阅读说明：本技术 一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器 (G-quadruplex-based fluorescence sensor for detecting activity of Dnmt1 ) 是由 邓惠敏 范子彦 刘珊珊 王颖 杨飞 边照阳 唐纲岭 刘洋 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,属于生化分析领域。首先,以含有G-四链体序列、经半甲基化修饰的Hairpin DNA为底物,在S-腺苷甲硫氨酸存在下,于37℃条件下,以Dnmt1催化底物发生甲基化反应；然后加入对甲基化敏感的限制性内切酶BssHII,于60℃下进行剪切反应,被完全甲基化的底物不能被BssHII识别,从而不能被剪切,而未被完全甲基化的底物能被剪切,释放出G-四链体片段；最后,向体系中加入NMM,其与G-四链体结合后,产生强荧光信号,可根据荧光信号的强弱判断底物DNA的甲基化水平,从而进一步反映甲基化反应中Dnmt1的活性。该方法在均相反应体系中进行,操作简单。(A fluorescent sensor for detecting Dnmt1 activity based on G-quadruplex belongs to the field of biochemical analysis. Firstly, taking a half-methylation modified Hairpin DNA containing a G-quadruplex sequence as a substrate, and catalyzing the substrate to carry out methylation reaction by using Dnmt1 at 37 ℃ in the presence of S-adenosylmethionine; then adding a restriction enzyme BssHII sensitive to methylation, carrying out a shearing reaction at 60 ℃, wherein the completely methylated substrate cannot be identified by BssHII and thus cannot be sheared, and the incompletely methylated substrate can be sheared to release a G-quadruplex fragment; finally, NMM is added into the system, and after the NMM is combined with the G-quadruplex, a strong fluorescence signal is generated, and the methylation level of the substrate DNA can be judged according to the strength of the fluorescence signal, so that the activity of Dnmt1 in the methylation reaction is further reflected. The method is carried out in a homogeneous reaction system, and is simple to operate.)

一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器

技术领域

本发明涉及一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器，属于生化分析领域。

背景技术

DNA甲基化是最著名的表观遗传标记，也是最早在分子水平上表征的表观遗传修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化是指在甲基化转移酶的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)作为甲基供体，将甲基转移到CpG二核苷酸中胞嘧啶的5位碳原子上的生物过程。DNA甲基化转移酶在DNA初始甲基化及甲基化的维持中发挥着重要作用。人体中的甲基化转移酶有两类：重头甲基化转移酶(Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L)和维持性甲基化转移酶(Dnmt1)。其中Dnmt1是丰度最高的甲基化转移酶，在DNA复制过程中负责将母链DNA的甲基化状态转移到新合成子链DNA中，是维持甲基化状态所必须的。研究证明，在多种癌症细胞中发现Dnmt1过表达的现象，随之引起抑癌基因启动子的高甲基化，从而使抑癌基因转录沉默和功能失活，最终导致细胞生长分化失控和细胞癌变。因此，Dnmt1被视为潜在的肿瘤标志物，检测Dnmt1活性对于癌症的早期诊断具有重要意义。

传统的甲基化转移酶活性的分析方法主要包括凝胶电泳-免疫印迹法、基于超重氢标记的S-腺苷甲硫氨酸(³H-SAM)的液相色谱-质谱法等。然而这些方法通常依赖于繁琐的操作过程、放射性同位素标记和(或)昂贵的仪器设备等。鉴于此，近年来发展了很多灵活多变的基于电化学、紫外吸收和荧光的传感平台来检测甲基化转移酶活性。但值得一提的是，已报道的大多数DNA甲基化转移酶活性传感平台都是基于细菌源的甲基化转移酶而进行模拟的，如来源于E.Coli的DNA腺嘌呤甲基化转移酶(Dam)、来源于Spiroplasma sp.的CpG甲基化转移酶(M.SssI)等，针对Dnmt1的相对较少。此类甲基化转移酶与人类甲基化转移酶的甲基化位点以及识别序列等都有一定差异，而且人类甲基化转移酶的尺寸要远大于微生物源的甲基化转移酶，因此在对底物DNA的识别上存在很大的空间位阻的差异，目前所报道的传感平台大多只是概念型的研究，并不适用于实际样品的检测，从而使其实用性大大降低。

本发明旨在建立一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器，通过合理设计底物DNA序列，以N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)与G-四链体结合产生的强荧光为信号源，实现以均相反应体系来监测Dnmt1的活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器，以含有G-四链体序列、经半甲基化修饰的Hairpin DNA为底物，在甲基供体存在下，以Dnmt1催化底物发生甲基化反应；然后，加入对甲基化敏感的限制性内切酶进行剪切反应，未被完全甲基化的底物能被剪切，释放出G-四链体片段，与N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)结合产生强荧光信号，可根据荧光信号的强弱判断底物DNA的甲基化水平，从而进一步反应甲基化反应中Dnmt1的活性。该方法在均相反应体系中进行，操作简单，适用于Dnmt1活性的检测。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器，包括以下步骤制备而成：

(1)将含有G-四链体序列、经半甲基化修饰的底物DNA溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0)中，配制成100μM的底物DNA，于水浴中加热至90℃，保持5min，缓慢冷却至室温，得到100μM的Hairpin DNA底物。

(2)将1μL 100μM的Hairpin DNA底物加到200μL的离心管中，加入2.5μL 10×Dnmt1缓冲液(5％Glycerol,1mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris-HCl,100μg/ml BSA,pH 7.8)中，加入0.5μL 32mM S-腺苷甲硫氨酸，加入1μL Dnmt1，最后以水稀释至总体积为25μL，将该混合液置于37℃水浴中进行Dnmt1催化Hairpin DNA底物进行甲基化反应，反应时间2h。

