一种质谱探针在sgk1蛋白活性检测中的应用
阅读说明：本技术 一种质谱探针在sgk1蛋白活性检测中的应用 (Application of mass spectrometry probes in SGK1 protein activity detection ) 是由 王毅 程翼宇 张舒静 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：发明公开了一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测以及在筛选SGK1蛋白抑制剂中的应用。该质谱探针是氨基酸序列为Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Ala-Ala-Ser-Phe-Ala-Glu的多肽。本发明提供的质谱探针不仅能被SGK1磷酸化,生成磷酸化产物,同时具有较高的质谱响应,质谱检测准确度高,能够准确反应SGK1的活性,可用于检测SGK1蛋白活性,还可以用于筛选SGK1抑制剂。(The invention discloses application of mass spectrometry probes in SGK1 protein activity detection and SGK1 protein inhibitor screening, wherein the mass spectrometry probes are polypeptides with amino acid sequences of Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Ala-Ala-Ser-Phe-Ala-Glu.)
技术领域
本发明属于药物筛选与评价方法领域，具体涉及一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测中的应用。
背景技术
血清和糖皮质激素诱导的蛋白激酶1(serum glucocorticoid-induciblekinase1，SGK1)，是丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，是AKT的同源异构体。SGK1在许多物种中都有表达，哺乳动物中几乎所有组织都有表达SGK1，但表达水平差异很大。SGK1在大多数细胞中表达含量较低，但在一定的病理生理条件下，如糖皮质激素或盐皮质激素过量、TGF-β释放引起的炎症、高血糖、细胞收缩和缺血等，SGK1的表达显著升高。
SGK1刺激多种肾小管离子通道和转运体，参与调节肾电解质***，其对肾盐***和盐摄入量的影响有望影响血压控制。近年来发现SGK1蛋白活性与如高血压、肥胖、心血管疾病、代谢综合症等疾病的发生发展密切相关。过多的SGK1表达和活性会导致多种疾病的病理生理学，包括高血压、肥胖、糖尿病、血栓形成、中风、纤维化疾病、***和肿瘤生长等。SGK1蛋白抑制剂EMD638683被认为在包括代谢综合征和肿瘤生长方面发挥重要功能，在临床靶向治疗中显示一定的治疗前景，如申请号为CN201410535640.2的专利申请文献以及“Sgk1-Dependent Stimulation of Cardiac Na+/H+Exchanger Nhe1 by Dexamethasone”均公开了一种新型SGK1抑制剂EMD638683在制备治疗急性心肌梗死药物中的应用。
现有的SGK1抑制剂筛选方法主要包括计算机辅助药物发现(CADD)、荧光偏振、Elisa法等。目前关于用质谱探针检测SGK1活性的实例尚未有报道，质谱探针具有专属性高，灵敏度高等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高质谱响应的质谱探针的应用，其作为酶底物，被SGK1识别，再通过质谱测定磷酸化反应前后磷酸化产物的量来用于检测SGK1的活性，进一步用于筛选SGK1蛋白抑制剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测试剂中的应用，所述质谱探针为氨基酸序列为Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Ala-Ala-Ser-Phe-Ala-Glu的多肽。
本发明还提供了上述质谱探针在筛选SGK1蛋白抑制剂中的应用。
上述质谱探针由可被SGK1识别的多肽组成，所述多肽的氨基酸序列为：半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸(SEQID NO.1)。
SGK1磷酸化位点为丙氨酸与苯丙氨酸之间的丝氨酸，因此，上述质谱探针的磷酸化产物为Cys-Lys-Arg-Pro-Arg-Ala-Ala-p-Ser-Phe-Ala-Glu，其中p为磷酸化基团。因此通过测定反应前后磷酸化产物的量，即可检测SGK1的活性，因此，可用于筛选SGK1蛋白抑制剂。
所述质谱探针的结构如下式(Ⅰ)所示：
上述质谱探针采用固相法合成，具体方法包括：先用二氯甲烷溶涨树脂，依次加入保护氨基酸原料和N,N-二异丙基乙胺反应，反应结束后脱保护；重复上述步骤依次连接氨基酸后制得。
具体方法进一步包括：先用二氯甲烷溶涨树脂，加入3倍摩尔过量的保护氨基酸原料，再加入5倍摩尔过量的N,N-二异丙基乙胺反应，反应结束后加20％哌啶-二甲基甲酰胺溶液进行脱保护；重复上述步骤依次连接氨基酸后制得。
所述的树脂为2-Chlorotrityl Chloride Resin。连接氨基酸过程中的缩合剂为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的质谱探针能够被SGK1蛋白识别并发生磷酸化反应，其磷酸化产物具有较高的质谱响应，质谱检测准确度高，能够准确反应SGK1蛋白的活性，实现对SGK1蛋白活性的检测，还能进一步用于筛选SGK1蛋白抑制剂。
附图说明
图1为SGK1质谱探针纯度分析的HPLC色谱图。
图2为SGK1质谱探针的质谱结果图。
图3为SGK1质谱探针检测SGK1蛋白活性的检测图。
图4为SGK1质谱探针对SGK1的检测灵敏度考察图。
图5为EMD638683浓度与其对SGK1蛋白抑制效应的量效关系图；其中，LogConcentratin of EMD638683(nM)表示EMD638683浓度(nM)的对数，inhibition rate(％)表示抑制率(％)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
实施例1：SGK1质谱探针的合成
本实施例SGK1质谱探针的合成方法，主要包括以下步骤：
一.树脂溶涨
称取取代度为0.4mmol/g的0.6g 2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂，将树脂放入反应管中，加DCM(二氯甲烷)(15ml/g)，振荡30min.
