一种度拉糖肽的生物学活性测定方法
阅读说明：本技术 一种度拉糖肽的生物学活性测定方法 (Biological activity determination method of dolastatin ) 是由 郭宣诚 周亮 荣亚雯 王秀梅 张阳 于 2018-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明以细胞内3’,5’-环腺苷酸(cAMP)水平的变化作为检测指标,采用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法测定度拉糖肽生物学活性。通过培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F,分别加入稀释后的度拉糖肽对照品溶液和供试品溶液,用试剂盒检测刺激后细胞内cAMP水平变化,用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU),然后利用统计软件拟合实验数据,通过公式计算供试品的生物学活性。该方法能简便、快速、准确地检测度拉糖肽生物学活性的变化,其准确性和重复性符合生物制品生物学活性测定方法的要求。(The invention uses the change of intracellular 3 ', 5' -cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as a detection index, and adopts a cAMP-dependent protein kinase A activity analysis method to measure the biological activity of the dulcoside. The method comprises the steps of culturing rat insulinoma cells RIN-m5F, adding diluted dulaglutide reference substance solution and test substance solution respectively, detecting the change of cAMP level in cells after stimulation by using a kit, reading relative chemiluminescence units (RLU) by using a super-sensitive chemiluminescence detection module of a multifunctional microplate reader, fitting experimental data by using statistical software, and calculating the biological activity of the test substance by using a formula. The method can simply, rapidly and accurately detect the change of the biological activity of the dolastatin, and the accuracy and the repeatability of the method accord with the requirements of a biological activity determination method of biological products.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GLP-1多肽类似物如度拉糖肽的生物学活性的测定方法。
发明背景
糖尿病在世界范围内日益严重威胁人类健康。胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide-1)，简称GLP-1，是肠道L细胞分泌的一种多肽类激素，具有血糖依赖性促进胰岛素分泌、保护胰岛β细胞、延迟胃排空降低食欲等功能，由于它对胰岛素的刺激具有葡萄糖依赖性，因此不引发低血糖症状，是一种安全的降糖药物。
天然GLP-1因半衰期短(仅1～2分钟)不适合临床应用。礼来公司对GLP-1进行改造，利用IgG4Fc片段融合GLP-1蛋白得到度拉糖肽(dulaglutide)。度拉糖肽的氨基酸序列如图1所示，第1-31 位为GLP-1部分，32-46位为接头，47-275位为Fc部分。相对于天然GLP-1(7-37)，度拉糖肽的GLP-1类似物部分有3个位点的替换，第8位的替换降低内源性二肽基肽酶IV(DPP-IV)失活该类似物的速率，第22位的替换降低了分子聚集的潜力，第36位的替换降低了融合蛋白在体内诱导中和抗体的免疫应答风险。度拉糖肽的Fc部分相对于天然IgG4Fc序列替换了5个位点，第233位、234位和235 位的替换有助于消除Fc结合Fc受体(FcγR)和补体的能力，从而降低Fc生物效应功能；第297位替换去除了Fc区域中的N-糖基化位点，消除Fc残留生物效应活性；由于哺乳动物细胞内蛋白酶会切割部分表达产物的C末端赖氨酸，构建C末端赖氨酸缺失的突变体能够避免表达产物的异质化。
礼来开展了5项3期临床试验(AWARD trials)。一项3期临床试验(AWARD-2)结果显示，对于服用二甲双胍和格列美脲的2型糖尿病患者，度拉糖肽给药52周后糖化血红蛋白(血糖)下降水平在统计学上优于Lantus(甘精胰岛素)。其他三项AWARD临床试验显示度拉糖肽控制糖化血红蛋白水平优于Byetta(艾塞那肽)。基于其临床III期研究结果，度拉糖肽已获得FDA批准上市，用于治疗2型糖尿病，每周给药1.5mg。度拉糖肽半衰期长达1周，每周只需皮下注射1次，即可有效控制血糖。
