阅读说明：本技术 一种代谢检查点fbp1激动剂及在抗肿瘤方面的应用 (Metabolism check point FBP1 agonist and application thereof in anti-tumor aspect ) 是由 李砺锋 张毅 赵杰 李春伟 沈志博 薛文华 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种代谢检查点FBP1激动剂及在抗肿瘤方面的应用。FBP1是葡萄糖异生的关键酶之一,其通过催化1,6-二磷酸果糖水解在糖降解过程中发挥抑制作用。已知FBP1在多种肿瘤细胞中低表达,与肿瘤细胞的生长增殖相关,激活FBP1可以抑制肿瘤细胞的生长增殖。本发明提供了一种代谢检查点FBP1激活剂,该激动剂为一种天然植物多糖,CCK-8试验证明其可以显著抑制人肺腺癌、肝癌和乳腺癌细胞增殖,且呈现明显的剂量依赖性；Western blotting试验证明该天然植物多糖可以有效激活上述肿瘤细胞中FBP1蛋白表达,这可能是其发挥抗人肺腺癌、肝癌和乳腺癌的作用机制。(The invention discloses a metabolic checkpoint FBP1 agonist and application thereof in the aspect of tumor resistance. FBP1 is one of the key enzymes of gluconeogenesis, which plays an inhibitory role in the sugar degradation process by catalyzing the hydrolysis of fructose-1, 6-diphosphate. FBP1 is known to be low expressed in various tumor cells, and is associated with the growth and proliferation of tumor cells, and the growth and proliferation of tumor cells can be inhibited by activating FBP 1. The invention provides an FBP1 activator as a metabolic checkpoint, wherein the activator is a natural plant polysaccharide, and CCK-8 tests prove that the activator can obviously inhibit the proliferation of human lung adenocarcinoma, liver cancer and breast cancer cells and presents obvious dose dependence; western blotting test proves that the natural plant polysaccharide can effectively activate the expression of FBP1 protein in the tumor cells, which is probably an action mechanism for resisting human lung adenocarcinoma, liver cancer and breast cancer.)

一种代谢检查点FBP1激动剂及在抗肿瘤方面的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及代谢检查点药物的开发和应用，具体涉及一种代谢检查点FBP1激动剂及在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

糖酵解与氧化磷酸化是细胞进行能量代谢的主要途径。对于普通细胞而言，当氧气充足时葡萄糖经彻底氧化产生32分子三磷酸腺苷(ATP)；当氧气供应不足时仅通过糖酵解产生2分子ATP。因此，普通细胞只有在缺氧情况下才使用糖酵解这种低效率的产能途径。而肿瘤细胞即便在氧气充足的情况下也依然依靠糖酵解供能，这是肿瘤细胞与普通细胞在糖代谢上的差别，被称为“瓦博格(Warburg)效应”，自此肿瘤也被认为是一种“代谢疾病”。基于此，利用药物调控肿瘤细胞的糖代谢从而达到肿瘤治疗的目的已成为肿瘤细胞生物学及代谢领域的研究热点(肿瘤细胞的糖代谢调控与肿瘤治疗，生物医学工程学杂志，2019)。

因为肿瘤也是一种“代谢疾病”，所以通过对肿瘤细胞的各种代谢功能的调节成为肿瘤治疗的一个重要研究方向。最近，肿瘤细胞代谢的研究非常活跃，其激活、分化和迁移等都有关键的代谢通路和相应检查点，因此，“代谢检查点”指的就是代谢通路中的一些重要的酶或受体，其活性的高低直接影响到肿瘤细胞的功能，可以调控肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。那么通过调控肿瘤细胞的“代谢检查点”改变其代谢状态，降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭活性，或降低肿瘤细胞对化疗药物的耐受，或降低其对免疫细胞的免疫逃逸能力，很可能会是提高癌症疗效的下一个新的关键突破点。

