阅读说明：本技术 一种检测组蛋白乙酰转移酶的传感器及制备方法 (Sensor for detecting histone acetyltransferase and preparation method thereof ) 是由 李金龙 程文婷 胡亮 易永祥 许传军 胡凯 张兆利 于 2019-11-18 设计创作，主要内容包括：组蛋白乙酰转移酶(HAT)在肿瘤发生发展过程中发挥了重要的作用,因此本发明构建了一种利用降低G-Quadruplex-Cu(II)金属酶活性的电化学方法来检测组蛋白乙酰转移酶。G-Quadruplex-Cu(II)有金属酶活性,能够产生很强的电化学信号,在有HAT存在的情况下,HAT能够催化底物肽乙酰化,产生大量的乙酰辅酶A,由于G-Quadruplex和乙酰辅酶A竞争性结合Cu(II),使电化学信号减弱,从而可以直接定量检测HAT,利用该法可以使HAT的检出限达到0.14nM。另外,本发明设计的检测方法因其不需要标记和使用抗体,仅仅使用价廉的DNA和Cu<Sup>2+</Sup>,从而大大降低了成本,更重要的是,电化学法操作简单,不需要复杂的修饰过程。(Histone Acetyltransferase (HAT) plays an important role in the process of tumorigenesis and development, so the invention constructs an electrochemical method for detecting histone acetyltransferase by reducing the activity of G-Quadruplex-Cu (II) metalloenzyme. G-Quadroplex-Cu (II) has metalloenzyme activity and can generate a strong electrochemical signal, HAT can catalyze acetylation of substrate peptide to generate a large amount of acetyl coenzyme A in the presence of HAT, and the electrochemical signal is weakened due to competitive combination of G-Quadroplex and acetyl coenzyme A with Cu (II), so that HAT can be directly and quantitatively detected, and the detection limit of HAT can reach 0.14nM by using the method. In addition, the detection method designed by the invention does not need to be marked and usedWith antibodies, only inexpensive DNA and Cu are used 2+ Thereby greatly reducing the cost, and more importantly, the electrochemical method is simple to operate and does not need a complex modification process.)

一种检测组蛋白乙酰转移酶的传感器及制备方法

技术领域

本发明涉及组蛋白乙酰转移酶检测领域，具体涉及一种检测组蛋白乙酰转移酶的传 感器及制备方法。

背景技术

组蛋白乙酰转移酶(HAT)对组蛋白赖氨酸的乙酰化作用是表观遗传标识系统中一个 典型的“组蛋白密码”，它可引起转录激活、DNA复制、组蛋白沉积和DNA修复。HAT 活化导致的异常基因沉默与许多疾病如神经系统疾病，癌症，代谢综合征的发病机制密 切相关，因此，确定HAT的活性和它们抑制剂的效力对基因转录的生化机制研究以及 抗癌药物的研发具有重要意义。

传统检测HAT活性的方法主要依靠放射自显影和放射性同位素，这些方法都会受到放射性物质的危害。目前已经发展了几种检测HAT的非放射性方法，如荧光法，比 色法和电化学分析法，上述方法大多依赖于乙酰化位点的抗体识别，所以存在一些固有 的缺点，如标记抗体的成本高，以及通过修饰纳米材料制备探针过于复杂。

目前有中国专利CN201910501021.4公开了一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的光电 化学生物传感器及其制备方法，包括：ITO电极，依次修饰在电极表面的剥离的WS2、 聚多巴胺、SMCC、辅酶A、phos-tag-biotin和streptavidin，该发明利用WS2良好的生 物兼容性和导电性，以及特异性识别的亲和素和生物素，实现光电信号的猝灭，提高组 蛋白乙酰转移酶的检测灵敏度，利用SMCC中的马来酰亚胺对CoA中的巯基的特异结 合和识别作用，提高组蛋白乙酰转移酶活性检测的特异性，该发明的检测方法简单，实 现了仪器小型化，且易于操作，仅对ITO电极表面进行简单的处理，即可实现对组蛋白 乙酰转移酶活性的检测。

