阅读说明：本技术 盐酸药根碱在逆转胰腺癌细胞耐药性中的应用 (Application of jatrorrhizine hydrochloride in reversing drug resistance of pancreatic cancer cells ) 是由 任想 郑希 李冬利 马于然 王潇 吴盼盼 徐学涛 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物医药技术领域,尤其是一种盐酸药根碱在逆转胰腺癌细胞耐药性中的应用,在所述的盐酸药根碱的协同作用下,吉西他滨对胰腺癌细胞具有更为显著的抑制作用,逆转了胰腺癌耐药细胞对吉西他滨的耐药性。本发明通过对胰腺癌Panc-1细胞和吉西他滨耐药Panc-1细胞研究,发现在盐酸药根碱的作用下,胰腺癌细胞对吉西他滨的药敏性增强,低浓度的吉西他滨与盐酸药根碱联用可达到高浓度吉西他滨对耐药Panc-1细胞的效果,并且随着盐酸药根碱浓度增加,与吉西他滨联用可有效抑制耐药Panc-1细胞的生长,其生长抑制作用效果远高于单用吉西他滨,显著逆转了耐药Panc-1细胞对吉西他滨的耐药性。(The invention relates to the technical field of biological medicines, in particular to application of jatrorrhizine hydrochloride in reversing drug resistance of pancreatic cancer cells. According to the invention, through research on pancreatic cancer Panc-1 cells and gemcitabine drug-resistant Panc-1 cells, the drug sensitivity of pancreatic cancer cells to gemcitabine is enhanced under the action of jatrorrhizine hydrochloride, the effect of high-concentration gemcitabine to drug-resistant Panc-1 cells can be achieved by using low-concentration gemcitabine and jatrorrhizine hydrochloride together, the growth of the drug-resistant Panc-1 cells can be effectively inhibited by using the pancreatic cancer cells and the gemcitabine together with the increase of the concentration of jatrorrhizine hydrochloride, the growth inhibition effect is far higher than that of the gemcitabine used alone, and the drug resistance of the drug-resistant Panc-1 cells to gemcitabine is remarkably reversed.)

盐酸药根碱在逆转胰腺癌细胞耐药性中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是盐酸药根碱在逆转胰腺癌细胞对吉西他滨耐药性中的应用。

背景技术

胰腺癌是当前恶性程度比较高的难治性胃肠道肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈现上升趋势，由于早期通常没有症状，且这些症状通常不具特异性，因此，患者发现时常常已进入晚期，死亡率几乎100％，5年生存率低于5％。胰腺癌早期的确诊率并不高。全球范围内胰腺癌的发病率和死亡率分别列恶性肿瘤的第12位和第7位。国家癌症中心数据显示，我国每年胰腺癌病例数约占恶性肿瘤病例数的2.42％，因其发病隐匿、进展快、疗效不佳、中位生存期短、预后极差，素有“癌症之王”的称号。

目前，治疗胰腺癌的首选方法仍然是手术切除，但仅有15％-20％的患者确诊后能进行手术治疗，其余患者多采用化疗的方式。吉西他滨在胰腺癌的化疗中有着极其重要的地位，它作用于DNA合成期的肿瘤细胞，是胰腺癌的标准一线化疗方案。有报道指出，腹腔灌注吉西他滨能有效抑制肿瘤的生长，改善患者生活质量并减轻全身的毒性反应。尽管吉西他滨单药方案已经成为了胰腺癌的辅助治疗标准方案，但其化疗的有效率仅能达到25％，中位生存期仅为5-7个月，1年生存率约为20％，远远不能满足临床的需要。尤其是对无手术指征的局部晚期和转移性胰腺癌，其中位生存期的延长较传统的5-FU/LV而言也仅为数月。造成这种情况的主要原因是由于吉西他滨在临床上出现了越来越多的耐药现象。研究表明，吉西他滨的耐药主要与摄取转运过程障碍，胞浆内活化，分解酶异常以及DNA修复等有关。目前晚期胰腺癌以吉西他滨为基础的一线化疗方案的疗效已停滞于平台期，并且由于胰腺癌细胞具有特殊的生物学特性，除吉西他滨外对其他化疗不甚敏感，因此，吉西他滨是治疗胰腺癌的首选药物，但在胰腺癌的临床上，许多患者对吉西他滨有先天或后天获得的化疗抗性，这限制了吉西他滨在临床上的应用效果，也增加了治疗困难。因此，亟需改进现有对晚期胰腺癌的治疗策略，提高胰腺癌细胞对吉西他滨的药物敏感性是关键所在。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种盐酸药根碱在逆转胰腺癌细胞耐药性中的应用，本发明提供能够有效逆转胰腺癌耐药Panc-1细胞对吉西他滨的耐药性。

