小檗碱生物碱在预防和/或治疗肠疾病中的作用
阅读说明：本技术 小檗碱生物碱在预防和/或治疗肠疾病中的作用 (Use of berberine alkaloid in preventing and/or treating intestinal diseases ) 是由 D·X·于 Z·肖 C·波顿 Z·何 于 2018-01-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及小檗碱生物碱类,其制剂及它们在预防和/或治疗动物中的传染病,特别是产气荚膜梭菌和艾美球虫属引起的疾病中的用途。本发明还涉及通过施用小檗碱组合物来改善食物生产动物中的饲料转化率。(The present invention relates to berberine alkaloids, formulations thereof and their use in the prevention and/or treatment of infectious diseases in animals, in particular diseases caused by clostridium perfringens and eimeria. The invention also relates to improving feed conversion ratio in food producing animals by administering the berberine composition.)
发明领域
本发明涉及小檗碱生物碱类，其制剂及它们在预防和/或治疗动物中的传染病(ifectious disease)中的用途。特别的是，本发明涉及小檗碱生物碱类，其制剂以及它们在预防和/或治疗食物生产(food-producing)动物中包括细菌、病毒、寄生虫或真菌感染(infection)的传染病中的用途。
背景技术
数十年来，抗生素的使用一直是全球动物生产的主要问题。据估计，全世界每年使用约63,000吨抗生素来饲养牛，鸡和猪，这大约是全球医生为抗击人类感染而开据的抗生素的两倍，目前的趋势暗示，世界范围内动物对抗生素的消耗将在未来20年内增长三分之二。
抗生素已被补充到动物和家禽饲料中，不仅可以治疗和控制感染，而且还可以在低剂量作为生长促进剂，并被认为改善产品质量，导致肉中更低的脂肪百分比和更高的蛋白质含量。根据国家动物卫生局(NOAH，2001)，它们被用来“帮助生长中的动物更有效地消化它们的食物，从中获得最大的收益，并使它们成长为强壮健康的个体”，从而为农民带来经济优势。因此，重要的是要增加和发展具有作为抗生素抗击传染病的潜力并具有成本效益的药剂库(armamentarium)。
抗微生物药抗性(resistance)(AMR)是自然过程，其中微生物进化为能够抵抗药物的作用，从而使其失效。随着时间的流逝，这导致抗生素变得效力降低，在极端情况下，最终无用。AMR日益成为一个问题，其原因在于发现新抗生素的速度已大大降低，并且因此新药的数量非常有限。同时，抗生素的使用呈指数增长，增加了抗性的发展。
最近，对食物生产动物中抗生素的使用再次进行了审查，人们越来越担心它们的过度使用会通过促进动物中抗生素抗性细菌的选择而促进抗生素抗性基因的传播。此外，动物产生的废料可能含有抗生素残留，导致它们在环境中的传播更加广泛。这些是密集化畜牧方法的主要问题，其使用引起的问题主要是发达国家的问题而不是发展中国家的问题。
抗微生物药抗性(AMR)威胁有效预防和治疗由细菌，寄生虫，病毒和真菌引起的不断增加的感染范围。AMR对全球公共卫生的威胁日益严重，需要所有政府部门和社会采取行动。食物生产动物中抗生素的广泛使用和过度使用导致出现了污染食物的抗生素抗性细菌，然后导致出现了依次可发展出抗生素抗性感染的消费者。图1描绘了AMR从食物生产动物到人类的传播。
人们担心的是，食物生产动物中的过度使用抗生素导致抗性细菌向人类的传播，然后人类中过度使用抗生素会依次导致“超级细菌”，这种细菌对几类抗生素都有抗性。据估计，超级细菌每年在中国和美国已造成超过320,000例死亡，到2050年，死亡人数预计将超过1000万，并给世界造成了超过100万亿美元的损失。
对现有抗微生物药物有抗性的全球感染负担正以惊人的速度增长。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(MRSA)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是医院获得性感染的主要原因。肺炎克雷伯菌是常见的肠细菌，在某些国家甚至已经对通过β-内酰胺碳青霉烯抗生素的最后治疗手段产生了抗性。在世界许多地方，由于对氟喹诺酮类抗生素的抗性，由大肠杆菌引起的***的治疗现已无效。
β-内酰胺类抗生素和氟喹诺酮类的使用可导致继发感染和进一步的并发症，例如艰难梭菌(Clostridium difficile)(CD)的过度生长。CD是一种细菌，可引起从腹泻到威胁生命的结肠炎症的范围内的症状。CD疾病通常在长期护理机构中影响老年人，通常发生在使用抗生素药物治疗后。但是，研究表明，在传统上不被认为具有高风险的人群中、例如没有抗生素使用史或未曾接触过卫生保健设施的年轻且健康的个体中，CD感染率正在上升。在美国，每年约有五十万人由于CD毒素的释放而生病，并且近年来，随着抗微生物药抗性的上升，CD感染变得更加频繁，严重且难以治疗。具有讽刺意味的是，CD的标准治疗方法是其他抗生素：甲硝唑用于轻度至中度感染；万古霉素用于更严重的感染。但是，多达20％的具有CD的人会再次生病。复发两次或更多次后，进一步的复发率提高到65％。
与由相同细菌的非抗性菌株感染的患者相比，由抗性细菌引起的感染患者处于更坏的临床后果和死亡风险中，并且消耗更多的卫生保健资源。抗微生物药抗性是一个复杂的问题，它影响着整个社会，并且受到许多相互关联的因素的驱动。单一、孤立的干预措施影响有限。需要采取协调一致的行动以最大程度地减少抗微生物药抗性的出现和扩散。重要的是开发新的抗微生物药物作为替代物以解决人类和动物健康面临的全球抗性问题。
主要政府监管机构现在已经在执行在控制在食物生产动物中使用抗生素方面严格的新指令和立法，以减少对抗性的选择，所述主要政府监管机构包括欧盟、FDA、澳大利亚农业与***。食物行业的主要公司，例如麦当劳和沃尔玛，正在提出自己的倡议，以减少食物中抗生素的使用。
淘汰或禁止在动物中使用抗生素将并已导致许多后果。美国动物卫生研究所估计，如果不使用促进生长的抗生素，美国将需要额外的4.52亿只鸡，2300万头牛和1200万头猪才能达到目前实践所达到的生产水平，这导致农业的经济负担更大。
更令人担忧的是，减少或停止使用抗生素以及改变畜牧实践已导致某些动物疾病变得更加普遍和流行。例如家禽中的坏死性肠炎(Necrotic Enteritis)。欧洲国家(例如法国和斯堪的纳维亚半岛)报道了这一点，这些国家禁止使用抗生素生长促进剂伴有坏死性肠炎发病率的急剧增加，这表明抗生素生长促进剂在控制该疾病方面具有预防作用。随着越来越多的国家实施减少抗生素使用的政策，目前国际家禽业坏死性肠炎的费用估计约为每年20亿美元，预计还会进一步增加。其他疾病对家禽业造成重大损失，例如球虫病、斑点性肝疾病已成为蛋鸡(layer)死亡的主要原因，并降低了蛋的产量。
减少或停止抗生素的使用以及畜牧实践的改变也影响了养猪业，其中疾病变得更加普遍和流行。与肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli)相关的腹泻和与短螺旋体属(Brachyspira)相关的猪痢疾暴发是造成猪高死亡率和发病率的原因。对养猪业也有害的是与胞内劳森菌(Lawsonia intracellulari)相关并影响小肠的回肠炎的一组病症。该组病症包括猪肠腺病，坏死性肠炎，局限性回肠炎和增生性出血性肠病。
沙门氏菌病是最常见且分布最广泛的食物中毒之一，由沙门氏菌引起。据估计，全世界每年有数千万的人类病例发生，这种疾病导致多于数十万人死亡。沙门氏菌血清型的抗微生物药抗性一直是一个全球性问题。监测数据表明，沙门氏菌的总体抗微生物药抗性从1990年代初的20％至30％明显增加到本世纪初某些国家的70％。沙门氏菌生活在饲养动物(尤其是鸡和牛)的肠中。它可以在水，食物或被感染动物或人类的粪便污染的表面上被发现(图2描绘了沙门氏菌感染和食物中毒的各个方面)。
弯曲杆菌病(campylobacteriosis)是由称为弯曲杆菌(CB)的细菌引起的胃肠疾病，也是食物传播疾病的主要原因。CB主要通过食用或饮用受污染的食物(主要是家禽)、水或未经巴氏消毒的牛奶传播给人类。CB还可以通过与感染(infected)人群接触或与携带细菌的猫、狗和家畜(farm animal)接触而传播。图3显示了流行病学。
大多数感染了CB的人会出现腹泻、绞痛、腹痛和发烧，其持续一到两周。通常在感染后2至5天内出现症状。腹泻可能含有血液或粘液。在极少数情况下，CB可以进入血液并引起更严重的疾病。任何人都可以患弯曲杆菌病，尽管很小的儿童、老人、免疫力低下的人和与家畜打交道的人感染的风险更大。治疗通常涉及补液，但在严重或复杂的情况下，应开处方使用诸如红霉素的抗生素以减少疾病持续时间。
更具体的是，家禽尸体/肉的CB污染持续发生。通过清洗和除脏术，控制CB污染的方法已集中在加工厂。但是，据认为，如果在宰杀之前可以控制禽类肠道中CB的定殖(colonisation)，那么就可以减少经加工禽类的污染。