目前，很有必要发明一种简单的方法检测HAT活性，不需要使用抗体和繁冗的修饰。

G-quadruplex-Cu(II)金属酶具有良好的过氧化物酶性能，可催化H₂O₂和TMB反应，产生较强的电化学信号，基于此，本发明开发了一种电化学方法，通过降低 G-quadruplex-Cu(II)金属酶活性来测定HAT活性，HAT可以催化蛋白质乙酰化，产生大 量CoA，因为CoA含有硫醇基，会竞争性结合Cu(II)，导致G-Quadruplex-Cu(II)金属酶 活性的降低，从而实现对HAT的检测。因此，该生物传感器的方法检测HAT活性具有 较高的灵敏度，且不需要繁冗的修饰。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种检测组蛋白乙酰转移酶的传感器及 制备方法。

首先，本发明提供一种检测组蛋白乙酰转移酶的传感器，该传感器的原理如下：如附图1所示，富含G碱基序列的信号探针(DNA S1)主要通过Au-S键自组装在电极上， 将CuCl₂滴入电极表面时，形成G-Quadruple x-Cu(II)，它具有金属酶活性，产生较强的 电化学信号，当存在HAT时，可以催化底物肽乙酰化，生成大量的CoA，将 G-Quadruplex-Cu(II)修饰电极浸入反应缓冲液中，由于G-Quadruplex与CoA竞争性结合 Cu(II)，使电流信号峰值变弱，实现HAT的定量检测。

然后，本发明还提供了上述传感器的制备方法,具体步骤如下：

(1)金电极处理

1)金电极(φ＝3mm)用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；

2)将步骤1)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液[V(H₂SO₄)：(30％H₂O₂)＝3：1]中2-20 min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；

3)再将步骤2)制备的电极用硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V 进行扫描直到获得稳定的信号；

优选地，金电极的直径为3.0mm；

优选地，硝酸具体为50％的硝酸；

优选地，硫酸的浓度为0.5M；

(2)制备DNA自组装电极

1)将步骤1制备成功的金电极浸入DNA固定缓冲液中冲洗电极三次，

其中，DNA固定缓冲液包含1-3μM的DNA S1(SEQ.ID.NO1,5′-TGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-3′)，95℃加热5分钟后，冷却至室温，制得浸泡电极；

优选地，DNA S1的浓度为2μM；

2)用含有0.5-2mM MCH的水溶液处理步骤(2)-1)中的准备电极10-30分钟， 避免非特异性吸附，再用10μL含50μM CuCl₂的溶液滴加在上述电极表面孵育90分钟， 制得孵育电极；

优选地，MCH的浓度为1mM；

优选地，用MCH的水溶液处理电极15分钟；

3)用Tris-HCl(10mM)和去离子水冲洗步骤(2)-2)制得的孵育电极，去除多余 的CuCl₂，用氮气吹干，即可制得DNA自组装电极；

优选地，Tris-HCl浓度为10mM；

(3)HAT活性测定

1)将含不同浓度p300,500μMAc-CoA,200μM底物肽的1×反应缓冲液(pH值7.4) 置于20-35℃孵育50-100分钟，得反应缓冲液；

优选地，反应缓冲液为50-200μL；

更优选地，反应缓冲液100μL；

优选地，反应缓冲液pH为7.4；

优选地，孵育温度为30℃；

优选地，孵育时间为80分钟；

2)将步骤(2)制得的DNA自组装电极浸入步骤(3)-2)反应缓冲液中10-40min， 最后用5-20mM Tris-HCl冲洗电极，即可制得检测组蛋白乙酰转移酶的传感器，可用于 组蛋白乙酰转移酶的电化学检测；