本发明的技术方案为：一种盐酸药根碱在逆转胰腺癌细胞耐药性中的应用，在所述的盐酸药根碱的协同作用下，使用低剂量吉西他滨对胰腺癌细胞可以具有显著抑制作用，逆转了胰腺癌耐药细胞对吉西他滨的耐药性。

优选的，所述的胰腺癌细胞为Panc-1细胞或吉西他滨耐药Panc-1细胞，将所述的吉西他滨联合盐酸药根碱作用于耐药Panc-1细胞，逆转了耐药Panc-1细胞对吉西他滨的耐药性。

优选的，所述的盐酸药根碱联合吉西他滨对吉西他滨耐药Panc-1细胞的抑制作用是指提高耐药Panc-1的药物敏感性。

优选的，所述的盐酸药根碱作用耐药胰腺癌Panc-1细胞时可降低Bcl-2蛋白水平。

优选的，所述的盐酸药根碱可从中药三颗针中提取。

优选的，联合用药过程中，所述盐酸药根碱的浓度为10～40μM。

更优选地，联合用药过程中，所述盐酸药根碱的浓度为30μM。

本发明的有益效果为：

1、本发明的盐酸药根碱在炎症、流感等方面具有很好的药理学作用，能够有效的抑制神经氨酸酶的活性，从而抑制病毒在体内的繁殖，进而减轻或治愈患者；

2、吉西他滨的活性代谢产物主要通过干扰DNA复制，造成DNA损伤并阻滞细胞周期进程达到抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡发生。

3、本发明通过研究胰腺癌Panc-1细胞和吉西他滨耐药Panc-1细胞，发现盐酸药根碱可以有效逆转胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药性，低浓度的吉西他滨与盐酸药根碱联用可达到高浓度吉西他滨单用时对耐药Panc-1细胞的效果。

4、随着盐酸药根碱浓度增加，与吉西他滨联用可有效抑制耐药Panc-1细胞的生长，盐酸药根碱浓度30μM时吉西他滨作用效果最佳，其生长抑制作用效果远高于单用吉西他滨，显著逆转了耐药Panc-1细胞对吉西他滨的耐药性。

附图说明

图1为本发明实施例6单用吉西他滨对胰腺癌Panc-1细胞和耐药Panc-1细胞的生长影响的趋势图；

图2为本发明实施例6单用盐酸药根碱对胰腺癌Panc-1细胞和耐药Panc-1细胞的生长影响的趋势图；

图3为本发明实施例7在不同浓度的盐酸药根碱与吉西他滨联合用药对吉西他滨对耐药Panc-1细胞的抑制作用图。

图4为本发明实施例8用Western blot法检测盐酸药根碱对耐药Panc-1细胞中Bcl-2蛋白表达的影响图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明：

实施例1

将盐酸药根碱以不同浓度单独作用于Panc-1细胞和耐药Panc-1细胞。

实施例2

将吉西他滨以不同浓度单独作用于Panc-1细胞和耐药Panc-1细胞。

实施例3

将盐酸药根碱与不同浓度的吉西他滨联合用于耐药Panc-1细胞，其中，所述的盐酸药根碱浓度为10μM，所述的吉西他滨浓度为2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM。

实施例4

将浓度为20μM的盐酸药根碱与不同浓度的吉西他滨联合作用于耐药Panc-1细胞，其中，所述的吉西他滨浓度为2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM。

实施例5

将浓度为30μM盐酸药根碱与不同浓度的吉西他滨联合作用于耐药Panc-1细胞，其中所述的吉西他滨浓度为2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM。

实施例6

胰腺癌细胞的生长分析

将吉西他滨和盐酸药根碱分别对胰腺癌Panc-1细胞和耐药Panc-1细胞单独用药的生长分析，具体如下：

1)、将胰腺癌Panc-1细胞和耐药Panc-1细胞分别以细胞密度为0.2×10⁵个/ml接种于35mm细胞培养皿中并培养24h；

2)、对细胞用不同浓度的吉西他滨和盐酸药根碱药物分别处理，作用72h，用台盼蓝拒染法测定分析药物对细胞生长抑制的影响。

从图1可以看出，当吉西他滨药物浓度为50μM时，Panc-1细胞的细胞存活数仅约10％，而吉西他滨的浓度为50μM和100μM时，对耐药Panc-1细胞的生长影响相当，细胞存活80％以上，这说明吉西他滨对耐药Panc-1的效果不明显；