强制减少或停止使用抗生素导致进入“后抗生素时代”，这导致需要考虑和开发替代物以治疗、控制和保护食物生产动物(和人类)免受疾病侵害。当前，需要包括含药饲料的药物，其可以用于减轻与减少或停止使用抗生素以及随之而来的疾病暴发相关的问题。迄今为止，还没有发现一种可以替代动物饲料中抗生素的具有成本效益的预防或治疗剂。
本公开内容涉及用于预防和/或治疗动物中的传染病的方法，其中所述方法包括向所述动物施用小檗碱生物碱(berberine alkaloid)。
本公开内容还涉及包含小檗碱生物碱和动物食品(foodstuff)的动物饲料，其中小檗碱生物碱的量为动物食品的约0.001％w/w至2％w/w。
本公开内容还涉及一种给药方案，其包括施用本文公开的小檗碱生物碱或动物饲料，其中所述小檗碱生物碱或动物饲料以有效预防和/或治疗动物中的传染病的量施用1至6周。
本公开内容还涉及一种用于降低食物生产动物中的饲料转化率的方法，其中所述方法包括向食物生产动物施用本文公开的小檗碱生物碱或动物饲料的步骤。
本公开内容还涉及用于预防或治疗动物中的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及预防或治疗动物中传染性肠疾病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及用于预防或治疗动物中由艾美球虫属(Eimeria)引起的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及预防或治疗动物中由梭菌属(genus Clostridium)细菌引起的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料，其中细菌是产气荚膜梭菌(C.perfringen)。
本发明还涉及小檗碱生物碱在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
本公开内容还涉及小檗碱生物碱在预防和/或治疗以下的用途：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
本公开内容还涉及用于预防和/或治疗以下的小檗碱生物碱：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
定义
如本文所用的术语“可接受的赋形剂”是指可以安全地用于施用的固体或液体填充剂，载体，稀释剂或包囊物质。根据特定的施用途径，可以使用本领域众所周知的多种载体。这些载体或赋形剂可以选自糖，淀粉，纤维素及其衍生物，麦芽(malt)，明胶，滑石粉，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，等渗盐水和无热原的水。赋形剂在例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第21版，LippincottWilliams和Wilkins，2005年中进行了讨论。
如本文所用的术语“可接受的盐”是指对于全身施用在毒理学上安全的盐。可接受的盐，包括可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子在以下中有描述：P.L.Gould，International Journal of Pharmaceutics，1986，11月，33(1-3)，201-217；S.M.Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science，1977年1月，66(1)，1；P.Heinrich Stahl，Camille G.Wermuth(编辑)，Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selectionand Use，第二修订版，Wiley，2011年。当然，本发明的酸性或碱性化合物的可接受的盐可以通过常规方法制备(例如使游离酸与所需成盐的碱反应或使游离碱与所需成盐的酸反应)。
酸性化合物的可接受的盐包括具有阳离子的盐，并且可以选自碱金属或碱土金属的盐，包括钠、锂、钾、钙、镁等、以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺、三乙醇胺等，以及与有机碱形成的盐。合适的有机碱包括N-甲基-D-葡糖胺，精氨酸，苄星青霉素，二乙醇胺，乙醇胺，普鲁卡因和氨丁三醇。
碱性化合物的可接受的盐包括具有阴离子的盐，并且可以选自有机或无机酸。合适的阴离子包括乙酸根，酰基硫酸根，酰基磺酸根，己二酸根，抗坏血酸根，苯甲酸根，苯磺酸根，溴化物(bromide)，樟脑磺酸根，癸酸根，己酸根，辛酸根，氯化物(chloride)，柠檬酸根，丁二酸二辛基磺酸根(docusate)，乙二磺酸根，丙酸酯十二烷基硫酸根(estolate)，甲酸根，富马酸根，葡庚糖酸根，葡萄糖酸根，葡糖醛酸根，马尿酸根，海克酸根，氢溴酸根，盐酸根，碘化物(iodide)，羟乙磺酸根，乳酸根，乳糖酸根，月桂酸根，苹果酸根，马来酸根，甲磺酸根，甲基溴化物，甲基硫酸根，萘磺酸根，硝酸根，辛酸根，油酸根，双羟萘酸根，磷酸根，聚半乳糖醛酸根，水杨酸根，硬脂酸根，琥珀酸根，硫酸根，磺酸根，磺基水杨酸根，单宁酸根，酒石酸根，对苯二甲酸根，甲苯磺酸根，三乙基碘化物(triethiodide)等。
小檗碱是带正电的季铵阳离子。小檗碱的可接受的盐包括但不限于氯化物，半硫酸盐(hemisulfate)和碘化物盐。
如本文所用，“可接受的溶剂”是出于本公开内容的目的可能不干扰溶质的生物学活性的溶剂。合适的溶剂的例子包括但不限于水，乙醇和乙酸，甘油，液体聚乙二醇及其混合物。特定的溶剂是水。术语“溶剂化物”是指由溶质(例如，小檗碱生物碱)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。特别的是，所使用的溶剂是本文所定义的“可接受的溶剂”。当水是溶剂时，该分子称为水合物。
如本文所用，“IRP001”是指小檗碱，如本文所述，其是具有抗微生物活性的季铵阳离子和植物天然产物。术语“IRP001”和“小檗碱”在本文可互换使用。如本文所用，“IRP001氯化物”或“IRP001 Cl”表示小檗碱的氯化物盐；和“IRP001硫酸盐”是小檗碱的半硫酸盐。因此，应当理解，术语“IRP001硫酸盐”，“小檗碱硫酸盐”，“IRP001半硫酸盐，和“小檗碱半硫酸盐”在本文中是等同的。小檗碱季铵阳离子以及氯化物和半硫酸盐的分子结构如图4所示。
如本文所用，术语“小檗碱生物碱(类)”是指小檗碱和与小檗碱具有相似结构和特征并且适合于本发明的组合物/方法/用途的化合物。此类化合物包括但不限于原小檗碱(protoberberine)：小檗红碱(berberrubine)，异种荷包牡丹碱(coreximine)，四氢非洲防己碱，药根碱，13-羟基小檗碱氯化物(chloride)，甲氧檗因(coralyne chloride)，7,8-二氢-13-甲基小檗碱，黄藤素(非洲防己碱)和13-苄基小檗碱。
小檗碱生物碱类可以不同的异构体或不同的异构体形式存在，例如各种互变异构体或互变异构体形式。将理解的是，术语“小檗碱生物碱(类)”涵盖彼此分离的不同异构体形式以及组合。
小檗碱生物碱类也可以以各种无定形形式和结晶形式(即多晶型物)存在。还应理解，术语“小檗碱生物碱(类)”涵盖彼此分离的不同无定形和结晶形式以及组合。
如本文所用，术语“小檗碱生物碱(类)”包括可接受的盐，溶剂化物，所述盐的溶剂化物或其前药。
如本文所用，术语“食物生产动物”是指被养殖以生产用于供另一种动物例如人食用的食物的动物。应当理解，术语“食物生产动物”包括例如鸡或猪。
将理解的是，术语“异构体”是指结构或构造异构体，互变异构体，区域异构体，几何异构体或立体异构体，包括对映异构体或非对映异构体。此外，外消旋体应理解为包含一对对映异构体的等摩尔混合物。
将理解的是，术语“前药”是指化合物的非活性形式，其在体内转化为活性形式。合适的前药包括化合物活性形式的酯，膦酸酯等。关于前药的进一步讨论可以在以下中找到：Stella，V.J.等人，“Prodrugs”，Drug Delivery Systems，1985，pp.112-176，Drugs，1985，29，pp.455-473和“Design of Prodrugs”，ed.H.Bundgard，Elsevier，1985年。
如本文所用，小檗碱的“安全”残留水平是引起疾病、特别是癌症的不显著风险的水平。
如本文所用，术语“治疗”，“医治”等是指疾病、障碍或病症的控制、治愈或改善，或疾病、障碍或病症的进展速度的降低，或防御或抑制症状或副作用，降低症状或副作用发展的严重程度，和/或减少动物受试者遭受的症状或副作用的数量或类型，这是与不施用包含本发明的化合物的药物组合物相比。术语“治疗”包括用于姑息治疗(palliativesetting)。
如本文所用的术语“预防”，“防止”等旨在涵盖用于延迟或减慢疾病、障碍或病症、或其症状或副作用的发展的治疗。
关于“预防”和“治疗”，如本文所用，术语“有效量”是指当施用于动物时达到期望效果的量。例如，本文公开的组合物的有效量是预防或治疗鸡中的坏死性肠炎的量。抗微生物药的确切总有效量取决于治疗的目的和其他因素，包括动物受试者(例如鸡与猪)，施用途径，体重和疾病的严重程度。