优选地，制得的DNA自组装电极浸入步骤(3)-2)反应缓冲液中30min；

优选地，用Tris-HCl冲洗电极的Tris-HCl浓度为10mM；

其次，本发明还提供了一种用上述检测组蛋白乙酰转移酶的传感器检测蛋白乙酰转 移酶的检测方法，具体如下：

采用传统的三电极系统对CHI660D恒电位器进行电化学检测；

优选地，差分脉冲伏安法(DPV)在0.1mPBS中进行；

更优选地，PBS溶液具体含1.0mM过氧化氢和0.2mM对苯二酚；

具体地，DPV：脉冲周期，0.2s；振幅，0.05；扫描范围，-0.4-0.1V；

具体地，电化学阻抗谱(EIS)实验：偏置电位，0.232V；

具体地，频率范围：0.1Hz～10kHz；振幅：5mV。

最后，本发明还提供了一种将上述检测组蛋白乙酰转移酶的传感器和用该检测器检 测蛋白乙酰转移酶的检测方法在检测组蛋白乙酰转移酶中的应用。

本发明有益效果

(1)本发明可以直接定量检测HAT，利用该法可以使HAT的检出限达到0.14nM。

(2)本发明设计的检测方法因其不需要标记和使用抗体，仅仅使用价廉的DNA和Cu²⁺，从而大大降低了成本。

(3)本发明电化学法操作简单，不需要复杂的修饰过程。

附图说明

图1为传感系统的工作原理图。

图2为试验例1中的交流阻抗图谱。

图3为试验例2中检测条件优化试验结果图。

图4为试验例3中最优试验结果图。

图5为试验例4中选择性试验结果图。

图6为试验例5中最优试验结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明所用化学试剂具体为：

本实验中所用的DNA寡核苷酸(RGKGGKGLGKGGAKA)是由上海生工生物技术有 限公司合成的，粉末状，纯度大于95％；

高效液相色谱法纯化的寡核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示：DNA S1，5′ -TGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-3′，由上海生工生物技术有限公司合成；

CuCl₂,、人p300(HAT)、MCH、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙酰辅酶A(Ac-CoA)和漆 树酸购自Sigma公司(中国上海)；

本发明将肽粉溶解于10mM的Tris-HCl缓冲液(PH7.4)中稀释；寡核苷酸用10mM 的Tris-HCl缓冲液(PH7.4)稀释，配成100μM的储备液；

本发明用于稀释所有溶液的超纯水产自纯水系统(Milli-Q)，纯化后的纯度达到金标 准电阻18MΩ·cm。

实施例1金电极处理和DNA自组装

金电极(直径3.0mm)的制备，先将金电极(φ＝3mm)用氧化铝粉末抛光， 然后浸泡在水虎鱼溶液[V(H₂SO₄)：(30％H₂O₂)＝3：1]中10min消除吸附的有机物，并 用去离子水彻底清洗，再用50％硝酸浸泡20min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极6min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法(CV)从0到1.6V 进行扫描直到获得稳定的信号。

再将制备成功的金电极浸入DNA固定缓冲液中冲洗电极三次，DNA固定缓冲液 包含2μM的DNAS1，具体序列如SEQ.ID.NO.1所示：5′-TGGGTAGG GCGGGTTGGGTTTTTT-3′，95℃加热5分钟后，冷却至室温，之后用含有1mM MCH 的水溶液处理电极15分钟，避免非特异性吸附，再用10μL含50μM CuCl₂的溶液滴 加在上述电极表面孵育90分钟，最后，用Tris-HCl(10mM)和去离子水冲洗电极，去除 多余的CuCl₂，用氮气轻轻吹干。

实施例2HAT活性测定

HAT活性测定采用以下步骤进行，首先，将100μL含不同浓度p300, 500μMAc-CoA,200μM底物肽的1×反应缓冲液(pH值7.4)置于30℃孵育80分钟，之后， 将用G-Quadruplex-Cu(II)修饰的金电极浸入上述反应缓冲液中30min，最后用10mm Tris-HCl冲洗电极三次，进行电化学检测。

实施例3电化学检测

采用传统的三电极系统对CHI660D恒电位器进行电化学检测，实验参数如下：差分脉冲伏安法(DPV)在0.1mPBS(含1.0mM过氧化氢和0.2mM对苯二酚)中进行。 DPV：脉冲周期，0.2s；振幅，0.05；扫描范围，-0.4-0.1V。

