制患者在医院产生细菌感染的方法是快速、有效的鉴别耐药细菌，随后有目的的用药治疗。

目前常用的耐药菌检测方法是细菌培养基培养或者聚合酶链式反应法分离确定菌种种类，然后通过与多种药物分别孵育培养后检测其最低抑菌浓度(MIC)并确定其耐药性，医院里每天分离出的耐药/非耐药的菌种类众多，这种检测法需要耗费大量的时间与人力。因此急需一种简单快捷，且具有广谱性的检测方法用于耐药细菌的检测。荧光探针具有快速、简单、灵敏、能够实时监测等优点而被广泛应用于细菌的检测。但是目前常用的荧光检测法是将探针分子负载到识别单元，如抗体、适配体、多肽等，通过识别细菌的特定生物靶标来识别细菌。然而，这种方法一种探针只能单一检测某一种细菌，不能同时检测多种细菌而不具有普适性。

细菌表面是有多种组分组成的，细菌基因的任何改变都可能使细胞表面产生微小的变化，因此一种通过监控细菌表面微小变化来区分不同细菌的方法被开发出来。它的响应信号是通过多个具有不同特性的荧光探针与各种细菌表面的非特异性相互作用产生的。多种响应信号通过阵列法形成二维图谱，这种方法被称为二维传感器阵列法。已报道5个具有特殊特性的聚集诱导发光探针作为阵列传感器被用于区分8种细菌。然而，这种方法需要多个化合物的同时使用才能够实现对不同种属微小差异的区分，并且目前还没有探针报道用于鉴别多种耐药菌。同时，这种二维传感器阵列法存在操作繁琐，重复性差，适用范围小的问题。因此，开发一种简单快速的鉴别多种耐药菌的方法是当前的挑战。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法，这一方法利用单一小分子荧光探针与不同细菌表面作用方式的不同，通过探针荧光增强和荧光比率变化作为信号，形成二维图谱来鉴别临床耐药细菌，具有操作简单，检测灵敏快速，普适性强的特点，性能优于已有的细菌检测探针。

一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法，其特征在于采用多种多重耐药细菌荧光探针，按照如下步骤进行：

(1)细菌培养；

(2)细菌收集：在10000-14000rpm条件下离心5-10分钟，弃上清，用20mM、pH＝7.4的HEPES缓冲液清洗细菌2-3次，最后用HEPES重悬细菌；

(3)在待检测细菌中加入荧光探针，用荧光光谱仪检测；在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图，以荧光增强(△S/S₀)和荧光比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)作为探针响应信号，用于区分不同种类细菌。

所述用于多种多重耐药细菌鉴别的荧光探针，分子结构式如下：

该探针为二联咪唑盐两端连接有两个芘荧光团，能够发射芘单体或芘激基复合物荧光，分别在375nm和482nm；该化合物带有2个正电荷，在水溶液中由于疏水作用形成纳米聚集体而导致荧光淬灭。

所述检测细菌的浓度范围为大于10⁵CFU/mL，探针的浓度大于等于5μM。

所述的细菌为革兰氏阳性病原菌或革兰氏阴性病原菌：

所述的革兰氏阳性病原菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽胞杆菌、草绿色链球菌、棉子糖肠球菌、溶血葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、肺炎链球菌；

所述的革兰氏阴性病原菌为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、嗜肺性军团菌、克雷白氏杆菌、铜绿假单胞菌、洛菲不动杆菌、流感嗜血杆菌、肠炎沙门菌。

一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法，优选的检测方法如下：

(1)细菌培养至OD₆₀₀＝0.1-2.0。

(2)细菌收集：在10000-14000rpm条件下离心5-10分钟，弃上清，用20mM、pH＝7.4的HEPES缓冲液清洗细菌2-3次，最后用HEPES重悬细菌至OD₆₀₀＝0.05-2.0；

(3)在细菌中加入探针(浓度大于5μM)后用荧光光谱仪检测，在345nm激发波长下检测荧光得到荧光光谱图，以荧光增强和荧光比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)作为探针响应信号，用于区分不同种类细菌。

一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法的应用，该方法可以用于鉴别野生型细菌及其人工抗药菌。

一种鉴别临床多种多重耐药细菌的荧光检测法的应用，该方法可以用于鉴别临床分离的多种多重耐药细菌。

本发明的优点和有益效果为：

不同耐药菌表面结构的微小差异，使其与探针分子的作用模式不同，导致探针形成不同程度的单体和二聚体，从而产生芘单体和激基复合物荧光的比率变化(I₄₈₂/I₃₇₅)。以探针聚合物与细菌结合后产生的荧光增强，以及单体与激基复合物荧光比率变化作为荧光信号做二维图谱，能够鉴别临床分离的多种耐药细菌。