附图说明
图1描绘了AMR从食物生产动物到人类的传播。图取自https://www.cdc.gov/ foodsafety/challenges/from-farm-to-table.html。
图2描述了沙门氏菌感染和食物中毒的各个方面。图取自http://thelancet.com/ journals/lancet/article/PIIS0140-6736(11)61752-2/fulltext和https:// www.epainassist.com/abdominal-pain/stomach/food-poisoning。
图3描述了弯曲杆菌流行病学。图取自https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/10/ 6/04-0403-f1。
图4描绘了小檗碱季铵阳离子、小檗碱氯化物和小檗碱半硫酸盐的分子结构。
图5至图12描绘了实施例1中所述的鸡坏死性肠炎先导研究的结果。
图5是每组在尸检之前的禽死亡率的图。
图6是描述按治疗/攻击组的中位数小肠病变得分的图。
图7描绘了坏死性肠炎病变得分。
图8第9组禽十二指肠的照片；NE攻击的，IVP/小檗碱水1.0g/L
图9第6组禽十二指肠的照片；NE攻击的，无小檗碱治疗
图10第12组禽十二指肠的照片；NE攻击的IVP/小檗碱饲料2.0g/kg
图11第4组禽十二指肠的照片；无攻击IVP小檗碱水1.0g/L。
图12第6组禽十二指肠的照片；NE攻击的，没有IVP/小檗碱。
图13描绘了本公开内容中所指的代表性化合物的分子结构和名称。
图14描绘了本发明的其他代表性化合物的分子结构和名称：
图15描绘了实施例2中所述的坏死性肠炎先导研究的总个体水摄入量(阶段1)。
图16描述了实施例2中所述的坏死性肠炎先导研究的总个体水摄入量(阶段2)。
图17描绘了实施例2中所述的坏死性肠炎先导研究的饲料转化率(阶段1和2)。
图18描绘了用于实施例3中描述的研究的具有日龄小鸡的畜舍布置。
图19描述了在实施例3中描述的研究的第14天从播种者(seeder)畜舍收集的垫料(litter)。
图20描绘了在实施例3中描述的研究的第14天每个畜舍分配的400克垫料。
图21是按治疗组在实施例3中描述的研究中禽的平均日体重增加的图：y轴的平均日增加(ADG)(g/天)相对于x轴的生长期(天)。治疗组1(对照组)：治疗组2(IVP 0.30g/kg)；治疗组3(IVP 0.10g/kg)；治疗组4(IVP 0.03g/kg)；治疗组5(沙利霉素(Salino)60ppm)；治疗组6(沙利霉素+杆菌肽锌(Zn Bacitracin)50ppm(Salino Zn Bac))。
图22描述了在对照育肥期(finisher)和实施例3、治疗组2中使用的IVP之间的比较(IVP的剂量为0.30g/kg)。
图23描绘了来自实施例3的治疗组2的禽类在第42天的粪便(IVP的剂量为0.30g/kg)。
图24来自实施例3的堆型艾美球虫(E.acervulina)型病变(来自十二指肠的外部和内部)，得分+1。
图25来自实施例3的堆型艾美球虫(E.acervulina)型病变，得分+2和+3。
图26实施例3的堆型艾美球虫(E.acervulina)型病变，得分+4。
图27来自实施例3的肠的体腔膨胀(ballooning)。
图28实施例3的上部肠(upper gut)充血(白色箭头；左侧标题)和肠半透明(黑色箭头；右侧标题)。
图29来自实施例3的含水的肠内容物，包括橙色粘液。
图30描绘了在42天时校正的饲料转化率与在21天时肠球虫病病变总得分之间的相关性。实线显示最佳拟合线；虚线显示95％置信区间。
下面描述本公开内容的特定实施方案。将意识到，这些实施方案是说明性的而非限制性的。
发明详述
本公开内容涉及预防和/或治疗动物中的传染病的方法，其中所述方法包括向所述动物施用小檗碱生物碱或其可接受的盐。
在本文公开的方法(和动物饲料；给药方案和用途)中：动物优选是人。所述动物优选是非人。优选地，非人动物是食物生产动物。食物生产动物优选选自鸡或猪。优选地，动物是水生动物。水生动物优选是有鳍鱼(finfish)。优选地，水生动物是水生有壳类动物(shellfish)。水生有壳类动物(shellfish)优选选自甲壳动物或软体动物。优选地，甲壳动物选自螃蟹，鳌虾(crayfish)，龙虾，对虾(prawn)和小虾。软体动物优选地选自蛤(clam)，贻贝，牡蛎，扇贝和田螺(winkle)。优选地，动物是哺乳动物。哺乳动物优选是人，马，狗，猫，绵羊，牛，猪或灵长类动物。优选地，动物是禽。禽优选是鸡，鹅，火鸡或鸭。
斑点性肝疾病
优选地，传染病是肝疾病或肠疾病。优选地，传染病是肠疾病。肝疾病优选是斑点性肝疾病，动物是鸡。优选地，鸡是产蛋鸡。斑点性肝疾病优选由弯曲杆菌属(Campylobacter)细菌引起。优选地，弯曲杆菌是抗生素抗性的。
沙门氏菌病(Salmonellosis)
优选地，传染病与食物中毒有关。食物中毒优选是沙门氏菌病。优选地，沙门氏菌病是由沙门氏菌的抗生素抗性菌株引起的。
弯曲杆菌病(Campylobacteriosis)
优选地，传染病是弯曲杆菌病。弯曲杆菌病优选地由弯曲杆菌的抗生素抗性菌株引起。
病原体为大肠杆菌的传染病：猪腹泻/泻病(Scour)
优选地，传染病是由大肠杆菌引起的。
在吮吸仔猪(sucking piglet)的所有疾病中，腹泻是最常见的，可能也是最重要的。在某些暴发中，它是导致高发病率和高死亡率的原因。在运行良好的群中，在任何时候应有少于3％的一窝仔畜需要治疗，腹泻造成的仔猪死亡率应低于0.5％。但是，在严重的暴发中，死亡率水平可能会上升到7％或更高，在个别未治疗的仔猪中，死亡率水平可能上升到至多100％。主要的细菌原因是大肠杆菌。在吮吸期间的任何年龄均可发生仔猪的泻病，但通常在5天之前以及7至14天之间有两个高峰期。
传染病优选是腹泻，而动物是猪。优选地，传染病是泻病，而动物是猪。传染病优选是痢疾，而动物是猪。
优选地，传染病是由大肠杆菌的抗生素抗性菌株引起的。
与短螺旋体属(Brachyspira)有关的猪痢疾
猪痢疾(SD)是由一种称为短螺旋体属的气旋细菌引起的，其中包括猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)，多毛短螺旋体(Brachyspira piloscoli)和汉普森短螺旋体(Brachyspira hampsonii)。该生物体引起大肠的严重炎症，其伴有血性粘液腹泻(bloody mucous diarrhoea)。该疾病的高昂费用与发病率，死亡率，生长抑制和饲料转化效率以及持续不断的饲料内药物治疗费用有关。
优选地，传染病是由短螺旋体属细菌引起的。传染病优选是痢疾，而动物是猪。优选地，传染病是由短螺旋体属的抗生素抗性菌株引起的。
传染病优选由劳森菌(Lawsonia)属细菌引起。优选地，传染病是由劳森菌属的抗生素抗性细菌菌株引起的。传染病优选由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)引起。
猪回肠炎相关胞内劳森菌
回肠炎包括一组病症，该病症涉及与细菌胞内劳森菌相关的小肠的病理变化。该疾病有四种不同形式。第一种形式是猪肠腺病(PIA)，是沿肠排列的细胞的异常增殖。PIA可以发展为其他三种罕见的形式：坏死性肠炎(NE)，其中小肠的增殖细胞死亡并脱落，伴有小肠的总增厚(软管状肠(hosepipe gut))。局限性回肠炎(RI)，小肠终部发炎和增生性出血性肠病(PHE)或“血肠(bloody gut)”，其中小肠大量出血。PHE是生长猪中最常见的回肠炎形式。PHE在60公斤的猪和后备母猪(gilt)中更为常见。
优选地，传染病由选自以下的一组病症代表：猪肠腺病，坏死性肠炎，局限性回肠炎和增生性出血性肠病，并且所述动物是猪。
艾美球虫(Eimeria)为病原体的传染病
优选地，传染病是由艾美球虫属的寄生虫引起的。所述寄生虫优选选自巨型艾美球虫(E.maxima)，堆型艾美球虫(E.acervuline)和布氏艾美球虫(E.brunette)。优选地，传染病是由艾美球虫属的抗生素抗性寄生虫引起的。抗生素抗性寄生虫优选选自巨型艾美球虫，堆型艾美球虫(E.acervuline)和布氏艾美球虫抗生素抗性细菌菌株。优选地，传染病是球虫病，而动物是鸡。
梭菌为病原体的传染病
优选地，传染病是由梭菌属细菌引起的。细菌优选地选自：艰难梭菌(Clostridiumdifficile)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)。
优选地，细菌是艰难梭菌(C.difficile)。传染病优选是腹泻，而动物是人。优选地，传染病是结肠炎，而动物是人。
鸡产气荚膜梭菌和坏死性肠炎
优选地，传染病由梭菌属的细菌引起，其中细菌是产气荚膜梭菌。传染病是由梭菌属的抗生素抗性细菌引起的，其中，抗生素抗性细菌是抗生素抗性产气荚膜梭菌。
传染病优选是坏死性肠炎，而动物是鸡。优选地，坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌A型菌株引起的。产气荚膜梭菌A型菌株优选为产气荚膜梭菌A型菌株EHE-NE36。优选地，产气荚膜梭菌A型菌株是产气荚膜梭菌A型菌株EHE-NE18。坏死性肠炎优选由产气荚膜梭菌C型菌株引起。
