浒苔多糖在降低泡沫细胞脂质堆积中的应用
阅读说明：本技术 浒苔多糖在降低泡沫细胞脂质堆积中的应用 (Application of enteromorpha polysaccharide in reducing foam cell lipid accumulation ) 是由 赵丽华 宋淑亮 陈锚 赵佳锐 朱兰兰 马士玉 关浩 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体而言,提供了一种浒苔多糖在降低泡沫细胞脂质堆积中的应用。实验发现浒苔多糖可以显著降低泡沫细胞的脂质堆积,促进泡沫细胞恢复成正常巨噬细胞,这不仅扩展了浒苔多糖的用途,也为预防或治疗动脉粥样硬化提供了新的方向。(The invention relates to the technical field of biology, and particularly provides application of enteromorpha polysaccharide in reducing foam cell lipid accumulation. Experiments show that the enteromorpha polysaccharide can obviously reduce the lipid accumulation of foam cells and promote the foam cells to recover to normal macrophages, thereby not only expanding the application of the enteromorpha polysaccharide, but also providing a new direction for preventing or treating atherosclerosis.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种浒苔多糖在降低泡沫细胞脂质堆积中的应用。
背景技术
我国海藻资源十分丰富，生物活性物质的种类也很多，有待进一步开发。近年来，国内外专家们均致力于海藻多糖的药理功能、生物活性功能的研究，取得了长足的进展，也展示出了海藻多糖广阔的开发前景。研究表明海藻多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化以及抗菌消炎等功效。海藻中含有丰富的多糖类物质，能将食糜中的脂肪带出体外，具有良好的降脂、降胆固醇的功效。从海藻中提取多糖，对海洋生物制药具有重大意义。
浒苔（Enteromorpha），又名苔菜、苔条，是一种绿藻门绿藻纲石莼科浒苔属的藻类植物，主要生长在沿海沙滩的石砾上，繁殖能力强，四季均可生长。浒苔富含多种对机体有益的物质，具有较高的营养价值，是我国沿海居民经常采摘食用和用作饲料的藻类。浒苔多糖是浒苔的主要活性物质之一，据相关研究发现，浒苔多糖对机体具有多种生物学效应，主要功能包括抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、抗病毒促生长作用等。海洋生态环境恶化导致我国东部沿海浒苔频繁爆发，造成养殖业和旅游业的巨大损失。因此，通过研发和利用将浒苔变废为宝，对相关产业的发展和资源合理利用具有重要意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供浒苔多糖的应用。
本发明的第二目的在于提供非疾病诊断与治疗目的的用于降低泡沫细胞脂质堆积的试剂。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
浒苔多糖在非疾病诊断与治疗目的的降低泡沫细胞脂质堆积或制备降低泡沫细胞脂质堆积产品中的应用，所述浒苔多糖通过水提醇沉法得到。
进一步地，所述浒苔多糖的使用浓度为≥100μg/mL。
进一步地，所述浒苔多糖的使用浓度为800μg/mL。
进一步地，水提醇沉法的步骤包括：浒苔粉依次经超声水溶、过滤和浓缩后，加入乙醇得到沉降物浒苔多糖。
进一步地，乙醇与浓缩液的体积比为（4-6）：1；浒苔与水的体积比为1：（5-10）；水与浓缩液的体积比为（4-2）：1。
进一步地，超声条件包括：35-45KHz，55-65 min。
进一步地，降低泡沫细胞脂质堆积具体为清除泡沫细胞内ox-LDL。
进一步地，产品包括试剂或药物。
