阅读说明：本技术 一种吡咯双腙衍生物荧光探针及其制备方法和应用 (Pyrrole dihydrazone derivative fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 王元 吴伟娜 赵晓雷 李晓红 刘盼 郭芳芳 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种吡咯双腙衍生物荧光探针及其制备方法和应用,其中所述吡咯双腙衍生物的化学结构式如下：<Image he="235" wi="568" file="DEST_PATH_IMAGE001.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>；制备方法为：将N-吗啉乙基-2,4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和水合肼溶解于有机溶剂中；所得溶液滴加乙酸作催化剂,然后在80℃下回流搅拌反应3-4h；所得溶液冷却至室温,减压抽滤,所得固体残渣用乙醇清洗,得到所述吡咯双腙衍生物荧光探针。本发明的吡咯双腙衍生物荧光探针在生理条件下能选择性的与汞离子作用,溶液由无色变为绿色,同时蓝色荧光显著增强,特别是作为荧光探针在细胞溶酶体内汞离子的方便检测的应用。(The invention provides a pyrrole dihydrazone derivative fluorescent probe and a preparation method and application thereof, wherein the chemical structural formula of the pyrrole dihydrazone derivative is as follows: (ii) a The preparation method comprises the following steps: dissolving N-morpholinoethyl-2, 4-dimethyl-5-formylpyrrole-3-formamide and hydrazine hydrate in an organic solvent; dropwise adding acetic acid serving as a catalyst into the obtained solution, and then refluxing and stirring at 80 ℃ to react for 3-4 h; and cooling the obtained solution to room temperature, carrying out suction filtration under reduced pressure, and cleaning the obtained solid residue with ethanol to obtain the pyrrole dihydrazone derivative fluorescent probe. The pyrrole dihydrazone derivative fluorescent probe can selectively react with mercury ions under physiological conditions, and the solution is changed from colorless to colorlessThe fluorescent probe is green, and simultaneously, the blue fluorescence is obviously enhanced, and the fluorescent probe is particularly used for conveniently detecting mercury ions in cell lysosomes.)

一种吡咯双腙衍生物荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机合成领域，具体涉及吡咯双腙衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

汞是一种运用在电子、化工、制药、生物等方面必不可少的重金属元素。汞广泛分布于土壤、水、空气中，并可以通过冶金、使用化石燃料、焚烧固体垃圾等各种人类活动和火山爆发等自然活动的方式将汞排放到环境中。水溶性的汞离子可以通过细菌转化成甲基汞被生物体吸收，通过食物链方式在人体内富集。体内过量汞的积累会使细胞功能紊乱，从而导致一系列前脑、神经系统、肾脏、认知、有丝***、内分泌、运动各个方面疾病。而细胞溶酶体含有多种酸性水解酶，被认为是细胞内的“酶库”或“消化器官”，控制多种内源性和外源性物质的溶解或消化的过程。因此，溶酶体靶向Hg²⁺探针的设计合成对研究其生物学行为意义重大。

近年来，荧光分子探针技术由于具有灵敏度高、操作简单、成本低等特点，已经成为检测金属离子污染的重要手段。而当今对溶酶体靶向定位的Hg²⁺荧光探针的报道数量有限，且现有溶酶体靶向Hg²⁺荧光探针通常原料成本高，合成路线长，提纯过程复杂，限制了其进一步应用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明考虑到吡咯双腙化合物对汞离子的结合能力，引进吗啉环作为溶酶体的定位基团，合成了一种高灵敏度、高选择性的汞离子荧光探针。该探针能够在生理条件下实现汞离子的检测，并具有溶酶体靶向功能，能应用于溶酶体内汞离子浓度的检测。

本发明的主要目的在于提供一种可用于细胞溶酶体内针对汞离子的灵敏度高、选择性好的吡咯双腙衍生物荧光探针；另一目的是提供该荧光探针的制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种吡咯双腙衍生物荧光探针，所述吡咯双腙衍生物具有如下结构式：