优选地，经由鸡的饲料或水进行施用。饲料优选为碎裂料(crumble)或粒料(pellet)的形式。
优选地，小檗碱生物碱以0.001g/kg至2.0g/kg饲料的剂量在鸡的饲料中施用。小檗碱生物碱优选以0.003g/kg至0.3g/kg饲料的剂量在饲料中施用。小檗碱生物碱优选以0.001g/L至1g/L水的剂量在鸡的水中施用。
优选地，减少病变得分和/或减少粪便卵囊计数(fecal oocyst count)。优选地，减少病变得分。优选地，减少粪便卵囊计数。优选降低发病率。优选地，降低死亡率。优选地，FCR降低。优选地，在平均每日体重增加中有增加。
饲料安全性和残留水平
出于安全性原因，对人和动物药物和动物饲料添加剂进行了严格管制。在澳大利亚，治疗产品管理局(TGA)负责管理供人类使用的治疗产品，而澳大利亚农药和兽药管理局(APMVA)负责对农药和兽药进行评估和注册。在美国，食物药物管理局(FDA)负责批准受联邦食物、药物和化妆品法案(FD&C Act)管制的人和动物药物以及饲料添加剂。
FD&C法案要求证明用于食物生产动物的化合物是安全的，由暴露于这些化合物的动物生产的食物对于人消费是安全的。尤其是，法规(21CFR第500部分，E亚部分-食物生产动物中使用的致癌化合物的规定)禁止在食物生产动物中使用当被人或动物摄入时被发现诱发癌症的任何化合物，除非某些条件被符合(所谓的“二乙基己烯雌酚(DES)限制性条款(Proviso)”)。根据DES限制性条款，如果可以通过规定的检查方法确定在合理确定在实践中一定要遵循的使用条件下，由食物生产动物生产的食物中发现可疑的致癌化合物“无残留”，则不禁止使用所述可疑的致癌化合物。
尽管小檗碱生物碱类的安全性被例如小檗碱生物碱类作为人类膳食补充剂的广泛使用证明，但小檗碱却被怀疑是一种致癌剂，尽管小檗碱本身具有抗癌活性。(Ma,W.；Zhu,M.；Zhang,D.；Yang,L.；Yang,T.；Li,X.；和Zhang,Y.“Berberine inhibits theproliferationand migration of breast cancer ZR-75-30cells by targetingEphrin-B2”Phytomedicine 2017,25:45-51)。因此，如果FDA决定将小檗碱作为致癌化合物进行管理，除非适用“无残留”DES限制性条款，否则美国法规禁止在食物生产动物中使用小檗碱。
术语“无残留”是指可食用组织中剩余的任何残留含量如此之低，以至于对消费者而言，其表现出不显著的致癌风险。更具体地说，将癌症的不显著的风险定义为风险增加1百万分之一。
如本文所用，小檗碱的“安全”残留水平是造成疾病、特别是癌症的不显著的风险的水平。
优选地，治疗期后动物中小檗碱生物碱的残留水平低。在治疗期之后，动物中优选存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期之后，在鸡的肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。每g肌肉组织的残留水平至少低于约13ng小檗碱生物碱。
优选地，每g肌肉组织的残留水平为约10ng小檗碱生物碱。残留物含量优选为约5ng/g。
优选地，小檗碱生物碱已经以约0.3g/kg的比率在鸡的饲料中施用。鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平优选如下：
鸡胸脯(breast of chicken)的肌肉组织中约6.1ng/g；
鸡小腿(lower leg of chicken)的肌肉组织中约5.5ng/g；和
鸡大腿(upper leg of chicken)的肌肉组织中约11.6ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以小于约小于0.1g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，小檗碱生物碱以约0.03g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。35.鸡肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平优选如下：
鸡胸脯的肌肉组织中低于2ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中低于2ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中低于2ng/g。
优选地，在治疗期和清除期后，动物的肌肉组织中存在低残留水平的小檗碱生物碱。在治疗期和清除期之后，优选在动物的肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期和清除期之后，在鸡的肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，清除期为1-2周。清除期优选选自以下的期间：1天至14天之间；1天至7天之间；1天至4天之间；和1天至2天之间。优选地，清除期是选自1天、2天、4天、7天和14天的期间。
优选地，在1天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平如下：
鸡胸脯的肌肉组织中约5.7ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中约3.2ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中约6.0ng/g。
优选地，在2天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平如下：
鸡胸脯的肌肉组织中约3.6ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中约3.1ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中约4.5ng/g。
优选地，在4、7和14天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平低于2ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以约0.3g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
残留水平优选至少低于每g肌肉组织13ng小檗碱生物碱。残留水平优选为每g肌肉组织约10ng小檗碱生物碱。优选地，残留水平为约5ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以约大于0.1g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在的小檗碱生物碱的残留水平低。优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期之后，在鸡的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。鸡的肝脏和肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平优选低于2ng/g。优选地，小檗碱生物碱以约0.03g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期和清除期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在低残留水平的小檗碱生物碱。优选地，在治疗期和清除期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期和清除期之后，在鸡的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。清除期优选为1周至2周之间的期间。优选地，清除期是选自以下的期间：1天至14天之间；1天至7天之间；1天至4天之间；和1天至2天之间。清除期优选为选自1天、2天、4天、7天和14天的期间。
优选地，在1天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平如下：
鸡胸脯的肌肉组织中约5.7ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中约3.2ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中约6.0ng/g，
和鸡的肝脏组织中的小檗碱生物碱残留水平为约8.0ng/g。
优选地，在7天的清除期后，鸡的胸脯、小腿和大腿的肌肉组织中的小檗碱生物碱的残留水平低于2ng/g，并且鸡的肝脏组织中的小檗碱生物碱的残留水平为约6.5ng/g。