一种非疾病诊断与治疗目的的用于降低泡沫细胞脂质堆积的试剂，所述试剂包括上述应用中的浒苔多糖。
进一步地，所述浒苔多糖的使用浓度为100-800μg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供浒苔多糖在非疾病诊断与治疗目的的降低泡沫细胞脂质堆积或制备降低泡沫细胞脂质堆积产品中的应用，该浒苔多糖通过水提醇沉法得到。实验发现浒苔多糖可以显著降低泡沫细胞的脂质堆积，促进泡沫细胞恢复成正常巨噬细胞，这不仅扩展了浒苔多糖的用途，也为预防或治疗动脉粥样硬化提供了新的方向。
本发明提供的非疾病诊断与治疗目的的用于降低泡沫细胞脂质堆积的试剂，可以显著降低泡沫细胞脂质堆积，作为科研用途、阳性试剂、造模试剂等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例5中油红O染色测定不同浓度浒苔多糖降低泡沫细胞脂质堆积效果的结果（n=3）；
图2为实施例6中胆固醇试剂盒测定浒苔多糖降低泡沫细胞脂质堆积效果的结果（n=3）。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明提供浒苔多糖在非疾病诊断与治疗目的的降低泡沫细胞脂质堆积或制备降低泡沫细胞脂质堆积产品中的应用，浒苔多糖通过水提醇沉法得到。
实验发现浒苔多糖可以显著降低泡沫细胞的脂质堆积，促进泡沫细胞恢复成正常巨噬细胞，这不仅扩展了浒苔多糖的用途，也为预防或治疗动脉粥样硬化提供了新的方向。
浒苔多糖的主要提取方法包括水提醇沉法、物理处理法、碱处理法和酶处理法。本发明选用水提醇沉法，该方法简单、易操作，成本低，安全性高，不会产生溶剂残留的问题。
在优选的实施方式中，水提醇沉法的步骤包括：浒苔粉依次经超声水溶、过滤和浓缩后，加入乙醇得到沉降物浒苔多糖。浒苔制成粉状，超声水溶可以提高浒苔的溶解速率，提高提取效率避免高温加热。过滤和浓缩是为了除去不溶性的杂质，同时提高浒苔多糖浓度，便于醇沉。浓缩优选采用旋转蒸发的方法。加入乙醇是通过降低多糖溶解度的方法，将溶液中的浒苔多糖沉淀出来。
由于提取效率的影响因素包括物料比和乙醇用量等等，所以，在优选的实施方式中，乙醇与浓缩液的体积比为（4-6）：1；浒苔与水的体积比为1：（5-10）；水与浓缩液的体积比为（4-2）：1。此外，超声条件为35-45KHz，55-65min，优选为40KHz，60min。
经试验验证得知，浒苔多糖可以清除泡沫细胞内的ox-LDL，从而降低泡沫细胞脂质堆积。随着浒苔多糖浓度的升高，浒苔多糖降低泡沫细胞脂质堆积的能力逐渐加强，当浒苔多糖的浓度为800μg/mL时，浒苔多糖能够显著降低泡沫细胞脂质堆积，其程度可达到51.1%。
将浒苔多糖作为主要活性成分制备得到的产品，例如试剂或药物等，具有降低泡沫细胞脂质堆积的功能。本发明提供相关的试剂，作为科研用途、阳性试剂、造模试剂等。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1：浒苔多糖的提取
取1kg的浒苔，清洗干净表面杂质，烘干后用高速中药粉碎机打碎成粉，加入10倍体积的蒸馏水并超声水浴(40KHz，60min)，得到浒苔液。静置过夜后过滤除去不溶性沉淀并对所得滤液以旋转蒸发的方式浓缩体积到原体积四分之一，随后向浓缩液中加入5倍体积量的乙醇，静置过夜后以4000rpm的速度离心20min得沉淀，用无水乙醇洗三次去除小分子物质并继续用4000rpm的速度离心10min，弃掉乙醇得到湿产物，置于烘箱中烘干后即得最终产物。
实施例2：浒苔多糖的提取
取1kg的浒苔，清洗干净表面杂质，烘干后用高速中药粉碎机打碎成粉，加入5倍体积的蒸馏水并超声水浴(40KHz，60min)，得到浒苔液。静置过夜后过滤除去不溶性沉淀并对所得滤液以旋转蒸发的方式浓缩体积到原体积四分之一，随后向浓缩液中加入5倍体积量的乙醇，静置过夜后以4000rpm的速度离心20min得沉淀，用无水乙醇洗三次去除小分子物质并继续用4000rpm的速度离心10min，弃掉乙醇得到湿产物，置于烘箱中烘干后即得最终产物。
实施例3：浒苔多糖的提取
取1kg的浒苔，清洗干净表面杂质，烘干后用高速中药粉碎机打碎成粉，加入10倍体积的蒸馏水并超声水浴(40KHz，60min)，得到浒苔液。静置过夜后过滤除去不溶性沉淀并对所得滤液以旋转蒸发的方式浓缩体积到原体积二分之一，随后向浓缩液中加入5倍体积量的乙醇，静置过夜后以4000rpm的速度离心20min得沉淀，用无水乙醇洗三次去除小分子物质并继续用4000rpm的速度离心15min，弃掉乙醇得到湿产物，置于烘箱中烘干后即得最终产物。