二.接第一个氨基酸
通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Glu-OH氨基酸，再加入5倍摩尔过量的DIEA，最后加入少量DMF溶解，振荡1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。
三.脱保护
加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加15ml20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min.
四.检测
抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加热5min,变深蓝色为阳性反应。
五.洗
DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次
六.缩合
保护氨基酸Fmoc-L-Ala(Boc)-OH三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA五倍过量.反应60min。反应后DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。重复以上操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸，连接完成后用甲醇洗4次，抽干10min。
七.切割
配制切割液(TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％)，从树脂上切割多肽，即得粗品探针。
八、用HPLC纯化多肽
用HPLC纯化粗品探针，将纯化后的溶液冻干，密封包装，-20℃保存待用。
实施例2：SGK1质谱探针在SGK1蛋白活性检测中的应用
缓冲液：Tris-HCl(50mM，pH 7.5，含10mM MgCl2、400μM ATP，2mM DTT，5mMβ-Glycerophosphate)补齐至100μL
样品组1：加入50μL CKRPRAASFAE(50μM)，以缓冲液补齐至100ul；
样品组2：加入25μL SGK1(0.1mg/mL)、50μL CKRPRAASFAE(50μM)、以缓冲液补齐至100ul；
样品组3：加入25μL SGK1(0.1mg/mL)、50μL CKRPRAASFAE(50μM)、抑制剂EMD638683(10μM)，以缓冲液补齐至100ul；
三个样品组均在30℃孵育下反应1小时后加200μL甲醇(含0.1％TFA)终止反应，溶液涡旋、离心，取上清用于进样分析。
分析条件为：Agient 1100液相-1946D单四极杆质谱联用仪；色谱柱，Zorbax SBC18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.1％三氟乙酸-水(A)和0.1％三氟乙酸-乙腈(B)；流速0.6mL/min；洗脱梯度为0-15min，13-28％B；15-16min，28-100％B；进样量，30μL。柱温30℃。检测结果如图3所示。
由图3可见，SGK1蛋白加入前，体系中仅含质谱探针，产物峰面积为0；而SGK1蛋白加入后，产物峰面积明显增加；当体系中加入SGK1蛋白抑制剂后，产物峰面积降低。
实施例3：SGK1质谱探针对SGK1的检测灵敏度考察
取50μL质谱探针CKRPRAASFAE(终浓度为25μM)，不同浓度SGK1(终浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μg/mL)，以50mM Tris-HCl(pH＝7.5，含10mM MgCl2、400μMATP，2mM DTT，5mMβ-Glycerophosphate)补齐至100μL，30℃孵育1h后加200μL甲醇(含0.1％TFA)终止反应，溶液涡旋、离心，取上清用于进样分析。按照实施例2所述的分析方法进行分析，检测结果见图4。
由图4可见，质谱探针CKRPRAASFAE对SGK1的检测限为0.05μg/mL，线性范围0.05μg/mL-0.5μg/mL(R2>0.97)。
实施例4：SGK1质谱探针在筛选SGK1抑制剂中的应用
取50μL质谱探针CKRPRAASFAE(终浓度为25μM)，25μL SGK1(终浓度为0.25μg/mL)，不同浓度EMD638683(终浓度分别为78.1，156，313，625，1250，2500，5000，10000nM)，以50mMTris-HCl(pH＝7.5，含10mM MgCl2、400μM ATP，2mM DTT，5mMβ-Glycerophosphate)补齐至100μL，30℃孵育1h后加200μL甲醇(含0.1％TFA)终止反应，溶液涡旋、离心，取上清用于进样分析。按照实施例2所述的分析方法进行分析，检测结果见图5。
由图5可见，随着EMD638683终浓度的提高，EMD638683对SGK1蛋白的抑制效应也逐渐增加，IC50＝728nM；表明质谱探针CKRPRAASFAE能较好地反映SGK1蛋白的抑制，可用于SGK1抑制剂的筛选。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种质谱探针在SGK1蛋白活性检测中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Lys Arg Pro Arg Ala Ala Ser Phe Ala Glu
1 5 10