优选地，在14天的清除期之后，鸡的胸脯、小腿和大腿的肌肉组织中的小檗碱生物碱的残留水平低于2ng/g，并且鸡的肝脏组织中的小檗碱生物碱的残留水平为约3.0ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以约0.3g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在低残留水平的小檗碱生物碱。优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期之后，在鸡的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。鸡的肝脏组织和胸脯、小腿和大腿的肌肉组织中的小檗碱生物碱的残留水平优选低于2ng/g。优选地，小檗碱生物碱以约0.03g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期和清除期之后，在鸡的肝脏组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。清除期优选为选自1周至2周之间的期间。优选地，清除期是选自以下的期间：1天至14天之间；1天至7天之间；1天至4天之间；和1天至2天之间。清除期优选为选自1天、2天、4天、7天和14天的期间。
优选地，在1天的清除期后，鸡的肝脏组织中小檗碱生物碱的残留水平为约8.0ng/g。在7天的清除期后，鸡的肝脏组织中小檗碱生物碱的残留水平优选为约6.5ng/g。优选地，在14天的清除期后，鸡的肝脏组织中小檗碱生物碱的残留水平为约3.0ng/g。小檗碱生物碱优选以约0.3g/kg的剂量在鸡饲料中施用。
优选地，治疗期为35天。
其他地方描述了“残留研究”。小檗碱生物碱的残留水平可以通过实验确定。使用LC-MS/MS确定动物组织中小檗碱生物碱残留水平的示例方案如下：
安乐死后，从每只禽切除胸脯，小腿(leg)和大腿(thigh)的肌肉以及肝脏和肾脏样品。将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品并移出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析小檗碱，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱的ng)。
小檗碱制剂的施用
优选地，小檗碱生物碱是小檗碱半硫酸盐。小檗碱生物碱优选为小檗碱氯化物。
优选地，所述方法进一步包括掩蔽小檗碱生物碱或可接受的盐的苦味的添加剂。
小檗碱
小檗碱是从黄连(Rhizoma coptidis)，黄柏(Phellodendri chinensis cortex)和其他草药中提取的异喹啉生物碱。根据中国药典，黄连，黄柏(Phellodendri chinensis)和黄檗(Phellodendron amurense)和三颗针(Berberidis radix)的小檗碱含量分别为5.5％，3.0％，0.6％和0.6％。黄连(Rhizoma coptidis)(汉语拼音为Huanglian)属于毛莨科(Ranunculaceae)，包含三个主要的黄连属的种：味连(Coptis chinensis，汉语拼音为Weilian)，雅连(Coptis deltoidea，汉语拼音为Yalian)和云连(Coptis teeta，汉语拼音为Yunlian)。黄连在秋季被收获，除去纤维状根后切成薄片。那些具有嫩黄色的部分和非常苦的味道的黄连被认为是优质的。小檗碱(和本文公开的其他小檗碱生物碱类)的苦味使得掩蔽味道/适口性成为配制用于施用给动物受试者的小檗碱生物碱类时要考虑的重要问题。
小檗碱是黄色粉末。氯化物盐微溶于冷水，但易溶于沸水。它实际上不溶于冷乙醇。半硫酸盐可溶于约30份水，微溶于乙醇。小檗碱是一种季铵阳离子，分子式为C20H18NO4 +，分子量为336.36。图4描绘了小檗碱铵阳离子，小檗碱氯化物盐和小檗碱半硫酸盐的分子结构。
小檗碱可以肠内施用可接受的任何形式施用。用于肠内施用的合适的非限制性形式包括片剂，胶囊，糊剂，颗粒剂，可咀嚼的薄片(chewable wafer)，凝胶剂，口服液，注射液，含药水和含药饲料(medicated feed)以及栓剂。然而，对于经济利益重要的食物生产动物，小檗碱的优选施用方法是通过颗粒形式的饲料添加剂或含药饲料。也可以通过将水与小檗碱的合适溶液或悬浮液混合，通过动物受试者的饮用水来施用小檗碱。
本公开内容还预期提供可以添加到食物和水中的颗粒剂和液体制剂，其使得本文公开的制剂对例如食物生产动物受试者更可口。例如，可口的小檗碱生物碱制剂可包含小檗碱和适于形成粒状产品的可接受的赋形剂。适于形成粒状产品的可接受的赋形剂是例如玉米淀粉或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一个实例中，液体制剂是液体浓缩物。
也有许多化合物具有与小檗碱相似的结构和特性，包括原小檗碱：小檗红碱，异种荷包牡丹碱，四氢非洲防己碱，药根碱，13-羟基小檗碱氯化物，甲氧檗因，7,8-二氢-13-甲基小檗碱，黄藤素(非洲防己碱)和13-苄基小檗碱。原小檗碱与小檗碱一起适用于本发明的组合物/方法/用途，并且在说明书中称为“小檗碱生物碱类”。
黄藤素(非洲防己碱)
黄藤素或非洲防己碱是从黄藤(Fibauera recisa Pierre)提取的苦味生物碱。根据中国药典的规定，黄藤含有不少于2.0％的黄藤素。其它来源是黄连(Coptidisrhizoma)，味连(Coptis chinensis Franch)、雅连(Coptis deltoidea)和云连(Coptisteeta Wall)的根茎。黄连包含不少于1.5％的黄藤素。
氯化非洲防己碱为黄色固体，溶于热水，微溶于水，微溶于乙醇。熔点为196-198℃。其分子式为C21H22NO4Cl，分子量为387.86。图13列出了非洲防己碱季铵阳离子的分子结构和氯化物盐的结构。
制备的饲料中抗微生物化合物的总有效量或剂量可以为0.001g/kg至2g/kg。制备的饲料中的抗微生物化合物总量的示例量为：0.001g/kg(0.0001％)，0.003g/kg(0.0003％)，0.01g/kg(0.001％)，0.03g/kg(0.003％)，0.1g/kg(0.01％)，0.3g/kg(0.03％)，1.0g/kg(0.1％)和2g/kg(0.2％)。
本公开内容还涉及包含小檗碱生物碱和动物食品的动物饲料，其中小檗碱生物碱的量为动物食品的约0.001％至1％w/w。
食品中小檗碱生物碱的量可以在0.001g/kg至2g/kg的范围内，即0.001％至0.2％w/w。食品中小檗碱生物碱的示例含量为：0.001g/kg(0.0001％)，0.003g/kg(0.0003％)，0.01g/kg(0.001％)，0.03g/kg(0.003％)，0.1g/kg(0.01％)，0.3g/kg(0.03％)，1.0g/kg(0.1％)和2.0g/kg(0.2％)。
饲料优选为碎裂料(crumble)；粒料形式；或水性形式。
本公开内容还涉及一种给药方案，该给药方案包括向动物施用本文所公开的小檗碱生物碱或动物饲料，其中所述小檗碱生物碱或所述组合物或动物饲料以有效预防和/或治疗动物的传染病的量施用1至6周。
优选地，将小檗碱生物碱或动物饲料喂食1、2、3、4、5或6周。优选地，将小檗碱生物碱或动物饲料喂食1至6周；2至5周；或3到4周之间。
优选地，小檗碱生物碱以约0.6g/L水中或约1.2g/kg饲料中的浓度施用。饲料中小檗碱生物碱的量可以在0.001g/kg至2g/kg，即0.0001％至0.2％w/w的范围内。食品中的小檗碱生物碱或可接受的盐的示例量为：0.001g/kg(0.0001％)，0.003g/kg(0.0003％)，0.01g/kg(0.0001％)，0.03g/kg(0.0003％)，0.1g/kg(0.01％)，0.3g/kg(0.03％)，1.0g/kg(0.1％)和2g/kg(0.2％)。
本公开内容还涉及一种用于降低食物生产动物中的饲料转化率的方法，其中所述方法包括向食物生产动物施用小檗碱生物碱的步骤。
优选地，食物生产动物没有疾病。食物生产动物优选患病。优选地，食物生产动物选自鸡或猪。食物生产动物优选是鸡。
本公开内容还涉及一种用于预防或治疗动物中的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及一种用于预防或治疗动物中传染性肠疾病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及一种用于预防或治疗动物中由艾美球虫属引起的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
优选地，传染病是由艾美球虫属的抗生素抗性寄生虫引起的。传染病优选是球虫病，而动物是鸡。
优选地，传染病是坏死性肠炎，而动物是鸡。
本公开内容还涉及小檗碱生物碱在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
本公开内容还涉及小檗碱生物碱在预防和/或治疗以下中的用途：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
本公开内容还涉及用于预防和/或治疗以下的小檗碱生物碱：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
在以下研究中描述了用于预防或治疗动物中的传染病的制剂，剂量和方案的开发。
制剂和适口性研究
