阅读说明：本技术 灵仙新苷在治疗雷公藤甲素所致肝损伤的药物中的应用 (Application of clematis chinensis glycoside in medicine for treating liver injury caused by triptolide ) 是由 刘丽芳 夏文瑞 辛贵忠 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了灵仙新苷在制备治疗雷公藤甲素所致肝损伤的药物中的应用,从传统中药威灵仙中获得的灵仙新苷对雷公藤甲素在治疗类风湿性关节炎(RA)时所致肝损伤具有保护作用。药理学试验证明,灵仙新苷可以有效降低给予雷公藤甲素的CIA模型大鼠的肝毒性相关血清生化指标,并且在细胞水平有同样的效果,这一结果进一步通过代谢组学的方法得到了验证。(The invention discloses application of clematis chinensis glycoside in preparing a medicine for treating liver injury caused by triptolide, wherein the clematis chinensis glycoside obtained from a traditional Chinese medicine clematis root has a protective effect on the liver injury caused by the triptolide when treating Rheumatoid Arthritis (RA). pharmacological tests prove that the clematis chinensis glycoside can effectively reduce the serum biochemical indexes related to hepatotoxicity of a CIA model rat given the triptolide, and has the same effect at the cellular level, and the result is verified by a method of metabonomics in step .)

灵仙新苷在治疗雷公藤甲素所致肝损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及化合物的应用，具体为灵仙新苷在治疗雷公藤甲素所致肝损伤的药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以关节病变为主的全身性疾病,对人体健康有着极大的危害。它是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病,其临床特征为外周关节滑膜炎继而引起软骨破坏和骨侵烛,造成关节畸形和强直,最终导致功能丧失,具有很高的致残率。其发病机制比较复杂，所以治愈起来有一定的障碍。

雷公藤甲素(Triptolide，TP)又称雷公藤内酯醇，是从卫矛科植物雷公藤的根、叶、花及果实中提取的一种环氧二萜内酯化合物，是雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎及免疫抑制作用，对RA有很好的治疗效果，临床应用广泛。然而，大量研究发现：雷公藤甲素也是雷公藤的主要毒性成分之一，对机体的消化系统、循环系统、***、生殖系统及免疫系统等都有比较严重的毒性，其中肝毒性尤为明显。雷公藤甲素致肝毒性的机制主要是使细胞色素P450酶系代谢异常、诱导氧化应激和细胞凋亡、免疫介导损伤、过氧化导致的自噬过度和诱导iNOS表达过量等。

威灵仙味辛咸,性温,具有祛风除湿,通络止痛之功效,临床上主要用于风湿痹痛、肢体麻木、筋脉挛急、屈伸不利等症状。2015版《中国药典》收载其来源为毛莨科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshuria Rupr.的干燥根和根茎。近年来，对威灵仙化学成分和药效的研究已逐渐深入，尤其是其中的皂苷类成分在抗炎方面的作用得到充分证实。灵仙新苷(Clematichinenoside AR，C-AR)是东北铁线莲中含量较高的单体皂苷，分子式为C₈₂H₁₃₄O₄₃，分子量为1807.93，属于齐墩果烷型五环三萜皂苷，具有良好的抗炎镇痛作用，其结构式如下所示。

已有文献报道，在多种复方中，甘草、三七等药材配伍雷公藤，达到了降低其毒性的目的，进一步研究表明，其中的甘草酸、三七皂苷R1等三萜皂苷在减毒中发挥了重要的作用，为中药雷公藤的减毒研究提供了研究思路。

代谢组学是以生物体液(如血液、尿等)、细胞组织提取物、细胞培养液等为对象，通过定性定量地分析生物系统中内源性代谢物的变化来评价外源性刺激物(如药物、毒物)对机体带来的影响，即测定代谢组受外界刺激而发生的变化情况，同时对代谢组数据进行生物信息学分析，从系统生化谱的角度整体地研究生物体对外界刺激的调节及应答机制。代谢组学是以研究生物体整体代谢变化为出发点，可以全面的反映药物作用后引起的生物体内各个组织的代谢变化，因此代谢组学具有能客观反映整体变化的特性。运用代谢组学技术可以全面反应雷公藤甲素致肝毒的体内代谢的变化，找出致毒/减毒的生物标志物和相应的代谢通路，为深入理解其致肝毒机制提供思考，也为降低雷公藤甲素肝毒性的研究提供新思路。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供灵仙新苷对治疗类风湿性关节炎时给予雷公藤甲素所导致的肝毒性的保护作用，指出灵仙新苷在制备治疗雷公藤甲素所致肝损伤的药物中有良好的应用前景。