将实施例1-3中得到的浒苔多糖重量进行统计，结果如表1所示。
表1浒苔多糖提取结果（n=3）
结果表明，实施例1多糖提取率较高。
实施例4：浒苔多糖总糖含量和硫酸根含量测定
采用SN/T 4260-2015苯酚-硫酸法测定浒苔多糖总糖含量：
试剂准备：浓硫酸；80%乙醇溶液；葡萄糖；80%苯酚溶液（称取80 g苯酚于100 mL烧杯中，加水溶解，转至100 mL棕色容量瓶中定容，置4 ℃冰箱中避光保存）；5%苯酚溶液（吸取5 mL 80%苯酚溶液，溶于75 mL水中，混匀，现用现配）；100 mg/L标准葡萄糖溶液（称取0.100 g葡萄糖于100 ml烧杯中，加水溶解，定容至1000mL）。
样品准备：取待测浒苔多糖 10 mg，溶于5mL纯水配制成2000μg/mL溶液，4℃过夜充分溶解，取1mL于20mL具塞试管中，待测。
标准曲线准备：分别吸取0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，、1.0 mL的标准葡萄糖工作溶液置于20 mL具塞试管中，用蒸馏水补至1.0 ml，待测。
测定：向待测试液中加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL浓硫酸，静置10 min，使用旋涡振荡器使其充分混合，后将试管放置于30 ℃水浴中反应20min。紫外分光光度计490 nm下测吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，计算标准曲线和样品中总糖含量。
采用GB13025891氯化钡明胶法测定浒苔多糖中硫酸根含量：
试剂准备：0.5%明胶（0.5g明胶水浴60-70 ℃下溶于100 mL纯水中，充分溶解12h，过0.45 um超滤膜超滤）；氯化钡-明胶溶液（0.5 g氯化钡溶解于100 mL 0.5%的明胶中，搅拌充分，4℃保存备用）；硫酸钾标准液（68mg硫酸钾溶于纯水，定容体积至100 mL）；1M硝酸溶液500 mL。
标准曲线准备：分别量取0mL，2 mL，4mL，6mL，8mL，10 mL，12 mL，14mL配制好的硫酸钾溶液，用1M硝酸定容体积至25 mL，待测。
样品准备：分别取待测浒苔多糖 10 mg，溶于5mL纯水配制成2000 ug/mL溶液，4℃过夜充分溶解。
测定：分别取2 mL待测液于具塞试管，加5 mL浓硝酸，沸水浴180 min酸解。将酸解液定容体积至10 mL，分别取2 mL，每管分别加3mL氯化钡-明胶溶液充分摇匀。紫外分光光度计360 nm下测吸光度，以硫酸根浓度[SO4 2-]为横坐标，吸光度为纵坐标，计算标准曲线和样品中[SO4 2-]。
表2浒苔多糖总糖量和硫酸根含量（n=3）
结果表明，实施例1，2，3所制备的浒苔多糖其总糖含量和硫酸根含量较为接近。
实施例5：油红O法测定浒苔多糖降低泡沫细胞脂质堆积效果
将密度为5×104个/ mL 的RAW264.7细胞接种于24孔板，于37℃，5% CO2环境中继续培养24 h后给与80μg/mL的ox-LDL，孵育24h 后，加入不同浓度（0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL）的浒苔多糖继续孵育24h，随后使用油红O进行脂滴染色。
结果如图1所示。结果表明，随着浒苔多糖浓度的升高，泡沫细胞中的脂滴含量逐渐减少。
实施例6：胆固醇酯含量试剂盒测定浒苔多糖降低泡沫细胞脂质堆积效果
将密度为5×104个/ mL 的RAW264.7细胞接种于24孔板，于37℃，5% CO2环境中继续培养24 h后给与80μg/mL的ox-LDL，孵育24h 后，加入不同浓度（0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL）的浒苔多糖继续孵育24h，随后使用胆固醇试剂盒进行胆固醇酯的含量测定。
结果如图2所示，随着浒苔多糖浓度的升高，浒苔多糖降低泡沫细胞脂质堆积的能力逐渐加强。当浒苔多糖的浓度为800μg/mL时，浒苔多糖能够显著降低泡沫细胞脂质堆积，其程度可达到23.7%。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
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