(3)甲基化反应完毕后，向反应体系中加入10μL 10×CutSmart缓冲液(1×CutSmart:50mM Potassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,100μg/ml BSA,pH7.9)，加入3μL 10000U/mL BssHII，以超纯水稀释至终体积为100μL，于60℃水浴中进行BssHII催化的剪切反应，反应时间2h。

(4)剪切反应完毕后，向体系中加入1μL 100μM N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM，溶于DMSO)，涡旋1min,测定荧光强度，激发波长399nm。

本发明所制备的传感器可应用于细胞裂解物等的实际样品中Dnmt1的测定，对甲基化异常相关疾病的诊断具有潜在应用价值。

本发明的有益效果

本发明建立了基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器。该方法在均相反应体系中进行，操作简单。本检测方法对Dnmt1的检出限为0.12U/mL，定量限为0.40U/mL，在0.2-60U/mL范围内线性良好(R²＝0.9907)。

附图说明

图1检测原理示意图；

图2为可行性验证的荧光分析结果；

图3为Dnmt1活性检测的线性回归分析结果。

具体实施方式

本发明结合实例做进一步描述，但并不限制本发明。

实例1：

(1)试剂与仪器

HPLC纯化的底物DNA(5’-GGG TAG GGC GGG TTG GG/i5MedC/GCG CGA GAA TGTTTT CAT TCT CGC GCG CCC AAC-3’)购于生工生物工程股份有限公司(上海)，溶于TE缓冲液，经90℃退火处理得到100μM的Hairpin DNA底物储备液；2000U/mL的Dnmt1、10000U/mL的BssHII、10×Dnmt1缓冲液、10×CutSmart缓冲液、32mM的SAM均购于New England Biolabs(伊普斯维奇，英格兰)；N-甲基卟啉二丙酸IX购于Frontier Scientific(美国)。

荧光分析采用HORIBA Fluoromax-4荧光仪(日本)，激发波长为399nm，狭缝宽度为5nm。

(2)可行性分析

本方法采用的底物DNA序列为：5’-GGG TAG GGC GGG TTG GG/i5MedC/GCG CGAGAA TGT TTT CAT TCT CGC GCG CCC AAC-3’，其中下划线部分为能够形成G-四链体，虚下划线部分为既包含了Dnmt1识别序列的半甲基化的CpG(5’-CG-3’)，也包含了BssHII的识别序列(5’-GCGCGC-3’)，将底物DNA经90℃退火处理，可得Hairpin DNA，一方面G-四链体被封闭保护，另一方面形成Dnmt1和BssHII识别所需的双链DNA区域。

本方法的检测原理如图1所示，首先以半甲基化的Hairpin DNA为底物，圆点虚线代表能形成G-四链体的片段，粗实线代表Dnmt1和BssHII的共同识别的区域。当加入SAM甲基供体和Dnmt1时，底物DNA发生甲基化反应，然后再加入甲基化敏感的限制性内切酶BssHII，完全甲基化的底物DNA不能被BssHII识别，从而不能被剪切，而未完全甲基化的底物DNA则可被BssHII识别，从而被剪切，释放出能形成G-四链体的DNA片段，此片段可与NMM结合，从而产生远远强于NMM自身荧光强度的增强荧光。体系中Dnmt1活性越强，完全甲基化的底物DNA越多，被释放出的G-四链体片段越少，荧光则越弱，故测得的荧光强度与Dnmt1活性成反比。因此，可建立Dnmt1活性与荧光强度的关联，从而根据荧光强度来反映Dnmt1活性。

基于以上原理，为验证底物的可行性，首先进行了对照实验。

其中，实验组是将1μL 100μM的Hairpin DNA底物加到200μL的离心管中，加入2.5μL 10×Dnmt1缓冲液，加入0.5μL 32mM S-腺苷甲硫氨酸，加入1μL Dnmt1，最后以水稀释至总体积为25μL，将该混合液置于37℃水浴中进行Dnmt1催化Hairpin DNA底物进行甲基化反应，反应时间2h。甲基化反应完毕后，向反应体系中加入10μL 10×CutSmart缓冲液(1×CutSmart:50mM Potassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,100μg/ml BSA,pH 7.9)，加入3μL 10000U/mL BssHII，以超纯水稀释至终体积为100μL，于60℃水浴中进行BssHII催化的剪切反应，反应时间2h。剪切反应完毕后，向体系中加入1μL 100μM N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM，溶于DMSO)，涡旋1min。

对照组，除未加入Dnmt1外，其余的处理过程均与实验组一致。

将实验室和对照组分别所得混合液，分别进行荧光测定，其结果如图2所示。单独NMM存在下，其自身荧光较弱；当底物DNA经Dnmt1和BssHII共同处理时(实验组)，由于甲基化水平较高，仅释放出少量G-四链体片段，因此荧光强度仅略微增强；当底物DNA仅经BssHII处理时(对照组)，可释放出较多的G-四链体片段，因此荧光强度显著增强。此结果证明了本方法的可行性。

通过改变Dnmt1浓度，建立了荧光强度与Dnmt1活性之间的线性方程，其结果如图3所示。可见，在0.2-60U/mL范围内线性良好(R²＝0.9907)

(3)样品分析

为验证本方法检测实际样品的能力，将Dnmt1添加到人血清中，测定其回收率，结果如表1所示。可见，该方法的回收率较为满意。

表1.人血清中添加不同活性的Dnmt1的回收率

添加水平(U/mL)	回收率(％)	相对标准偏差(％)
			0.5	102.7	9.7
2.0	99.3	9.2
			10.0	98.9	8.4