在给肉用仔鸡(broiler)小鸡施用四种IRP001制剂后确定饲料适口性和禽生产率的研究。
研究设计–收到后，将二百四十只(240)日龄的商品肉用仔鸡小鸡平均分入单独的地面畜舍上，并使其适应环境7天。在第7天，将禽称重并按顺序将它们分配给十六(16)组，每组15只禽。饲料摄入量，水摄入量，体重增加和死亡率被用作结果参数。
调查研究的兽医产品(IVP)
表1用于制剂和适口性研究的IVP
名称
组分
剂量水平(g/kg)＊
掩蔽的IRP001氯化物
30％IRP001
2.7，5.3和10.7
掩蔽的IRP001硫酸盐
10％IRP001
8.0，16.0和32.0
未掩蔽的IRP001氯化物
100％IRP001
0.4，0.8和1.6
未掩蔽的IRP001硫酸盐
100％IRP001
0.4，0.8和1.6
＊剂量基于饲料中IRP001的固定浓度
根据下表2中详述的治疗方案对研究动物给药。无限制地在相关治疗中向鸡提供含药饲料，因为鸡的唯一饲料来源，饮用水也是无限制地提供的。
表2治疗方案
表3事件时间表
根据上面可以记录动物(和安乐死后的器官)的食物和水摄入量以及体重。可以计算出整个治疗期的平均体重增加，平均每日体重增加以及饲料转化率(FCR)。可以通过这些参数评估动物的表现。同样，食物和水摄入量参数可以指示药物的适口性，而体重增加和饲料转化率(FCR)参数可以提供IVP的抗生素作用，即IVP促进生长的程度。
饲料转化效率研究
确定当通过饲料向商品肉用仔鸡小鸡施用时IRP001的饲料转化效率和组织残留的研究。还研究了清除期为1周的残留。
调查研究的兽医产品(IVP)
表4饲料转化效率研究的IVP
名称
组分
剂量水平(g/kg)
IRP001氯化物
100％IRP001氯化物
1.0，0.1，0.03和0.01
表5治疗方案
表6事件时间表
观察1周的清除期后，IRP0001的残留水平通过以下实验确定：
安乐死后，从每只禽切除胸脯，小腿和大腿以及肝脏和肾脏的肌肉样品。将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品，并取出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析IRP001，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱ng)。
IRP001对工业标准杆菌肽锌(Zinc Bacitracin)的功效研究
通过施用IRP001确定预防或治疗坏死性肠炎的功效，包括研究剂量反应，饲料转化率，组织残留和安全性。使用经过验证的实验模型，通过饲料将IRP001施用给采用艾美球虫属的种(Eimeria spp)和产气荚膜梭菌的致病菌株通过人工攻击(challenged)的肉用仔鸡小鸡。当前工业标准的治疗、杆菌肽锌用于功效和FCR比较。
研究设计(坏死性肠炎攻击)–隔离器中饲养(housed)的商品肉用仔鸡小鸡在9日龄时被在1mL的1％(w/v)无菌盐水中的巨型艾美球虫和堆型艾美球虫(E.acervuline)各自5,000株减毒的疫苗菌株孢子形成的卵囊和布氏艾美球虫2,500株孢子形成的卵囊口服感染。
在卵囊攻击后六天(第15天)，施用已知的致病性产气荚膜梭菌菌株(A型菌株NE18)，i.t.(
尸检时的饲料摄入量，体重增加，死亡率和NE病变得分均用作结果参数。
调查研究的兽医产品(IVP)-IRP001
表7 IRP001对工业标准杆菌肽锌的功效研究的IVP和剂量水平
名称
组成
剂量水平(克/公斤)
IRP001
100％IRP001
1.0、0.3、0.1、0.03
杆菌肽锌
工业标准
工业标准
表8攻击和治疗方案
表9事件时间表
IRP0001的残留水平可以通过以下实验确定：
安乐死后从每只禽切除胸脯，小腿和大腿以及肝脏和肾脏的肌肉样品，将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品并移出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析IRP001，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱的ng)。
剂量率研究
研究目的是评估IRP001在饲料中的三种剂量率对商品肉用小鸡中的中度混合球虫病攻击(艾美球虫属的种)的功效，和评估坏死性肠炎或非特异性肠炎的任何发生情况。安全性数据和组织残留数据将被获得。
研究设计(艾美球虫属攻击)–饲养在畜舍中的商品肉用仔鸡小鸡在14日龄(第14天)被野生型艾美球虫属卵囊感染；大约12,000个柔嫩艾美球虫(E.tenella)，40,000个堆型艾美球虫(E.acervuline)和尽可能多的巨型艾美球虫卵囊/禽。
卵囊攻击后7天(第21天)，从每个试验畜舍中随机选择每组四只禽并进行人道安乐死。
评估在第21天和尸检时的总体肠健康(肠炎)和病变得分，将饲料摄入量、体重增加和死亡率作为结果参数，计算每个时间段的饲料转化率。
调查研究的兽医产品(IVP)-IRP001
表10剂量率研究的IVP和对照
名称
组成
剂量水平(g/kg)
IRP001
100％IRP001
1.0、0.3和0.1
沙利霉素
工业标准
60ppm
沙利霉素+杆菌肽锌
工业标准
60ppm+50ppm
表11治疗和攻击方案
表12事件时间表
IRP0001的残留水平可以通过以下实验确定：
安乐死后从每只禽切除胸脯，小腿和大腿以及肝脏和肾脏的肌肉样品，将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品并移出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析IRP001，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱的ng)。
残留研究
这项研究和方案旨在通过对在整个生产周期内通过饲料喂食而治疗的肉用仔鸡小鸡中的标志物组织残留进行定量，来确定以最大标签剂量率施用的天然存在的IVP的残留消耗状况(depletion profile)。
背景
抗微生物药被广泛用于畜牧业，以控制和预防密集化畜牧业中潜在的致命疾病暴发。有人认为这是产生抗性微生物的原因，政府监管机构现在正在实施控制这些抗微生物剂的使用的指令。
发明人已经鉴定出几种天然存在的化合物，它们可以用作天然抗生素，以代替目前用于食物生产动物如家禽和猪中使用的抗生素。
候选制剂经过测试以符合监管标准，如例如按照澳大利亚农药和兽药管理局(APVMA)和美国食物药物监督管理局(FDA)要求的监管标准。在此方面，确定动物保健治疗的残留消耗状况是产品开发过程中必不可少的部分。这使政府监管部门可以设置适当的保留期(with-holding period)(WHP)，以保护人类健康和农产品贸易。
IRP001已被选为候选IVP，因为它已被确定为安全且无毒。由于鸡业广泛依赖抗微生物药来预防或治疗由肠病原体引起的多种疾病，因此已将家禽选为目标动物物种。这些临床上重要的肠病原体可能对IRP001有潜在反应。
合规
应当根据议定的方案使用SOP和良好的科学实践进行这个组织残留消耗研究。
研究设计
a.实验单位：实验单位和观察单位均为动物，统计单位为治疗组。
b.动物模型：将饲料摄入量，每天的水摄入量，体重变化，死亡率和组织中的标志物残留用作结果参数。
c.纳入标准：如果动物符合以下第10节中概述的标准，则将选择所述动物进行研究。
d.排除和移除标准：调查者认为收到后虚弱、患有疾病、受伤或因其他原因不适合纳入研究的动物将被排除在外。
选择后，只有得到发起人或调查者的书面同意，才将可能被认为不适合继续进行研究的动物移出。任何移出的原因将在原始数据和研究报告中得到充分记录和证明。被从研究中移出的动物将得到适当的兽医护理。
e.分配：肉用仔鸡小鸡：在收到后，将符合纳入标准的一百八十(180)只肉用仔鸡小鸡在从运输容器中被取出后、依次分配到十八(18)个单独的治疗组中，每组十(10)只禽。分配和随机化的方法将在原始数据和研究报告中进行描述。
f.盲化：不适用。
调查研究的兽医产品(IVP)
记录所有制剂细节，包括批号，有效期，收到和使用。
a.调查研究的兽医产品：IRP001 Cl作为100％IRP001 Cl。
b.来源：IVP将由发起人提供。
c.储存：IVP应在环境温度下在指定温度区域内储存。记录IVP的储存位置和条件。
d.安全性：发起人提供了SDS或其同等物(如果有)。
e.分析：为IVP提供了分析证书(如果有)。
f.药物处置：记录所有剩余IVP的处置。
治疗
a.剂量计算：剂量基于饲料中IRP001 Cl的固定浓度(0.03或0.1g/kg IRP001Cl)。
b.剂量制备：将粉末状IRP001 Cl并入市售饲料原料成分，然后在例如“混凝土混合器”型设备中充分混合，以提供所概述的饲料中最终浓度。
c.剂量施用方法：根据下表1中详细列出的治疗方案对研究动物进行给药。在相关治疗中，应无限制地向鸡提供含药饲料，作为其唯一的饲料来源。
表13治疗方案-饲料转化率
＊安乐死
＊＊注意：含药饲料在第28天从第6组和第12组撤出，以允许这些组有14天的清除期。
事件时间表
表1***时间表
测试系统
动物详细信息记录在原始数据中。即：物种，肉用仔鸡小鸡；数量，180；来源，商业的(一批90只)；年龄，一日龄。
动物管理