技术方案：本发明所述灵仙新苷在制备治疗雷公藤甲素或含有雷公藤甲素的药品所致肝损伤的药物中的应用。

所述含有雷公藤甲素的药品为含有雷公藤甲素的药材及其提取物制成的单味或复方中药制剂。

所述灵仙新苷为灵仙新苷或包含灵仙新苷的组合物。

所述组合物由灵仙新苷添加药学上可接受的辅料制备成药物剂型。

所述药物剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、丸剂。

所述药学上可接受的辅料为稀释剂、湿润剂或润滑剂。

所述稀释剂为乳糖、淀粉、糊精、糖粉、微晶纤维素或微粉硅胶；湿润剂为水或30％～80％乙醇；润滑剂为硬脂酸镁或滑石粉。

本发明利用胶原诱导型类风湿性关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，评价了灵仙新苷潜在的抗炎活性及对雷公藤甲素导致的肝损伤的保护作用。实验设计时采取治疗性给药，使用Wistar大鼠和II型胶原溶液诱导构建模型。结果表明，灵仙新苷和雷公藤甲素联用仍具有显著的抗炎作用，能改善RA发病过程中的相关症状，而且联合用药后显著减轻了雷公藤甲素所致的肝损伤。

由于色氨酸代谢中的产物参与了氧化应激和三羧酸循环等过程，这些过程都与肝损伤有密切的关联，因此本发明利用代谢组学初步考察了单用雷公藤甲素及联用灵仙新苷后代谢轨迹的变化和色氨酸代谢水平变化，进一步揭示了灵仙新苷改善肝损伤的作用机制。

有益效果：本发明的实验表明，灵仙新苷能够在雷公藤甲素联用仍具有显著的抗炎作用，能改善类风湿性关节炎发病过程中的相关症状，而且联合用药后显著减轻了雷公藤甲素所致的肝损伤。阐释了可将灵仙新苷开发出一种疗效好而安全性高的新药，用于减轻主要成分含雷公藤甲素的药品所造成的肝损伤。

附图说明

图1是灵仙新苷定量分析的HPLC图；

图2是CIA大鼠的造模及给药流程；

图3是C-AR、TP和联合用药对CIA大鼠体重、足趾肿胀度和关节炎评分的影响；

图4是C-AR、TP和联合用药对CIA大鼠滑膜中炎性因子IL-1β和TNF-α的影响；

图5是C-AR、TP和联合用药对CIA大鼠肝脏组织的影响；

图6是C-AR、TP和联合用药对CIA大鼠血清生化指标的影响；

图7是C-AR、TP和联合用药对HepG2细胞中肝损伤相关生化指标的影响；

图8是大鼠肝脏和血清的代谢轨迹变化；

图9是大鼠肝脏中色氨酸代谢相关产物的含量变化。

具体实施方式

发明人在前期研究中，从威灵仙药材中制备得到了灵仙新苷，利用峰面积归一化法测得其纯度达到90.16％，见附图1。实验所用的灵仙新苷是自己从中药威灵仙中提取得到的，具体提取方法参见CN200510040825.7；雷公藤甲素是购买自南京泽朗医药科技有限公司。

实施例1

下面是本发明有关灵仙新苷的药理和分析试验及结果。

1.试验方法

(1)动物分组：雌性清洁级Wistar大鼠，体重120-130g，按体重随机分为7组，每组1笼饲养。分别设立正常对照组(Control group，10只)、模型组(Model group，10只)、灵仙新苷低剂量干预组(C-AR-L group，10只，8mg/kg/day)、灵仙新苷高剂量干预组(C-AR-Hgroup，10只，32mg/kg/day)、雷公藤甲素干预组(TP group，10只，45μg/kg/day)、灵仙新苷低剂量和雷公藤甲素联合干预组(C-AR-L+TP group，10只，C-AR-L：8mg/kg/day，TP：45μg/kg/day)、灵仙新苷高剂量和雷公藤甲素联合干预组(C-AR-H+TP group，10只，C-AR-H：32mg/kg/day，TP：45μg/kg/day)。