电化学阻抗谱(EIS)实验：偏置电位，0.232V；频率范围：0.1Hz～10kHz；振幅：5mV。

试验例1生物传感界面的表征

为验证修饰电极的成功制备，本试验例选用电化学阻抗谱法(EIS)在5.0mM新鲜制备的[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中的不同电极来验证修饰过程，如图2所示，裸金电极呈现一 直线(曲线a)，表明电极电导率高，由于带负电荷的DNA对[Fe(CN)6]^3-/4-的排斥作用， DNA S1通过金硫键修饰在电极表面后，EIS图谱中出现一个小半圆(曲线b)，表明DNA S1被固定在电极上，当用MCH处理修饰电极时，半圆的直径进一步增大(曲线c)，这 是由于生物大分子阻碍了电子的转移。

试验例2检测条件优化

为了获得最佳传感性能，以下参数被优化，(A)CuCl₂浓度；(B)CuCl₂和 G-quadruplex的反应时间；(C)HAT反应时间；(D)G-quadruplex-Cu(II)和CoA的孵育时 间；各自数据和图形如图3。实验结果表明，以下实验条件最佳：(A)CuCl2的最佳实验 浓度是50μM；(B)CuCl₂和G-quadruplex的最佳反应时间大约90分钟；(C)HAT最佳 反应时间大约80分钟；(D)G-quadruplex-Cu(II)和CoA的最佳孵育时间大约30分钟。 试验例3HAT活性的电化学检测

采用最优实验条件并用DPV法研究不同浓度的HAT，从图4中可以看出，电化学 信号随着HAT浓度的增加而减小。从0.5到150nM范围内，电流峰值信号与HAT浓度 呈负相关，根据信噪比3(S/N＝3)，计算检测限为0.14nM，这与现有技术相似，甚至 优于现有技术。本实施例模拟了该曲线的方程式为：y＝-1.31x+7.08，相关系数为R²＝0.992。 因此，本发明得到的检测限可与现有技术相比较，结果表明该生物传感器对HAT的测 定具有更佳的灵敏度。

试验例4生物传感器的选择性

本试验例通过检测其他蛋白是否会干扰p300(HAT)的检测来研究这种电化学方法的选择性。DNA甲基转移酶1(DNMT1)、蛋白激酶A(PKA)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、 牛血清白蛋白(BSA)作为干扰蛋白，与p300在相同条件下进行测试。如图5所示，当有 p300存在时，没有观察到明显的峰值电流，相反，在

其他蛋白存在的情况下，即使这些蛋白的浓度与p300相同，也能观察到明显的峰值电 流。本试验例结果表明，用电化学法测定p300活性的靶标结合特异性更高。

试验例5抑制研究

HAT在包括癌症、糖尿病和高脂血症等多种疾病中都有活性，因此，筛选HAT抑 制剂对药物开发具有重要意义。本试验例挑选了针对HAT有效的小分子抑制剂卡丁酸 来验证该生物传感器在抑制剂筛选中的可行性，如图6所示，生物传感器的峰电流随着 漆树酸浓度的增加而增大，表明其对p300有抑制作用，靶向p300的漆树酸对应的IC50 值大约是51.24μM，这与先前的报道一致，表明这种新型生物传感器具有定性筛选HAT 抑制剂的。

综上所述，本文通过降低G-Quadruplex-Cu(II)金属酶活性构建了一种可以检测HAT的高灵敏生物传感器。与现有的其他检测HAT的方法比较，该检测方法具有以下 优势。首先，对抗原乙酰化的检测过程中不需要使用昂贵的抗体，更经济，更省时。第 二，由于利用G-Quadruplex-Cu(II)金属酶作为信号放大元件，产生放大信号的作用， 实现了较低HAT抗原检测限(0.01ng.ml-1)，其次，该方法已成功应用于HAT抑制剂的 筛选。鉴于上述优点，该生物传感器的应用为HAT的检测提供了一个低成本、高灵敏 度、功能强大的平台，在临床诊断和抗癌药物的开发方面有着广阔的应用前景。

对比例1

本发明与现有技术中检测HAT的方法比较，可见本发明的检测线可达到0.14nM，具体结果如表1所述，

表1.