a.动物福利：对研究动物进行类似管理，并适当考虑其福利。根据动物伦理委员会(AEC)的要求观察研究动物，并完成“动物照管记录”。
b.健康管理：如有必要，应尽快进行任何常规的预防性治疗并记录下来(产品名称，批号，有效期，剂量，施用途径和日期)。
从第0天开始，在合适的位置根据标准操作规程(SOP)每天两次观察研究动物。记录任何需要进一步检查的健康问题。
所有健康问题和不良事件必须在一个工作日内报告给调查者。调查者认为与产品相关、导致死亡、危及生命、涉及大量动物或人类不良事件的任何不良事件，都必须记录并在一个工作日内报告给发起人和AEC。
可以执行常规兽医护理和程序，并在原始数据中进行描述。出于标准管理实践和人道原因，可以在调查者和发起人(如果相关)事先批准的情况下，并用药物疗法。没有施用类似于IVP的治疗。记录所有并用药物疗法，以提供所用材料的标识(产品名称，批号和有效期)，动物ID，使用原因，施用途径，施用的剂量和日期，并包括在原始数据(试验日志)和研究报告中。
如果受伤或疾病导致研究动物安乐死或死亡，应对此进行记录并在可能的情况下由兽医进行验尸。原始数据中包括“验尸报告”，包括可能的死亡原因。
研究报告中包括所有健康问题，不良事件和动物死亡率，包括它们与治疗的关系。
c.畜舍环境：治疗组将鸡饲养在经过批准的动物设施内的两个单独且离散的受控环境房间中的专用的鸡地面畜舍。一个房间可容纳第13至18组(含第13组和第18组)的所有未用药的禽，第二个房间可容纳第1至12组(含第1组和第12组)的所有用药的禽。每个畜舍的地面空间为约1.5m2。根据正常的商业惯例，将鸡在垫料上饲养。
到第49天为止，共有18个地面畜舍，每个畜舍有10只鸡。研究结束时，每个畜舍的最大鸡体重都远低于澳大利亚实用标准中建议的肉用小鸡最大值40kg/m2。
注意-第13至18组(含第13组和第18组)的禽(未治疗的对照动物)与药物治疗的第1至12组禽保持在相似但物理分离的隔离室中，从而确保研究期间无交叉污染。
d.实验饮食：在整个研究过程中，施用配制的商业育雏期(starter)配给量然后育成期(grower)配给量。原始数据中包含显示饲料成分的饲料袋标签或同等物的副本。
e.饲料和水摄入量：称重并记录每天添加的饲料，并计算每天的饲料摄入量(按治疗组)。测量并记录每天的水体积，并计算每天的水摄入量(按治疗组)。
f.动物处置：根据AEC的批准，对研究动物进行人道安乐死，并按照事件时间表中列出的间隔进行记录(表14)。
研究程序
a.试验日志：记录研究期间所有计划的和计划外的事件。
效果评估
a.体重：在第0天(组体重)和第7、14、21、28和35天称重鸡-记录各个动物的体重。在称重前后，使用校准的测试砝码检查称重秤并记录。将研究终止时的体重在各组之间进行比较，以确定治疗效果(如果有)。
b.检查：在总体病理学和组织收集时，对安乐死进行了单独的临床检查。记录临床检查。可以适当记录数字静态图像。
c.观察结果：每天两次检查禽的总体健康状况，通常是在早上8点之前和下午4点之后。因此，两次观察之间的典型间隔是白天9小时，过夜15小时。如果调查者认为显著患有异常临床症状(例如明显的衰弱且恢复可能性较低)，则记录显示异常临床症状的禽，对其仔细观察并对其实施安乐死。
d.尸检检查：在第35至49天之间，按照时间表-表14对所有禽实施安乐死和尸检。
e.总体病理学：对来自所有第1至18组的所有禽进行尸检并检查总体视觉病理学变化，这些变化被适当描述和评分(按个体禽)。
f.组织残留分析：按照时间表、表1，从每组(第1至18组(包含第1组和第18组))中六只(6)最重的禽收集肝脏、肾脏、胸脯肌肉(1)、腿部肌肉(2)[大腿上部和下部]和具有完整脂肪的全部的皮肤的双份代表性样品，并将其冷冻储存(<10摄氏度)，用于随后的标志物残留分析。在第35天将第13至18组的禽作为未治疗的对照禽处死，并收集组织以满足组织测定(tissue assay)要求。
样品将用不干胶标签标记，所述标签列出研究编号，动物ID，时间点，日期，样品类型和重复样品(replicate)。
为了进行残留分析，将样品融化，然后将已知重量的组织(约1g)在2ml水中匀浆。离心样品，并取出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析。
表15分析矩阵
g.样品的储存，转移和处置：记录样品的储存，转移和处置。将重复样品1组织样品在第10节中概述的时间在湿冰上冷冻运输到分析实验室。根据标准操作规程(SOP)，将样品与随附的温度数据记录仪和冷冻水瓶一起转移。在最后一个样品收集时间点之后，将重复样品2组织样品冷冻储存6个月的期间。超出这一点，根据研究现场的决定可将其丢弃，除非发起人代表明确要求不这样做。
统计分析
方法记录在研究报告中。
数据记录
方案规范将取代设施SOP。可以在研究过程中根据需要添加或修改研究表格，而无需进行方案修订或偏离。
a.方案批准：研究开始之前，方案由所有相关人员批准并签署(请参阅第1页)。
b.修改/偏离：修改是在执行更改或修改的任务之前对方案进行的更改或修改。修改必须说明更改的原因，并有书面记录的发起人授权。该修改必须由调查者和发起人签署。
在确定偏离时，调查者应记录、签署相对于本方案或适用的SOP的偏离和注明日期。将评估对研究的整体结果或完整性的影响。必须在切实可行的范围内尽快将偏离告知发起人。
相应地记录所有方案的修改和偏离，并根据发生的日期或识别的日期顺序编号。
c.文件注释：对文件注释进行了相应记录，以澄清否则从原始数据来看可能不明显的事件或情况。必须在切实可行的范围内尽快将文件注释告知发起人。
d.研究人员的变更：研究调查者或其他负责任研究人员的变更应相应记录。
e.原始数据：所有起始原始数据页均由进行观察的人员和记录信息的人员进行分页，用研究编号标识并签名并注明日期。
f.通讯日志：调查者保留与研究相关的所有信件的副本。记录会导致研究文档编制、设计、进行或研究报告发生变化的任何电话交谈。
g.许可：本方案中详细介绍的研究应包含在政府机构许可(例如APVMA小试验许可)中。
研究报告
研究报告由调查者或指定人员准备。包括测量的每个变量的数据清单。研究调查者的合规声明包含在研究报告中。附有原始数据和统计报告的原始签名研究报告将提交给发起人并存档。
沙门氏菌和弯曲杆菌的研究
本公开内容内容还预期预防或治疗由沙门氏菌或弯曲杆菌引起的传染病。以下描述用于研究小檗碱生物碱或小檗碱生物碱组合物在预防或治疗沙门氏菌或弯曲杆菌感染引起的疾病中的有效性的研究。这些研究以已发布的方案为模型：Alali，W.Q等人“Effectof essential oil compound on shedding and colonization of Salmonella entericserovar heidelberg in broilers”,Poultry Science,2013,92:836-841；Berghaus,R.等人“Enumeration of Salmonella and Campylobacter in environmental farm samplesand processing plant carcass rinses from commercial broiler chicken flocks”,Appl.Environ.Microbiol.2013,1-37；Cochran,W.G.,和G.M.Cox,Experimental Design.第二版John Wiley&Sons,New York,NY.第582-583页,1992(Cochran和Cox,1992)。
沙门氏菌研究
这项研究的目的是评估IVP作为控制肉用仔鸡禽类中海德堡沙门氏菌(Salmonella heidelberg)的一种手段的有效性。
实验设计
在这项十二(12)个畜舍的研究中，将六百(600)只小鸡分配到三(3)个治疗组中，每组有四(4)个重复区组(replicate block)，并分为每个畜舍五十(50)只禽。
使用随机完整区组设计将治疗组分配给畜舍(Cochran和Cox，1992)。治疗组如下：
1.无治疗–海德堡沙门氏菌攻击对照
2.治疗1-海德堡沙门氏菌攻击
3.治疗2-海德堡沙门氏菌攻击
该研究从放置禽(孵化日；DOT 0)开始，此时将禽分配给实验畜舍。仅将呈现健康的禽分配给研究用途，并记录所有未分配禽的最终数量和处置。在研究过程中，不会更换任何禽。在研究开始(DOT0)，DOT 35和结束(DOT 42)时记录畜舍的禽重量(kg)。
材料和方法
禽。获得了六百(600)只孵化日的Ross x Ross直孵(straight-run)肉用仔鸡小鸡。禽接受常规疫苗接种(HVTSB1)，并记录种鸡群数量信息。所有禽都以推荐剂量接种了商业球虫病疫苗。
畜舍和环境控制。在研究开始时，将在经过改良的具有坚固侧面和泥土地面的常规禽舍中，将五十(50)只肉用仔鸡小鸡分配到十二(12)个地面畜舍，其畜舍的尺寸为5x 10(1.00ft2/禽放养密度)。该设施采用风扇冷却。恒温控制燃气加热器是主要的热源。辅助加热灯(每个畜舍一[1]个灯)提供热量(需要时)。根据主要饲养员的建议，在环境湿度下饲养禽，并为其提供照明程序。放置时，每个畜舍包含大约四(4)英寸的新鲜松木屑。在研究过程中不更换垫料。每个畜舍包含一(1)个管投饲机和一(1)个钟形饮水器，从而形成五十(50)只禽/投饲机和饮水器的比例。
施用和饮水方法.无限制的.