(2)药物配置：①II型胶原溶液：取牛II型胶原(CII)适量，加入0.1mol/L醋酸充分溶解，配制成2mg/mL胶原溶液，4℃过夜备用。取完全弗氏佐剂(CFA,2mg/mL)与CII溶液等体积混匀，通过分散器搅拌，制备成油包水型乳剂(即每0.1mL含0.1mg CII)。同法，将不完全弗氏佐剂(IFA,2mg/mL)与CII溶液等体积混匀，制得乳剂。乳剂的配制均在冰水浴中进行，现用现配。②雷公藤甲素溶液：称取适量雷公藤甲素粉末溶于0.5％CMC-Na溶液中，配成所需浓度的澄清溶液。给药剂量为45μg/kg/day(每天给药，持续25天)。③灵仙新苷溶液：称取适量灵仙新苷粉末溶于无菌蒸馏水中，配成所需浓度的澄清溶液。给药剂量分别为8mg/kg/day和32mg/kg/day(每天给药，持续25天)。

(3)模型建立及给药：尾静脉注射II型胶原溶液建立大鼠胶原诱导型类风湿性关节炎(CIA)模型，具体步骤如下：

在动物实验第0天，需要致敏的大鼠尾根部皮内注射0.2mL乳化液(CII和CFA制备的乳剂)。第7天，对已致敏的大鼠背部皮下多点激发注射0.2mL乳化液(CII和IFA制备的乳剂)。空白对照组大鼠均注射生理盐水，方法同致敏组大鼠。在致敏后第18天，即炎症发病高峰期，将所有致敏的大鼠随机分为6组：模型组(model group)、灵仙新苷低剂量组(C-AR-Lgroup)、灵仙新苷高剂量组(C-AR-H group)、雷公藤甲素组(TP group)，低剂量灵仙新苷和雷公藤甲素联合用药组(C-AR-L+TP group)、高剂量灵仙新苷和雷公藤甲素联合用药组(C-AR-H+TP group)(n＝10)。连续灌胃给药25天，其中，灵仙新苷低剂量组剂量为：8mg/kg/d；灵仙新苷高剂量组剂量为：32mg/kg/d、雷公藤甲素组剂量为：45μg/kg/d。实验流程见附图2。

(4)指标的测定与评价：

A.CIA大鼠模型的评价：

①体重的测量：

从致炎前(0天)起，每4天用体重秤测量每只大鼠的体重。

②足肿胀度的测定：

致炎前(0天)及致炎后第10天起，每4天用自制足趾肿胀测量仪测量每只大鼠后足的体积，取后足体积的平均值，计算足肿胀度。足肿胀度＝(致炎后体积-致炎前体积)/致炎前体积。

③关节炎指数评分：

致炎后第14天起，每4天对大鼠的关节病变程度进行评分。评分标准如下：

0分：无红肿、无炎症表现；1分：个别足趾轻微发红、肿胀；2分：多数足趾发红、肿胀；3分：足趾全部肿胀、踝关节中度肿胀；4分：踝关节至跖骨处红斑明显，严重肿胀，无法负重。对后肢关节进行评分并加和，每只大鼠最高评分为8分。

B.样本采集：

血清：大鼠隔夜禁食12h后眼眶取血，将血液静置30min后离心(15min，4℃，3500rpm/min)。轻轻吸取上层淡黄色血清，于-80℃条件下保存备用。

肝脏：通过麻醉后剪头处死大鼠，打开大鼠腹腔，剥离四叶肝脏，放入预冷的PBS中清洗，去除表面上粘附的血液和毛发。每组取三只大鼠的肝脏放入4％多聚甲醛固定液中用于H&E染色，其余肝脏分别放入对应的Ep管中，置于-80℃保存，用于后续的分子生物学检测。

C.H&E染色：

干燥后的组织切片需要脱蜡及水化才能在水溶性染料中进行染色。使用二甲苯脱蜡，再依次使用纯乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇洗，最后用蒸馏水洗。甩干后置于苏木精染液中染色5-10min。经水洗等操作后，再将切片用伊红染色1-3min。然后将切片依次放入95％乙醇、纯乙醇中梯度脱水，二甲苯中透化。最后使用中性树胶封片。利用数字病理切片扫描仪对制成的切片进行扫描。

D.ELISA试剂盒检测：

根据欣博盛生物科技有限公司ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠滑膜中促炎因子IL-1β的表达。室温平衡板条后，加入100μL待测样品或者不同浓度的标准品，37℃条件下孵育90min。洗板5次，加入100μL生物素化抗体工作液，37℃条件下孵育60min。洗板5次，加入100μL酶结合物工作液，37℃条件下避光孵育30min。洗板5次，加入100μL显色底物(TMB)，37℃条件下避光孵育15min。最后加入100μL终止液，然后立即测定各孔在450nm波长处的吸光度值。利用绘制的标准曲线计算出各血清样本中的IL-1β浓度。