从图2中可以看出，盐酸药根碱对胰腺癌Panc-1细胞作用效果相似，当盐酸药根碱浓度为50μM时，两种细胞均减少了约50％。

综上，盐酸药根碱对两种细胞的作用效果相当；吉西他滨对正常的胰腺癌Panc-1细胞可以有效抑制其细胞生长，但对耐药Panc-1细胞效果有限。

实施例7

吉西他滨和盐酸药根碱联合用药对耐药Panc-1的生长分析，具体如下：

1)、将耐药胰腺癌Panc-1细胞以细胞密度为0.2×10⁵个/ml接种于35mm细胞培养皿中并培养24h；

2)、用不同浓度的吉西他滨(浓度为2μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)与盐酸药根碱(浓度分别为0、10μM、20μM、30μM)联合应用于耐药Panc-1细胞，作用72h后用台盼蓝拒染法测定分析药物对细胞生长抑制的影响。

从图3中可以看出，当吉西他滨在单独作用于耐药Panc-1细胞的情况下，吉西他滨对耐药Panc-1细胞的生长抑制效果甚微；当吉西他滨和浓度为10μM的盐酸药根碱联用时，吉西他滨的效果有一定提升，耐药Panc-1细胞对吉西他滨的耐药性有所降低；当吉西他滨和浓度为20μM和30μM的盐酸药根碱联用时，吉西他滨效果显著，尤其是当盐酸药根碱浓度为30μM时，吉西他滨表示出对耐药Panc-1细胞强烈的生长抑制效果，使吉西他滨抗药性逆转了35.3倍，具体如表1所示：

表1不同浓度的吉西他滨与盐酸药根碱对耐药Panc-1细胞的生长抑制效果

从表1中可以看出，各组在盐酸药根碱不同的浓度下，吉西他滨对耐药Panc-1的半数抑制浓度IC₅₀值不同，A组吉西他滨单独使用时，吉西他滨IC₅₀值为214.61μM；B组吉西他滨+盐酸药根碱(10μM)联合作用于耐药Panc-1细胞时，吉西他滨IC₅₀为167.92μM，与A组相比，抗药性逆转了1.28倍；C组吉西他滨+盐酸药根碱(20μM)联合作用于耐药Panc-1细胞时，吉西他滨IC₅₀为68.16μM，与A组相比，抗药性逆转了3.15倍；D组吉西他滨+盐酸药根碱(30μM)联合作用于耐药Panc-1细胞时，吉西他滨IC₅₀为6.08μM，与A组相比，抗药性逆转35.3倍。由此得出结论，随着盐酸药根碱浓度增加，与吉西他滨联用可有效抑制耐药Panc-1细胞的生长，盐酸药根碱浓度30μM时吉西他滨作用效果最佳，且在此情况下，其生长抑制作用效果远高于单用吉西他滨，显著逆转了耐药Panc-1细胞对吉西他滨的耐药性，大大增加了其抗药性逆转倍数。

实施例8

盐酸药根碱对耐药PANC-1细胞中Bcl-2蛋白水平的影响。

Bcl-2基因是一种细胞凋亡抑制基因。Bcl-2本身不使细胞增殖，也不促进细胞恶性转化，但其过度表达能抑制多种凋亡因素诱导的细胞凋亡，延长细胞存活时间。细胞的持续生存一方面增加了细胞总数，另一方面使本应进入程序性死亡的细胞未能按时凋亡。由于这种老化细胞染色体不稳定，基因易突变，对致癌物易感性高，从而增加了细胞染色体畸变和病毒感染机会，导致细胞恶变和肿瘤形成。Bcl-2在多种肿瘤中的异常表达已得到证实。

将耐药胰腺癌Panc-1细胞以细胞密度0.2×10⁶个/mL接种在100mm细胞培养皿中，37℃培养24h后，以浓度为30μM的盐酸药根碱继续作用24h，提取细胞蛋白，测定蛋白样品浓度。Western blot法检测细胞Bcl-2蛋白水平，以β-actin作为内参，结果表明，盐酸药根碱作用耐药胰腺癌Panc-1细胞时可降低Bcl-2蛋白水平，参见图4。

上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。