果糖-1,6-二磷酸酶1(fructose-1,6-bisphosphatase 1，FBP1)是葡萄糖异生的关键酶之一，其通过催化1,6-二磷酸果糖水解在糖降解过程中发挥抑制作用(上调FBP1表达对胃癌细胞生长的抑制作用，胃肠病学和肝病学杂志，2018)。FBP1在多种肿瘤细胞中低表达，与肿瘤细胞的生长增殖相关，激活FBP1可以抑制肿瘤细胞的生长增殖。张磊等探讨了上调FBP1表达对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制，结果发现FBP1在胃癌细胞中低表达，上调其表达能够抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与上调Cleaved caspase-3蛋白和下调Cyclin D1、c-Myc蛋白表达有关(上调FBP1表达对胃癌细胞生长的抑制作用，胃肠病学和肝病学杂志，2018)。洪正东等探讨了FBP1在人肾透明细胞癌(RCCC)及其癌旁组织中的表达，以及在肾癌发生、发展及预后中的作用和临床意义，结果发现FBP1及其蛋白在人肾癌组织中低表达，与肾癌的发生、发展相关，可能成为肾癌预后的侯选标志物之一(FBP1在肾透明细胞癌组织中的表达变化及意义，重庆医学，2018)。刘家有等探讨了FBP1基因在结直肠腺癌的表达水平及其与临床病理特征的联系，结果发现FBP1基因及蛋白质的低表达可能在结直肠腺癌的发生发展中有着重要的作用，是其潜在的治疗靶标(免疫组化法和qPCR技术检测FBP1在结直肠腺癌中的表达及临床意义，川北医学院学报，2017)。有研究发现，FBP1在肺癌组织及细胞中低表达，恢复FBP1表达不仅抑制葡萄糖摄取和乳酸生产，也会在体外缺氧条件下抑制肺癌细胞增殖和侵袭，并在体内抑制肺癌生长(Down-regulationof FBP1 by ZEB1-mediated repression confers to growth and invasion in lungcancer cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2016)。

遗憾的是，目前代谢检查点FBP1激活剂的报道非常少，研究明显不足。

中药金沙藤LygodiiHerba为海金沙科植物海金沙Lygodiumjaponicum(Thunb.)Sw.、小叶海金沙L.microphyllum(Cav.)R.Br.或曲轴海金沙L.flexuosum(L.)Sw.的干燥地上部分，具有清热解毒、利水通淋的功能，含有多糖、黄酮、萜类等多种化学成分。

目前尚无金沙藤多糖用于代谢检查点FBP1激活剂和抗肿瘤的活性报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种代谢检查点FBP1激动剂及在抗肿瘤方面的应用，具体地，该肿瘤为肺腺癌。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种代谢检查点FBP1激动剂，为一种金沙藤多糖，通过如下方法制备：

将金沙藤粉碎、过筛，取粉末，加入去离子水，热回流提取，提取液过滤、减压浓缩，离心，收集上清液，加入3倍体积无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析，收集沉淀，用去离子水复溶，离心，收集上清液，再加入3倍体积无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析，收集沉淀，洗涤，去离子水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥。

上述金沙藤多糖用于制备抗肿瘤药物的医药用途。

进一步地，所述肿瘤为肺腺癌、肝癌或乳腺癌。

一种治疗肺腺癌的药物制剂，活性成分为一种金沙藤多糖，经药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型；所述金沙藤多糖通过如下方法制备：

将金沙藤粉碎、过筛，取粉末，加入去离子水，热回流提取，提取液过滤、减压浓缩，离心，收集上清液，加入3倍体积无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析，收集沉淀，用去离子水复溶，离心，收集上清液，再加入3倍体积无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析，收集沉淀，洗涤，去离子水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥。

进一步地，所述辅料为固体、液体或半固体辅料。

进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊、注射剂。

有益效果：

本发明提供了一种代谢检查点FBP1激活剂，该激动剂为一种天然植物多糖，CCK-8试验证明其可以显著抑制人肺腺癌、肝癌和乳腺癌细胞增殖，且呈现明显的剂量依赖性；Western blotting试验证明金沙藤多糖可以有效激活上述肿瘤细胞中FBP1蛋白表达，这可能是金沙藤多糖发挥抗人肺腺癌、肝癌和乳腺癌的作用机制。

附图说明

图1为不同浓度金沙藤多糖对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制率；

图2为不同浓度金沙藤多糖对人肺腺癌A549细胞中FBP1蛋白表达的影响；

图3为不同浓度金沙藤多糖对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制率；

图4为不同浓度金沙藤多糖对人肝癌HepG2细胞中FBP1蛋白表达的影响；

图5为不同浓度金沙藤多糖对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制率；

图6为不同浓度金沙藤多糖对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中FBP1蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：金沙藤多糖的制备