根据欣博盛生物科技有限公司ELISA试剂盒说明书检测各组大鼠滑膜中促炎因子TNF-α的表达。基本操作步骤与上述IL-1β试剂盒类似。

E.肝损伤相关生化指标试剂盒检测：

根据南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒说明书检测各组大鼠血清和HepG2细胞培养液中谷丙转氨酶(ALT/GPT)的活力。首先测定孔和对照孔各加入20μL基质液，在测定孔中加入5μL待测样品，37℃条件下孵育30min。再在测定孔和对照孔各加入20μL2,4-二硝基苯肼液，在对照孔中加入5μL待测样品，37℃条件下孵育20min。最后测定孔和对照孔各加入200μL0.4mol/L氢氧化钠液，轻轻水平摇动96孔板混匀，室温放置15min。然后立即测定各孔在510nm波长处的吸光度值。利用绘制的标准曲线计算出各血清样本中的谷丙转氨酶活力。

根据南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒说明书检测各组大鼠血清和HepG2细胞培养液中谷草转氨酶(AST/GOT)、碱性磷酸酶(AKP)和乳酸脱氢酶(LDH)的活力。基本操作步骤与上述谷丙转氨酶试剂盒类似。

F.代谢组学的初步研究：

①生物样本的预处理：

(1)血清样本预处理

取冷冻保存的血清样本，室温解冻。取50μL血清，加入乙腈150μL，内标(L-2-氯苯丙氨酸，1mg/mL)10μL，混合液涡旋1min，置4℃冰箱放置10min，13000rpm/min离心10min，各个样品等量取200μL上清液，氮气吹干，用100μL初始比例的流动相复溶，超声5min后，于4℃下13000rpm/min离心10min，上清液转移至自动进样瓶中进行UPLC-QTOF-MS/MS分析。

(2)肝脏样本预处理

取肝脏样本，准确称取约0.1g,加入1.0ml生理盐水匀浆,取150μL匀浆液，加入乙腈450μL，内标(L-2-氯苯丙氨酸，1mg/mL)80μL，混合液涡旋1min，置4℃冰箱放置10min，13000rpm/min离心10min，各个样品等量取300μL上清液，氮气吹干，用100μL乙腈复溶，超声5min后，于4℃下13000rpm/min离心10min，上清液转移至自动进样瓶中进行UPLC-QTOF-MS/MS分析。

(3)质控样本(QC)的制备

每个血清(肝脏匀浆)样本取10μL混合，同血清(肝脏)样本预处理方法，得到血清(肝脏)质控样本。在分析过程中，待检测样本随机交叉进样，每7个样品后加一个质控样品来实时监测系统的稳定性，另外，加一个溶剂空白以消除样品残留造成的污染。

②液相色谱/质谱(LC/MS)分析条件：

Shimadzu LC-30A Series UHPLC系统，色谱条件：ACQUITY UPLC^TM HSS T3色谱柱(2.1mm×150mm,1.8μm)；流动相：A(0.1％甲酸水溶液，v/v)，B(0.1％甲酸乙腈溶液)。梯度洗脱，血清和尿液样本洗脱程序分别见表1；流速为0.25mL/min；柱温为35℃；样品盘温度为15℃；进样体积为2μL。

表1血清和肝脏样本流动相梯度洗脱程序

质谱条件：AB SCIEX TripleTOF^TM 5600+系统，氮气作雾化气和锥孔气，电喷雾离子源采用正离子(ESI+)扫描模式，质量扫描范围为50-1000m/z。质谱参数设置见表2，应用Analyst TF系统(version 1.6,AB SCIEX)采集数据，采用Peak View软件(version 2.0,ABSCIEX)进行数据分析。

表2质谱参数设置

③多元数据分析和统计学处理：

经质谱采集的原始数据经AB SCIEX公司的MarkerView 1.2.1软件进行初步处理，包括：数据的读取、色谱峰的识别、峰对齐、峰过滤、内标校正、归一化等步骤。经过以上处理后，导出TXT文本格式的三维矩阵(样品名，归一化后的峰面积，保留时间-质荷比)，在SIMCA-P 14.1软件中进行多元统计分析。