附图说明

图1为荧光探针在HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中定量检测不同细菌的生长曲线图。

图2为荧光探针在HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与大肠杆菌BL21及大肠杆菌BL21人工抗药菌(OD₆₀₀＝0.1)作用前后的荧光光谱图和二维图谱。

图3为荧光探针在HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与大肠杆菌DH5α和其人工抗药菌(OD₆₀₀＝0.1)作用前后的荧光光谱图和二维图谱。

图4为荧光探针在HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与临床分离的8株多重耐药/非耐药大肠埃希菌(OD₆₀₀＝0.1)作用前后的荧光光谱图和二维图谱。

图5为荧光探针在HEPES缓冲液(20mM，pH＝7.4)中与临床分离的6株多重耐药/非耐药金黄色葡萄球菌(OD₆₀₀＝0.1)作用前后的荧光光谱图和二维图谱。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

荧光探针对细菌的定量检测。

细菌培养：分别从过夜培养的大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌中取少量菌液转接于100mL LB培养基中至OD₆₀₀约为0.1，37℃培养，分别在0.66、1.33、2.00、2.66、3.33、4.33小时测菌液的OD₆₀₀值，并分别取出1mL菌液，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用1mL HEPES重悬细菌待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光光谱，以时间为横坐标，以不同时间测定的OD₆₀₀值为左纵坐标，同时以探针与细菌反应后荧光比率(I₃₇₅/I₄₈₂)值为右纵坐标得到图1。

图1a为di-PYIM探针与大肠杆菌DH5α作用后的细菌生长曲线图。图1b为di-PYIM探针与枯草芽孢杆菌作用后的细菌生长曲线图。大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌的OD₆₀₀时间曲线和荧光比率曲线能较好的重合，证明该探针能定量检测细菌。

实施例2

荧光检测法对大肠杆菌BL21野生型细菌及其人工抗药菌的区分

细菌培养：分别从长有大肠杆菌BL21和因人工转入pET-22b质粒而具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BL21细菌的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝1.0，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.1待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到图2a。

图2a中只有di-PYIM探针存在时显示微弱的荧光，分别加入大肠杆菌BL21和因人工转入pET-22b质粒而具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌BL21细菌后375nm和482nm发射峰的荧光均显著增强，但是增强的幅度不同。

图2b的二维荧光图谱由图2a中荧光光谱换算得到，其中横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I₄₈₂/I₃₇₅，纵坐标为探针与细菌反应后荧光增强强度，由△S/S₀表示，其中S₀代表只有di-PYIM探针存在时的荧光积分面积，△S代表探针与各种细菌作用前后的荧光积分面积的绝对差值。大肠杆菌BL21和其人工抗药菌分布于二维图中，虽有微弱的交叉，但是能达到区分效果。

实施例3

荧光检测法对大肠杆菌DH5α野生型细菌及其人工抗药菌的区分

细菌培养：分别从长有大肠杆菌DH5α和因人工转入pET-22b质粒而具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌DH5α细菌的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝1.0，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.1待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到图3a。

图3a中只有di-PYIM探针存在时显示微弱的荧光，分别加入大肠杆菌DH5α和因人工转入pET-22b质粒而具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌DH5α细菌后375nm和482nm发射峰的荧光均显著增强，但是增强的幅度不同。

图3b的二维荧光图谱由图3a中荧光光谱换算得到，其中横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I₄₈₂/I₃₇₅，纵坐标为探针与细菌反应后荧光增强强度，由△S/S₀表示，其中S₀代表只有di-PYIM探针存在时的荧光积分面积，△S代表探针与各种细菌作用前后的荧光积分面积的绝对差值。大肠杆菌DH5α和其人工抗药菌分布于二维图中，完全没有交叉，能达到区分效果。

实施例4

荧光检测法对临床分离的大肠埃希菌多种多重耐药/非耐药菌株的鉴别

细菌培养：分别从长有临床分离的大肠埃希菌8种多重耐药/非耐药菌株的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝1.0，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.1待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到图4a。

表1是测定过程中所用的临床分离的8种大肠埃希菌，通过对多种抗生素的最小抵抗浓度(MIC)进行检测，得到其耐药性(S表示敏感、R表示耐药、I表示中间体)，说明不同的大肠埃希菌对抗生素的耐药性各不一样，所选的临床大肠埃希菌具有多重耐药性，其中对照菌对抗生素的耐药数目相对于多重抗药菌的耐药数目少。

表1临床分离的8株多重耐药/非耐药大肠埃希菌对各种抗生素的耐药性数据。

(R:耐药性；S:敏感性；I:中间体)