。

本发明还提供了一种吡咯双腙衍生物荧光探针的制备方法，具体制备方法如下：

S1：将N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和水合肼首先用有机溶剂溶解；

S2：将S1所得溶液滴加乙酸作催化剂，在80℃下回流3-4h；

S3：将S2所得溶液冷却至室温，减压抽滤，所得固体残渣用乙醇清洗，再用乙醇重结晶，得到所述吡咯双腙衍生物荧光探针。

更进一步地，所述乙醇为无水乙醇。

更进一步地，步骤S2中所述回流搅拌反应的时间为3h。

更进一步地，步骤S2中，N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和乙酸的摩尔比为1:0.02。

更进一步地，步骤S1中加入的N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和水合肼的摩尔比为2:1。

更进一步地，具体制备方法为，2.79 g（10 mmol） N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和0.50 g （10 mmol）水合肼溶于0.05L乙醇中，滴加0.012g乙酸（0.2mmol）作催化剂，80℃下回流搅拌3-4h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇清洗得到所述吡咯双腙衍生物荧光探针。

本发明还提供了上述一种吡咯双腙衍生物荧光探针一种用途，即在作为汞离子荧光探针方面的应用，特别是在作为检测HeLa活细胞溶酶体内汞离子的荧光探针中的应用。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明通过缩合反应制备吡咯双腙衍生物荧光探针，原料易得，合成和后处理方法简单。在多种常见金属离子中，对汞离子表现出较高的荧光识别性能，并能检测HeLa活细胞溶酶体内汞离子，具有广泛的潜在应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针的¹H NMR谱图；

图2为本发明实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针的质谱谱图；

图3为本发明实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针(1×10^-5 mol／L)的乙腈/HEPES缓冲溶液 (v:v, 7:3, 0.02 mol/L，pH = 5)分别加入3×10^-5 mol／L金属离子（Ag⁺, Al³⁺,Ca²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, Hg²⁺,K⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, Ni²⁺, Pb²⁺和Zn²⁺）的紫外（a）和荧光（b）光谱图（激发波长为410 nm）；

图4为本发明实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针(1×10^-5 mol／L)的乙腈/HEPES缓冲溶液 (v:v, 7:3, 0.02 mol/L，pH = 5)滴定不同浓度Hg²⁺的紫外（a）和荧光（b）光谱图, 插图分别表示440 nm和380 nm处吸光度比值和470 nm处荧光强度随汞离子浓度的线性变化趋势图（激发波长为410 nm）；

图5为在HeLa细胞中，吡咯双腙衍生物荧光探针与Hg²⁺的荧光成像图；HeLa细胞用1×10^-5 mol／L 荧光探针培育30分钟后加入3×10^-5 mol/L Hg²⁺，继续培育30分钟后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；b为上述荧光探针明场图；c为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+ Hg²⁺蓝色通道荧光成像图；e为上述荧光探针+ Hg²⁺明场下的成像图；f为上述荧光探针Hg²⁺明场图和荧光图叠加后的图片。

图6为在HeLa细胞中，吡咯双腙衍生物荧光探针+ Hg²⁺与商用溶酶体定位染料LysoTracker Red共染荧光成像图；HeLa细胞用1×10^-5 mol／L 荧光探针+3×10^-5 mol/LHg²⁺和LysoTracker Red共同培育30分钟后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。

其中：a为蓝色通道荧光成像图；b为红色通道荧光成像图；c为蓝色通道和红色通道叠加后的图片；d为明场图； e为蓝色通道、红色通道和明场叠加后的图片；f为蓝色通道和红色通道强度分布叠加图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明实施例采用的试剂和原料为常规市场购买得到。

实施例1

本实施例吡咯双腙衍生物荧光探针的制备方法如下：

2.79 g（10 mmol） N-吗啉乙基-2，4-二甲基-5-甲酰基吡咯-3-甲酰胺和0.50g （10mmol）水合肼溶于0.05L乙醇中，滴加0.012g乙酸（0.2 mmol）作催化剂，80℃下回流搅拌3-4h，冷却静置至室温，减压抽滤，所得固体用乙醇清洗得到所述吡咯双腙衍生物荧光探针。目标产物的产率为88%。