将购自中药材市场的金沙藤粉碎并过40目筛，取粉末2kg，加入15L去离子水，热回流提取3次，第1次提取2h，第2次提取1.5h，第3次提取1h，合并三次提取液，过滤，减压浓缩至5L，4500rpm离心10min，收集上清液，加入15L无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析12h，收集沉淀，用5L去离子水复溶，4500rpm离心10min，收集上清液，再加入15L无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析12h，收集沉淀，用无水乙醇、75％乙醇(体积浓度)顺序洗涤，去离子水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥，得多糖75g，苯酚-硫酸法测定其多糖纯度不低于95％。使用该实施例制备的金沙藤多糖用于抗肿瘤活性测试。

实施例2：金沙藤多糖的制备

将购自中药材市场的金沙藤粉碎并过40目筛，取粉末2kg，加入10L去离子水，热回流提取3次，每次提取2h，合并三次提取液，过滤，减压浓缩至5L，4500rpm离心10min，收集上清液，加入15L无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析12h，收集沉淀，用5L去离子水复溶，4500rpm离心10min，收集上清液，再加入15L无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析12h，收集沉淀，用无水乙醇、75％乙醇(体积浓度)顺序洗涤，去离子水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥，得多糖83g，苯酚-硫酸法测定其多糖纯度不低于95％。

实施例3：金沙藤多糖的制备

将购自中药材市场的金沙藤粉碎并过40目筛，取粉末2kg，加入20L去离子水，热回流提取3次，每次提取1h，合并三次提取液，过滤，减压浓缩至5L，4500rpm离心10min，收集上清液，加入15L无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析12h，收集沉淀，用5L去离子水复溶，4500rpm离心10min，收集上清液，再加入15L无水乙醇，搅拌均匀，静置醇析12h，收集沉淀，用无水乙醇、75％乙醇(体积浓度)顺序洗涤，去离子水复溶，Sevag法脱蛋白，冷冻干燥，得多糖68g，苯酚-硫酸法测定其多糖纯度不低于95％。

实施例4：金沙藤多糖对肺腺癌的抑制活性

一、试验材料和方法

1、细胞复苏和培养

人肺腺癌A549细胞(本实验室冻存)复苏后培养于含10％胎牛血清(HyClone；Thermo Fisher Scientific)及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(HyClone；Thermo Fisher Scientific)于5％CO₂、37℃培养箱中培养、传代，取对数期细胞用于后续实验。

2、CCK-8法测定细胞增殖活性

按照CCK-8试剂盒(Dojindo,Japan)说明书操作。用胰酶消化对数生长期A549细胞，配制成细胞悬液，按每孔2000个细胞接种于96孔板，每孔加100μl培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中过夜贴壁。设置药物浓度分别为5、20μg/mL的金沙藤多糖组、阴性对照组(药物浓度为0μg/mL)及空白对照组，每组设3个复孔。在金沙藤多糖组中每孔加入10μl相应浓度药物，空白对照组每孔加入10μl培养基。置于培养箱中培养48h后取出，每孔加入10μl CCK-8试剂，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育2h。使用酶标仪测定450nm光吸收度值(A值)，计算不同浓度金沙藤多糖对A549细胞的增殖抑制率。增殖抑制率＝1－(金沙藤多糖组A值－空白对照组A值)/(阴性对照组A值－空白对照组A值)×100％。

3、Western blotting法测定细胞中FBP1表达水平

人肺腺癌A549细胞分别用含0、5、20μg/mL金沙藤多糖的培养液培养48h，收集各组细胞并洗涤，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解，冰上孵育30min后，离心收上清，BCA法测定样品蛋白质浓度。取等量蛋白质用10％SDS-PAGE凝胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，在含0.1％吐温的1×TBST配制的脱脂牛奶中室温封闭1h，用PBS清洗3遍后，在4℃条件下加入一抗孵育过夜，用PBS清洗3遍，加入HRP标记的二抗，PBS清洗，使用化学发光成像仪进行条带分析，计算FBP1相对内参β-actin的相对表达量，并以0μg/mL金沙藤多糖组细胞中FBP1相对表达量计为1.00。