目前国内有多家公司在开发度拉糖肽。在药品开发时，生物制品的生物学活性是生物制品质量评价的重要指标，因此度拉糖肽的生物学活性测定方法是度拉糖肽质量研究的重点之一。目前度拉糖肽生物学活性欠缺简便、快速、准确的测定方法。
度拉糖肽属于GLP-1类似物，它与细胞膜上GLP-1受体(G蛋白偶联受体)相互作用后，细胞内腺苷酸环化酶(adenylate cyclase)被激活，导致胞内cAMP水平升高。胞内cAMP水平检测法被广泛用于定量测定GLP-1及其类似物的体外生物学活性，属于细胞基础的受体结合法。诺和诺德公司在其申请的专利CN97198413.1中涉及到检测GLP-1衍生物的生物活性，测定了它们在表达人胰腺GLP-1受体的细胞系内刺激cAMP形成的能力，使用了幼仓鼠肾细胞(BHK) 和闪烁亲近测定法(说明书第61/62页)，但未公开该方法可适用于度拉糖肽。由于表达人胰腺GLP-1受体的幼仓鼠肾细胞难以获得；而且闪烁亲近测定法使用了放射性同位素，对人体有危害，因此需要开发一种操作简单、安全可靠的度拉糖肽生物活性测定方法。
发明内容
本发明提供了一种利用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法测定度拉糖肽生物学活性的新方法，从而解决了度拉糖肽生物学活性测定的难题。
目前实验中，大多数使用的是放射性同位素测定法和cAMP酶联免疫反应分析法来测定胞内cAMP水平。但是放射性同位素对人体有危害，实验操作不方便。而cAMP酶联免疫反应分析法通过ELISA 方法测定，该方法步骤繁琐，整个实验过程周期较长，而且实验误差相对较大，因而结果不是非常理想。
本申请发明通过大量实验和对比研究后，第一次创造性地将cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法原理应用于度拉糖肽的生物学活性测定。cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法原理是：裂解细胞释放出胞内cAMP，cAMP激活蛋白激酶A催化蛋白质磷酸化反应而消耗ATP。ATP的减少反映为化学发光信号的减弱。cAMP水平越高，蛋白激酶A的活性就越高，消耗ATP更多，从而化学发光信号越弱。
发明人发现相比于cAMP酶联免疫反应分析法，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法更为方便，实验步骤少，试验结果更为精确，误差相对较小，因而是一种比较理想的测定胞内cAMP水平的方法。
因而，本发明建立了一种度拉糖肽生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤：
(1)分别制备度拉糖肽对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；
(2)培养大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F后，加入步骤(1)中制备的对照品及供试品溶液刺激细胞；
(3)用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测度拉糖肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪的化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)。
(4)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，利用统计软件拟合实验数据，得到度拉糖肽的剂量效应曲线，计算出供试品和对照品的半效稀释倍数，按照以下公式计算供试品的生物学活性：
式中Pr为对照品生物学活性，单位为U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为对照品预稀释倍数；
Es为供试品相当于对照品半效量的稀释倍数；
Er为对照品半效量的稀释倍数。
本发明步骤(1)中，度拉糖肽对照品溶液及供试品溶液根据其初始浓度进行预稀释，以使预稀释后得到度拉糖肽对照品和供试品的浓度接近或相同，由度拉糖肽对照品溶液及供试品溶液的初始浓度和最后设定的预稀释浓度确定度拉糖肽对照品溶液的预稀释倍数(Dr)和供试品溶液的预稀释倍数(Ds)。优选稀释后的度拉糖肽的浓度范围为0.0001～1mg/ml，更优选为0.001-0.5mg/ml，最优选为0.001～0.02mg/ml。
在预稀释的基础上，对度拉糖肽对照品和供试品进行进一步的稀释，制备得到系列浓度梯度的度拉糖肽对照品和供试品，稀释倍数范围为1倍至200万倍，在此范围内根据实验情况选择稀释的倍数。根据实验设计，可制备具有5至15个稀释浓度的度拉糖肽对照品溶液及供试品溶液，优选制备具有7至12个稀释浓度的度拉糖肽对照品溶液及供试品溶液。
在本发明的一个实施方案中，优选8个稀释浓度梯度，稀释倍数分别为32倍、64倍、128倍、256倍、1280倍、6400倍、32000倍和80万倍。
在本发明的另一个实施方案中，优选的7个稀释浓度梯度的稀释倍数分别为4倍，8倍，16倍，40倍，80倍，160倍，1600倍或10 倍，20倍，40倍，80倍，160倍，320倍，1600倍。
本发明步骤(1)稀释溶液为能维持pH范围7.2-9.5的、浓度为 1-100mM的缓冲溶液，优选PBS、DPBS、磷酸氢二钠缓冲液等磷酸盐缓冲液，更优选pH范围为7.2-8.5的、浓度为5-30mM的DPBS或磷酸氢二钠缓冲液，最优选为pH为7.2的DPBS溶液或pH为8.2、浓度为10mM的磷酸氢二钠缓冲液。
本发明步骤(2)所使用的动物细胞类型为对度拉糖肽的刺激有生理响应的大鼠胰岛瘤细胞RIN-m5F。RIN-m5F细胞为贴壁生长，其培养可选择预先铺在细胞培养板中，置25℃-45℃、1％-10％二氧化碳培养箱中静置培养2-5天。更优选为预先铺在平底96孔细胞培养板中，置37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养3天。在细胞培养板中铺细胞数量为1000-10000个细胞/孔，优选为5000-8000个细胞/孔。