图4a中只有di-PYIM探针存在时显示微弱的荧光，分别加入临床分离的大肠埃希菌8种多重耐药/非耐药菌株后375nm和482nm发射峰的荧光均增强，但是增强的幅度不同。其中对照菌为超光谱β内酰胺酶阴性对照菌

图4b的二维荧光图谱由图4a中荧光光谱换算得到，其中横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I₄₈₂/I₃₇₅，纵坐标为探针与细菌反应后荧光增强强度，由△S/S₀表示，其中S₀代表只有di-PYIM探针存在时的荧光积分面积，△S代表探针与各种细菌作用前后的荧光积分面积的绝对差值。临床分离的大肠埃希菌多种多重耐药/非耐药菌株分布于二维图中，几乎没有交叉，能达到区分效果。

实施例5

荧光检测法对临床分离的大肠埃希菌多种多重耐药/非耐药菌株的鉴别

细菌培养：分别从长有临床分离的大肠埃希菌各种多重耐药/非耐药菌的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝2.0，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为1.0待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光光谱类似于图4a，进而得到类似于图4b的二维图谱，可以鉴别临床分离的大肠埃希菌各种多重耐药/非耐药菌。

实施例6

荧光检测法对临床分离的大肠埃希菌多种多重耐药/非耐药菌株的鉴别

细菌培养：分别从长有临床分离的大肠埃希菌各种多重耐药/非耐药菌的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝0.2，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.05待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取2.5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取2.5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光光谱类似于图4a，进而得到类似于图4b的二维图谱，可以鉴别临床分离的大肠埃希菌多种多重耐药/非耐药菌。

实施例7

荧光检测法对临床分离的金黄色葡萄球菌多种多重耐药/非耐药菌株的鉴别

细菌培养：分别从长有临床分离的6种多重耐药/非耐药金黄色葡萄球菌表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝1.0，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.1待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光得到图5a。

表2是测定过程中所用的临床分离的6种金黄色葡萄球菌，通过对多种抗生素的最小抵抗浓度(MIC)进行检测，得到其耐药性(S表示敏感、R表示耐药、I表示中间体)，说明不同的金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药性各不一样，所选的临床金黄色葡萄球菌具有多重耐药性，其中对照菌对抗生素的耐药数目相对于多重抗药菌的耐药数目少。

表2临床分离的6株多重耐药/非耐药金黄色葡萄球菌对各种抗生素的耐药性数据。

(R:耐药性；S:敏感性；I:中间体)

图5a中只有di-PYIM探针存在时显示微弱的荧光，分别加入6种临床分离的金黄色葡萄球菌多重耐药/非耐药菌后375nm和482nm发射峰的荧光均显著增强，但是增强的幅度不同。其中对照菌为苯唑西林阴性金黄色葡萄球菌。

图5b的二维荧光图谱由图5a中荧光光谱换算得到，其中横坐标为di-PYIM探针与两种细菌作用后482nm与375nm发射峰的荧光强度比值I₄₈₂/I₃₇₅，纵坐标为探针与细菌反应后荧光增强强度，由△S/S₀表示，其中S₀代表只有di-PYIM探针存在时的荧光积分面积，△S代表探针与各种细菌作用前后的荧光积分面积的绝对差值。临床分离的各种多重耐药/非耐药金黄色葡萄球菌分布于二维图中，几乎没有交叉，能达到区分效果。

实施例8

荧光检测法对临床分离的金黄色葡萄球菌多种多重耐药/非耐药菌的鉴别

细菌培养：分别从长有临床分离的各种多重耐药/非耐药金黄色葡萄球菌的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝2.0，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为1.0待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光光谱类似于图5a，进而得到类似于图5b的二维图谱，可以鉴别临床分离的金黄色葡萄球菌各种多重耐药/非耐药菌。

实施例9

荧光检测法对临床分离的金黄色葡萄球菌多种多重耐药/非耐药菌的鉴别

细菌培养：分别从长有临床分离的各种多重耐药/非耐药金黄色葡萄球菌的表面皿挑取单斑分别于5mL LB培养基中，37℃振动培养至OD₆₀₀＝0.2，用12000rpm离心5分钟后用HEPES(20mM，pH＝7.4)清洗两遍，然后用HEPES重悬细菌至其OD₆₀₀值为0.05待测。

将di-PYIM溶于DMSO溶液中配制成2mM的母液。首先取2.5μL探针母液加入到1mLHEPES缓冲液中，用345nm激发波长激发测定荧光。然后取2.5μL探针母液分别加入到1mL的上述待测细菌溶液中，混匀后，用345nm激发波长激发，测定荧光光谱类似于图5a，进而得到类似于图5b的二维图谱，可以鉴别临床分离的金黄色葡萄球菌多种多重耐药/非耐药菌。