(5)统计学分析：

数据使用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 5软件进行统计学分析，采用mean±SEM表示。两组独立样本的均值比较使用Student's-t检验，两组以上分析利用单因素方差分析。设α＝0.05，*P＜0.05表示具有显著性差异，**P＜0.01表示差异极显著。

2.试验结果

(1)灵仙新苷和雷公藤甲素合用对CIA大鼠体重和关节炎状态的影响

造模之前各组大鼠状态活跃，粪便正常，体重稳步增长。如附图3所示：在激发致敏后，空白对照组大鼠体重逐渐增加，各致敏组大鼠体重逐渐降低，分组给药后，各药物组大鼠体重均逐渐增加，并始终重于模型组大鼠；激发致敏后，各致敏组大鼠的足肿胀度相比空白对照组显著增加，第18天开始给药后，各给药治疗组大鼠足肿胀度增长缓慢，随着给药时间的延长，足肿胀度均有所下降；从第18天起，各组关节炎指数评分均在4分以上，模型组关节炎指数评分和空白对照组相比具有显著性差异(p＜0.01)，第18天给药后，各治疗组关节炎指数评分增长缓慢，随着给药时间的延长，关节炎指数评分呈现不同程度的下降趋势，且始终低于模型组的关节炎指数评分。该实验说明灵仙新苷和雷公藤甲素合用时虽然没有显著增强其抗RA的疗效，但与单用雷公藤甲素时疗效相近。

(2)灵仙新苷和雷公藤甲素合用对CIA大鼠滑膜中炎性因子表达的影响

ELISA试剂盒检测大鼠滑膜中促炎因子IL-1β和TNF-α的表达，如附图4所示，发现CIA模型大鼠滑膜中IL-1β和TNF-α高表达，而药物干预组中两种炎性因子的表达均发生回调，且药物干预组与模型组的表达具有显著性差异。说明灵仙新苷和雷公藤甲素合用时虽然没有显著增强其抗炎的功效，但与单用雷公藤甲素时疗效相近。

(3)灵仙新苷和雷公藤甲素合用对CIA大鼠肝脏组织形态的影响

大鼠处死后，取大鼠肝脏进行H&E染色。如附图5的病理切片照片显示，空白对照组大鼠的肝细胞正常，无变性、坏死，肝窦无扩张充血，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，肝小叶结构完整；TP组肝细胞出现融解坏死，可见核固缩、核碎裂，胞浆空泡变性，间质有炎症细胞浸润，有嗜酸小体形成；联合给药组肝细胞核质轻度浓缩，形态趋于正常，肝细胞损害较轻。上述结果说明，灵仙新苷干预治疗可以明显改善雷公藤甲素造成的肝损伤。

(4)灵仙新苷和雷公藤甲素合用后降低肝损伤相关生化指标的表达

谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)等广泛存在于细胞中，正常时只有少量释放入血中，但当肝细胞受到损伤时，它们会大量释放入血中，使血清中这些酶的活力大幅增加，它们都被认为是诊断肝损伤的重要指标。如附图6所示，动物实验结果表明，雷公藤甲素组血清中这些酶的活力相比于空白对照组显著上升，而联用灵仙新苷后，血清中这些酶的活力都不同程度的发生了下降。如附图7所示，细胞实验的结果也验证了这一结论。

以上事实表明，雷公藤甲素组的血清和细胞培养液中各种肝损伤相关的生化指标明显升高，而药物灵仙新苷可以在一定程度上降低这些酶在血清和细胞培养液中的活力，发挥保肝作用从而减轻雷公藤甲素造成的肝损伤。

(5)灵仙新苷和雷公藤甲素联用后大鼠血清和肝脏的代谢轨迹发生改变

大鼠的代谢轮廓受多种因素的影响，个体差异、饮食、生长状态都会干扰其代谢产物，而影响分析的准确性。为了降低组内差异对分类的影响，而突出组间差异，获取和肝损伤相关的代谢信息，采用有监督模式的OPLS-DA统计分析方法对各组大鼠的代谢轮廓进行分析。该方法是基于偏最小二乘法的降噪方法，可以消除与分类变量相关的正交成分(外界干扰因素的数据信息)，获取有效的数据信息，提高模型的准确度和有效性。附图8(A)为正离子扫描模式下空白对照组与雷公藤甲素组血清和肝脏样本的OPLS-DA图，可以看出两组代谢轨迹明显区分开来，模型的拟合准确性和重现性较高(R²Y>0.98，Q²>0.79)。