采用核磁共振仪对制得的吡咯双腙衍生物进行核磁共振分析，结果如下：

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆ ), δ (ppm): 11.35 (s, 1H, NH), 8.40 (s, 1H, CH),7.24 (s, 1H, NH), 3.57 (t, 4H, 2CH₂), 2.41-2.44 (m, 8H, 4CH₂), 2.35 (s, 3H,CH₃), 2.25 (s, 3H, CH₃). 具体核磁共振氢图谱见图1；

质谱ESI-MS: m/z = 555.3218 for [M+H]⁺ (Calc. 555.33); 278.1798 for [M+2H]²⁺ (Calc. 278.175); 185.7870 for [M+3H]³⁺ (Calc. 185.7866)。具体质谱谱图见图2。

实施例2

含吡咯双腙衍生物对汞离子的光学性质测定

将上述实施例1制得的吡咯双腙衍生物作为荧光探针在乙腈/HEPES缓冲溶液 (v:v,7:3, 0.02 mol/L，pH = 5)中配制成摩尔浓度为1×10^-5 mol／L的溶液，分别在含摩尔浓度为2×10^-5 mol/L的金属离子（Ag⁺, Al³⁺, Ca²⁺, Cd²⁺, Co²⁺, Cr³⁺, Cu²⁺, Fe³⁺, Hg²⁺,K⁺,Mg²⁺, Mn²⁺, Na⁺, Ni²⁺, Pb²⁺和Zn²⁺）溶液中加入等量的上述荧光探针溶液，采用紫外可见分光光度计或荧光光谱仪进行分析（激发波长为410 nm），所得紫外和荧光光谱图见图3。通过图3可以看出，本发明制得的吡咯双腙衍生物作为探针只对汞离子具有明显响应，紫外信号和荧光信号均可用于汞离子的快速鉴别，而其它离子无变化。

通过图4的滴定光谱计算可以得到Hg²⁺检出限为1.50×10^-7 mol/L，紫外光谱和荧光光谱的线性检测范围分别为4.5×10^-6-1.65×10^-5 mol／L和6.0×10^-6-1.8×10^-5 mol／L,因此本发明制得的吡咯双腙衍生物可用于汞离子的紫外和荧光定量检测。

实施例3

吡咯双腙衍生物荧光探针在细胞内汞离子的检测实验

HeLa细胞用1×10^-5 mol／L的上述实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针在37℃下培育30分钟，加入Hg²⁺（2×10^-5 mol／L）后再培育30分钟，获得在HeLa细胞的荧光成像图，具体如图5所示，其中其中：a为上述荧光探针蓝色通道荧光成像图；b为上述荧光探针明场图；c为上述荧光探针明场图和荧光图叠加后的图片；d为上述荧光探针+ Hg²⁺蓝色通道荧光成像图；e为上述荧光探针+ Hg²⁺明场下的成像图；f为上述荧光探针Hg²⁺明场图和荧光图叠加后的图片。HeLa细胞中加入吡咯双腙衍生物荧光探针产生弱荧光，而再加入Hg²⁺后荧光明显增强。故本发明实施例1制得的吡咯双腙衍生物可用于细胞中Hg²⁺的定性检测。

HeLa细胞用1×10^-5 mol／L的上述实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针+ Hg²⁺（3×10^-5 mol／L）和商用溶酶体定位染料LysoTracker Red在37℃下共同培育30分钟，获得在HeLa细胞的荧光成像图，具体如图6所示，其中：a为蓝色通道荧光成像图；b为红色通道荧光成像图；c为蓝色通道和红色通道叠加后的图片；d为明场图； e为蓝色通道、红色通道和明场叠加后的图片；f为蓝色通道和红色通道强度分布叠加图。HeLa细胞中探针+Hg²⁺蓝色通道荧光和LysoTracker Red红色通道荧光基本吻合，重叠系数为0.93。故本发明实施例1制得的吡咯双腙衍生物荧光探针检测细胞溶酶体内的汞离子。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。