步骤(2)中，RIN-m5F细胞在细胞培养器中培养后，吸去培养孔中上清，然后加入度拉糖肽药物刺激细胞，将细胞培养容器在 25-45℃放置1-30分钟；优选将细胞培养容器在37℃放置5-10分钟。
发明步骤(2)中，RIN-m5F细胞的培养可以在步骤(1)所述的度拉糖肽对照品和供试品溶液的配制之前、与其同时或者在其之后均可以，优选RIN-m5F细胞的培养在度拉糖肽对照品和供试品溶液的配制之前。在细胞培养好之后，再选择加入度拉糖肽样品进行刺激。
本发明步骤(3)中，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒可选择市场有售的相关试剂盒，优选Promega公司的cAMP-GloTM Max Assay试剂盒。所用的检测仪中，优选用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)。
本发明步骤(4)中，所用的统计软件可选择SPSS、Matlab、Origin、Graphpad Prism等，优选Graphpad Prism软件。进行实验数据拟合时，优选用四参数方程拟合实验数据。四参数方程的公式可表示为 Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))。拟合出度拉糖肽剂量效应曲线的四个参数Top，Bottom，LogEC50和HillSlope，可得到供试品和对照品的半效稀释倍数或半效浓度(EC50)，然后计算供试品的相对活性和生物学活性。
本发明所述方法简便、快速、准确，可检测度拉糖肽生物学活性的变化。酶联免疫反应分析法的检测耗时三至五个小时，该方法的检测耗时仅一小时。该方法的准确性和重复性符合生物制品生物学活性测定方法的要求。测试结果的回收率范围为80％～120％，平均值为 97％，RSD为11％，说明该方法的准确性和重复性较好。
附图说明
图1：度拉糖肽融合蛋白氨基酸序列图
图2：度拉糖肽剂量效应曲线
图3：实施例2度拉糖肽供试品的生物学活性
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中的RIN-m5F细胞购自美国标准生物品保藏中心 (ATCC)，白色平底96孔细胞培养板购自Costar，cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒采用Promega公司的cAMP-GloTMMax Assay试剂盒，实验过程参照该试剂盒说明书进行。
所述度拉糖肽原研制剂购自礼来公司，重组度拉糖肽蛋白原液根据CN200480015953.X所述方法制备。
所述试剂如无特别说明，均为市售产品。实施例中采用的方法如无特别说明，均采用本领域常规方法。
生物学活性按照以下公式计算：
式中Pr为对照品生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为对照品预稀释倍数；
Es为供试品相当于对照品半效量的稀释倍数；
Er为对照品半效量的稀释倍数。
实施例1
(1)取生长状态良好的RIN-m5F细胞，铺在白色平底96孔细胞培养板中，5000个细胞/孔，置37℃5％二氧化碳培养箱中静置培养三天。
(2)取度拉糖肽原液和度拉糖肽原研制剂进行预稀释，配制成浓度为0.015mg/ml的稀释液，然后配制浓度梯度，设置7个浓度点，稀释倍数为4倍，8倍，16倍，40倍，80倍，160倍，1600倍。
(3)吸去(1)步骤细胞孔中上清，加入度拉糖肽的浓度梯度刺激细胞，将细胞板在37℃放置5分钟。
(4)用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测(3)步骤的度拉糖肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)。
(5)以药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，用四参数方程拟合(4)步骤的实验数据，得到度拉糖肽的剂量效应曲线，图2说明该方法可检测度拉糖肽的生物学活性。
实施例2
(1)取生长状态良好的RIN-m5F细胞，铺在白色平底96孔细胞培养板中，5000个细胞/孔，置37℃、5％二氧化碳培养箱中静置培养三天。
(2)称取若干度拉糖肽供试品和对照品，用10mM磷酸氢二钠溶液(pH 8.2)溶解。根据称取量,0.015mg/ml，设置8个浓度点，稀释倍数为32倍，64倍，128倍，256倍，1280倍，6400倍，32000 倍，80万倍。
(3)吸去(1)步骤细胞孔中上清，加入度拉糖肽的浓度梯度刺激细胞，将细胞板在37℃放置5分钟。
(4)用cAMP依赖型蛋白激酶A活性分析法试剂盒检测(3)步骤的度拉糖肽刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪的超灵敏化学发光检测模块读取相对化学发光单位(RLU)。
(5)以稀释倍数为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，用四参数方程拟合(4)步骤的实验数据，得到度拉糖肽的剂量效应曲线，见图3，供试品的半效稀释倍数为636，对照品的半效稀释倍数为585，对照品的生物学活性为5.10万U/ml，根据供试品生物学活性计算公式，算得供试品生物学活性为5.54万U/ml。
实施例3
实验步骤与实施例2相同。已知供试品的活性为5.54万U/ml，测试该供试品的生物学活性五次，测试结果见表1。测试结果的回收率范围为80％～120％，平均值为97％，RSD为20％，说明该方法的准确性和重复性较好。
表1 准确性和重复性的验证