建立有监督模式的PLS-DA模型，分析空白对照组、雷公藤甲素组和联合给药组的代谢轨迹。由附图8(B)可以看出，雷公藤甲素组和空白对照组的代谢轮廓有着显著差异，说明雷公藤甲素给药大鼠的代谢轮廓和正常鼠相比已经发生了改变。联用灵仙新苷后，联用组代谢轨迹远离雷公藤甲素组代谢轨迹，向空白对照组靠近。同时可以看出，联用灵仙新苷治疗后，高剂量组的代谢轮廓更靠近空白对照组，低剂量组的代谢轨迹远离模型组，有向空白对照组靠近的趋势。由结果可知，给予灵仙新苷可以改善雷公藤甲素给药大鼠的代谢轮廓，使其向空白对照组靠近。模型的拟合准确性和重现性较高(R²Y>0.99，Q²>0.60)。

(6)灵仙新苷影响色氨酸代谢通路相关产物的含量

色氨酸是人体内的必需氨基酸，其分解途径有两个：5-羟色胺途径和犬尿氨酸途径。少部分色氨酸通过色氨酸羟化酶生成5-羟色胺，约95％的色氨酸在吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)或色氨酸-2,3-双加氧酶(TDO)的作用下生成犬尿氨酸(Kyn)。犬尿氨酸也有两条代谢通路，大部分在犬尿氨酸羟化酶的作用下生成3-羟犬尿氨酸(3-HK)，继而由犬尿氨酸酶(KYNU)催化水解生成3-羟邻氨苯甲酸(3-HAA)，最后经过多级酶促反应生成喹啉酸(Quin)、吡啶羧酸类及尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等活性分子参与体内各种生理过程；另外一条通路是在犬尿氨酸氨基转移酶的作用下生成犬尿喹啉酸(KA)。同时，色氨酸也能在各种酶的催化下形成一系列的吲哚类物质，参与氧化应激过程。

在PeakView 1.2中，使用XIC Manager功能，输入色氨酸代谢通路中相关物质的分子式，得到各组各样本中这些物质的峰强度，使用内标峰强度进行归一化后，分析这些代谢物在联合用药组中的回***况，即对代谢物在雷公藤甲素组及联合给药组中的峰强度进行Q检验和Mann-Whitney U检验，剔除离群值并判断是否有显著性差异，其中p＜0.05的代谢物被认为是联合用药调节机体后回调的代谢物。由附图9所示的实验结果可知，在肝脏中，色氨酸(Trp)、吲哚丙烯酸(IA)、NAD和NADP等代谢物在雷公藤甲素组中的含量相比于空白对照组都发生了显著性下降，而在联合用药组，这些代谢物的水平都发生了显著性的上升。说明灵仙新苷可能通过影响色氨酸代谢来改善雷公藤甲素造成的肝损伤。

实施例2

灵仙新苷100mg，与淀粉50mg、糊精50mg混合，用适量30％乙醇作湿润剂，制成软材，常规方法制粒，加入硬脂酸镁混合，制成片剂。

实施例3

灵仙新苷50mg，与淀粉70mg、糊精10mg、糖粉10mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，常规方法制粒，装入硬胶囊中，制成胶囊剂。

灵仙新苷50mg，与微晶纤维素50mg、微粉硅胶30mg、乳糖20mg混合，用70％乙醇作润湿剂，制成软材，常规方法制粒，装入硬胶囊中，制成缓释胶囊。

实施例4

灵仙新苷50mg，与淀粉70mg、糊精10mg、糖粉10mg混合，用30％乙醇作润湿剂，制成软材，湿法制粒制备成颗粒剂。

实施例5

灵仙新苷100mg，与淀粉50mg、滑石粉5mg混合采用常规技术制成散剂。

实施例6

灵仙新苷100mg，与糖粉20mg、水5mg采用常规技术制成糖浆剂。

实施例7

灵仙新苷100mg，与糖粉20mg、水5mg采用常规技术制成糖浆剂，再加入淀粉70mg采用常规技术制备成丸剂。

实施例8

实施例1中的灵仙新苷粉末分别用实施例2-7所制备的片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂、丸剂替代，将制剂溶于无菌蒸馏水中，充分溶解，配成所需浓度的灵仙新苷澄清溶液，其余步骤不变，按照实施例1进行实验，实验结果与实施例1相同，灵仙新苷组合物的制剂能够改善雷公藤甲素造成的肝损伤。