4、统计学分析

使用SPSS 19.0软件(IBM，NY)进行数据分析。数据以平均值±标准差表示，采用独立样本或配对t检验分析两组正态分布连续变量的差异，以p＜0.05代表差异显著。

二、试验结果

1、CCK-8法检测结果

结果如表1和图1所示，金沙藤多糖可以有效抑制人肺腺癌A549细胞的增殖，呈现明显的剂量依赖性，说明金沙藤多糖具有抗人肺腺癌细胞增殖的活性。

表1不同浓度金沙藤多糖对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制率

	5μg/mL金沙藤多糖	20μg/mL金沙藤多糖
			增殖抑制率(％)	33.7±3.2	55.4±3.8

2、Western blotting法检测结果

Western blotting结果如图2所示，不同浓度金沙藤多糖可以有效激活人肺腺癌A549细胞中FBP1蛋白表达，金沙藤多糖为一种有效的FBP1激动剂，这可能是金沙藤多糖发挥抗人肺腺癌细胞增殖作用的机制。

实施例5：金沙藤多糖对肝癌的抑制活性

一、试验材料和方法

1、细胞复苏和培养

人肝癌HepG2细胞(本实验室冻存)复苏后培养于含10％胎牛血清(HyClone；Thermo Fisher Scientific)及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(HyClone；Thermo Fisher Scientific)于5％CO₂、37℃培养箱中培养、传代，取对数期细胞用于后续实验。

2、CCK-8法测定细胞增殖活性

按照CCK-8试剂盒(Dojindo,Japan)说明书操作。用胰酶消化对数生长期HepG2细胞，配制成细胞悬液，按每孔2000个细胞接种于96孔板，每孔加100μl培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中过夜贴壁。设置药物浓度分别为5、20μg/mL的金沙藤多糖组、阴性对照组(药物浓度为0μg/mL)及空白对照组，每组设3个复孔。在金沙藤多糖组中每孔加入10μl相应浓度药物，空白对照组每孔加入10μl培养基。置于培养箱中培养48h后取出，每孔加入10μl CCK-8试剂，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育2h。使用酶标仪测定450nm光吸收度值(A值)，计算不同浓度金沙藤多糖对HepG2细胞的增殖抑制率。增殖抑制率＝1－(金沙藤多糖组A值－空白对照组A值)/(阴性对照组A值－空白对照组A值)×100％。

3、Western blotting法测定细胞中FBP1表达水平

人肝癌HepG2细胞分别用含0、5、20μg/mL金沙藤多糖的培养液培养48h，收集各组细胞并洗涤，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解，冰上孵育30min后，离心收上清，BCA法测定样品蛋白质浓度。取等量蛋白质用10％SDS-PAGE凝胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，在含0.1％吐温的1×TBST配制的脱脂牛奶中室温封闭1h，用PBS清洗3遍后，在4℃条件下加入一抗孵育过夜，用PBS清洗3遍，加入HRP标记的二抗，PBS清洗，使用化学发光成像仪进行条带分析，计算FBP1相对内参β-actin的相对表达量，并以0μg/mL金沙藤多糖组细胞中FBP1相对表达量计为1.00。

4、统计学分析

使用SPSS 19.0软件(IBM，NY)进行数据分析。数据以平均值±标准差表示，采用独立样本或配对t检验分析两组正态分布连续变量的差异，以p＜0.05代表差异显著。

二、试验结果

1、CCK-8法检测结果

结果如表2和图3所示，金沙藤多糖可以有效抑制人肝癌HepG2细胞的增殖，呈现明显的剂量依赖性，说明金沙藤多糖具有抗人肝癌细胞增殖的活性。

表2不同浓度金沙藤多糖对人肝癌HepG2细胞的增殖抑制率

	5μg/mL金沙藤多糖	20μg/mL金沙藤多糖
			增殖抑制率(％)	36.1±3.5	60.2±4.1

2、Western blotting法检测结果

Western blotting结果如图4所示，不同浓度金沙藤多糖可以有效激活人肝癌HepG2细胞中FBP1蛋白表达，金沙藤多糖为一种有效的FBP1激动剂，这可能是金沙藤多糖发挥抗人肝癌细胞增殖作用的机制。

实施例6：金沙藤多糖对乳腺癌的抑制活性

一、试验材料和方法

1、细胞复苏和培养

人乳腺癌MDA-MB-231细胞(本实验室冻存)复苏后培养于含10％胎牛血清(HyClone；Thermo Fisher Scientific)及100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基(HyClone；Thermo Fisher Scientific)于5％CO₂、37℃培养箱中培养、传代，取对数期细胞用于后续实验。

2、CCK-8法测定细胞增殖活性

按照CCK-8试剂盒(Dojindo,Japan)说明书操作。用胰酶消化对数生长期MDA-MB-231细胞，配制成细胞悬液，按每孔2000个细胞接种于96孔板，每孔加100μl培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中过夜贴壁。设置药物浓度分别为5、20μg/mL的金沙藤多糖组、阴性对照组(药物浓度为0μg/mL)及空白对照组，每组设3个复孔。在金沙藤多糖组中每孔加入10μl相应浓度药物，空白对照组每孔加入10μl培养基。置于培养箱中培养48h后取出，每孔加入10μl CCK-8试剂，轻轻敲击培养板混匀，培养箱中孵育2h。使用酶标仪测定450nm光吸收度值(A值)，计算不同浓度金沙藤多糖对MDA-MB-231细胞的增殖抑制率。增殖抑制率＝1－(金沙藤多糖组A值－空白对照组A值)/(阴性对照组A值－空白对照组A值)×100％。

3、Western blotting法测定细胞中FBP1表达水平

人乳腺癌MDA-MB-231细胞分别用含0、5、20μg/mL金沙藤多糖的培养液培养48h，收集各组细胞并洗涤，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解，冰上孵育30min后，离心收上清，BCA法测定样品蛋白质浓度。取等量蛋白质用10％SDS-PAGE凝胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，在含0.1％吐温的1×TBST配制的脱脂牛奶中室温封闭1h，用PBS清洗3遍后，在4℃条件下加入一抗孵育过夜，用PBS清洗3遍，加入HRP标记的二抗，PBS清洗，使用化学发光成像仪进行条带分析，计算FBP1相对内参β-actin的相对表达量，并以0μg/mL金沙藤多糖组细胞中FBP1相对表达量计为1.00。

4、统计学分析

使用SPSS 19.0软件(IBM，NY)进行数据分析。数据以平均值±标准差表示，采用独立样本或配对t检验分析两组正态分布连续变量的差异，以p＜0.05代表差异显著。

二、试验结果

1、CCK-8法检测结果

结果如表3和图5所示，金沙藤多糖可以有效抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖，呈现明显的剂量依赖性，说明金沙藤多糖具有抗人乳腺癌细胞增殖的活性。

表3不同浓度金沙藤多糖对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖抑制率

	5μg/mL金沙藤多糖	20μg/mL金沙藤多糖
			增殖抑制率(％)	31.5±3.0	53.9±3.6

2、Western blotting法检测结果

Western blotting结果如图6所示，不同浓度金沙藤多糖可以有效激活人乳腺癌MDA-MB-231细胞中FBP1蛋白表达，金沙藤多糖为一种有效的FBP1激动剂，这可能是金沙藤多糖发挥抗人乳腺癌细胞增殖作用的机制。

FBP1是葡萄糖异生的关键酶之一，其通过催化1,6-二磷酸果糖水解在糖降解过程中发挥抑制作用。已知FBP1在多种肿瘤细胞中低表达，与肿瘤细胞的生长增殖相关，激活FBP1可以抑制肿瘤细胞的生长增殖。本发明提供了一种代谢检查点FBP1激活剂，该激动剂为一种天然植物多糖，CCK-8试验证明其可以显著抑制人肺腺癌、肝癌和乳腺癌细胞增殖，且呈现明显的剂量依赖性；Western blotting试验证明该天然植物多糖可以有效激活上述肿瘤细胞中FBP1蛋白表达，这可能是其发挥抗人肺腺癌、肝癌和乳腺癌的作用机制。

实施例7：金沙藤多糖的药物制剂

一种金沙藤多糖药物制剂，以实施例1～3任一制备的金沙藤多糖为活性成分，经药学上可以接受的辅料，制成药学上可以接受的剂型；所述辅料为固体、液体或半固体辅料，所述剂型包括片剂、胶囊、注射剂。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。