饮食。施用的配给量如下：育雏期DOT 0到DOT 14，育成期DOT 14到DOT 35，以及育肥期DOT 35到DOT42。饮食以碎裂料(育雏期饲料)或粒料(育成期和育肥期饲料)的形式施用。这项研究的饲料制剂包括未加药的商业型肉用仔鸡育雏期、育成期和育肥期饮食，混合有适当的饲料，经计算分析可达到或超过NRC标准，除非明确规定要作为治疗方案的组成部分，否则不在任何饲料中添加抗生素。实验治疗饲料是从基础育雏期饲料制备的，所有基础饲料和用于制备治疗批次的测试物品的数量均已记录。为了确保所有测试物品的均匀分布，将治疗的饲料混合并在80℃的加利福尼亚制粒机中制粒(记录制粒温度)。混合完成后，将饲料分配到指定治疗组的畜舍中。将测试物品储存在SPRG气候控制储存区中。所有饮食，制剂和其他饲料信息被记录。
饲料变更。禽类从DOT 0到DOT 42接受适合的治疗的饲料。在DOT 14将配给量从育雏期更改为育成期，在DOT 35将配给量从育成期更改为育肥期。在那时，所有先前的饲料从每个畜舍移除，分别称重并替换为育肥期饲料。在DOT 42，将所有未消耗的育肥期饲料从畜舍上取下，分别称重并丢弃。
沙门氏菌接种。在DOT 0，每个畜舍的二十五(25)只小鸡(50％播种者)被标记，颜色编码(用于鉴定)，并经口给药(通过管饲法)107CFU抗萘啶酸的海德堡沙门氏菌。
沙门氏菌采样。从所有畜舍DOT 14和DOT 42收集Bootsocks拭子(bootsock swab)样品以测定沙门氏菌的环境污染。在完成每个拭子之间更换手套以减少潜在的样品交叉污染。从无菌袋中取出预先弄湿的Bootsock拭子(Solar Biologicals，Inc.，目录号BT SW-001)，放到用干净的新塑料靴子覆盖的脚上，在畜舍的周边和内部走动，取出Bootsock，然后将其放入标有畜舍号的无菌袋中。对每个畜舍重复该过程后，样品被适当地储存，然后提交以用于沙门氏菌分析。
盲肠沙门氏菌培养。在DOT 42完成盲肠采样。在DOT 42上，从每个畜舍中取出十(10)只水平暴露(未标记)的禽，对其进行安乐死(通过颈脱位法)，并无菌取出每只禽的盲肠。取出盲肠样品后，将其放入一(1)个无菌塑料样品袋(Fisher Scientific)中，贴上标签，储存在冰上，并提交以用于沙门氏菌分析。
沙门氏菌的分离和鉴定。所有提交的用于沙门氏菌分离和鉴定的样品(bootsock拭子和/或盲肠)在分析之前都在无菌Whirl Pack袋中的冰上储存。到达后，将四硫代硫酸盐(tetrothionate)肉汤加到Bootsock拭子样品中，同时称重盲肠，加入无菌盐水，将样品均质化(stomachered)。取出一(1)mL等分试样用于MPN分析，添加10X四硫代硫酸盐肉汤(Difco)溶液，并将样品在41.5℃孵育过夜。将一圈样品敲入木糖赖氨酸tergitol-4琼脂(XLT-4，Difco)平板上，将其在37℃孵育过夜。使用Poly-O沙门氏菌特异性抗血清(MiraVista，印第安纳波利斯，印第安纳州(Indianapolis,IN))，选择最多3个(三个)黑色菌落并确认为沙门氏菌阳性。(Berghaus等，2013；Alali等，2013)
沙门氏菌计数程序(MPN方法)。对于所有十(10)个水平暴露(未标记)和五(5)个直接攻击(标记)样品，将一(1)ml均质化的(stomachered)蛋白胨肉汤样品转移至96孔两(2)ml深模块(block)的第一行中的三(3)个相邻孔中。将0.1ml等分试样的样品转移至第二行0.9ml的四硫代硫酸盐肉汤中，对剩余各行重复上述程序(以产生五(5)个十倍的稀释液)，并孵育模块(在42℃持续24小时)(表16)。用针工具复制器将每个孔的一(1)μl转移到XLT-4琼脂(含萘啶酸)上，孵育平板(在37℃持续24小时)，记录每个样品的最终稀释度，并输入MPN计算器(确定样品MPN)。可疑沙门氏菌分离菌株已通过Poly-O沙门氏菌特异性抗血清(MiraVista，印第安纳波利斯，印第安纳州(Indianapolis,IN))确认。(Berghaus等，2013；Alali等，2013)。
表16沙门氏菌计数
疾病和球虫病控制。所有禽在一(1)日龄时通过喷雾柜接种美国农业部(USDA)批准的球虫疫苗。在研究期间不使用任何伴随药物疗法。为了防止交叉污染，进入畜舍时要穿塑料一次性靴子，并在每个畜舍之间进行更换。
禽的识别。畜舍是度量单位。畜舍的安全性将防止禽迁徙。
监测。监测所有禽类的总体鸡群(flock)状况，温度，光照，水，饲料，垫料状况以及意外的鸡舍状况/事件。在正常工作时间内每天两次记录发现的结果(在最后研究天记录一[1]个观察)。在星期六，星期日和观察到的假期中记录一(1)个观察。
死亡率。每天检查畜舍的死亡率。淘汰禽只是为了减轻痛苦。记录任何被淘汰(或发现死亡)的禽的日期和移出体重(kg)，对所有被淘汰(或死亡)的禽进行尸检，并记录以下信息：性别和可能的死亡原因。
禽和饲料处置。所有禽，死亡率和剩余饲料(包括混合器冲洗物(mixer flushes))均通过适当的伦理方法进行处置。
源数据控制和处理。数据用擦洗不掉的墨水记录，并带有清晰的条目，每个源数据表都经过签名(或初始化)，并通过单独的记录条目注明日期。所有源数据错误(和/或更改)均已初始化，注明日期，并在表格上直接编写了简短的解释性声明或错误代码。
数据管理。进行体重增加，饲料消耗，饲料转化和沙门氏菌结果的数据管理和统计分析。
事件日历
表17沙门氏菌研究事件日历
弯曲杆菌研究
这项研究是为了确定调查研究的兽医产品(IVP)减少空肠弯曲杆菌在肉用仔鸡盲肠中脱落(shed)(水平传播)和定殖的功效。
实验设计
收到一百二十(120)只日龄(非SPF)的商品肉用仔鸡。五(5)只禽通过颈脱位法而被安乐死，并为空肠弯曲杆菌培养其盲肠。剩余选定的一百零五(105)只禽在一个隔离室中随机分为三(3)组，该隔离室又分为三份，每组有35只禽。实验变量如下所示。给所有禽施用肉用仔鸡开始碎裂料饲料，并按以下规定进行治疗。
房间数量-1个分为3个禽空间
小鸡总数-120
立即被安乐死的小鸡数量-05
可再分为治疗组的禽数-105个治疗组-3
重复区组–N/A
每个房细分的禽-35
治疗组
1.没有治疗-空肠弯曲杆菌攻击
2.治疗1-空肠弯曲杆菌攻击
3.治疗2-空肠弯曲杆菌攻击
材料和方法
禽。获得了一百一十(110)只孵化日的Ross 708雄性肉用仔鸡小鸡。对禽进行性别鉴定，使其接受常规疫苗接种(HVTSB1)，并记录种鸡群数量信息。根据制造商的建议，禽在一(1)日龄的时候接受一(1)剂量商业批准的球虫疫苗。
畜舍和环境控制。在研究开始时，将一百零五(105)只孵化日的Ross 708雄性肉仔鸡小鸡分配到一(1)个隔离房间中。房间被细分为三(3)个相等的禽空间。每个空间三十五(35)只小鸡放置在每个房间中。每个房间的尺寸为13.4’x 15.7’(约2.0英尺2的放养密度)。隔离房间的环境由独立的HEPA过滤系统和带有一(1)个加热灯的加热泵单元控制，该加热灯在育雏过程中提供补充热量。禽在环境湿度下饲养。放置时，每个畜舍包含约四(4)英寸的窑干袋装新鲜松木屑。在本研究过程中不更换垫料。每个空间包含一(1)个管投饲机和一(1)个钟形饮水器(35禽/投饲机与饮水器的比率)。每天为禽提供光照二十四(24)小时。
施用和饮水方法。无限制的。
饮食。在整个研究过程中，给禽喂食肉用仔鸡育雏期饮食。未加药的商业型肉用仔鸡育雏期饮食与适当的饲料混合，经计算分析可达到或超过NRC标准，除非明确规定要作为治疗方案的组成部分，否则不在任何饲料中添加抗生素。饲料是从基础育雏期饲料制备的。混合完成后，将饲料分配到指定治疗组的畜舍中。测试物品储存在气候控制区域。所有饮食，制剂和饲料都有文件记录。
饲料变更。禽从DOT 0到DOT 35接受育雏期饲料。
空肠弯曲杆菌的施用方法：在DOT 14，每治疗35只禽口服管饲0.1ml空肠弯曲杆菌JB菌株肉汤，其中含有约106CFU/ml(小鸡剂量为约105CFU/ml)。
弯曲杆菌定殖评价：在DOT 0，培养五(5)只禽以用于空肠弯曲杆菌的患病率；DOT35，每次治疗通过颈脱位法安乐死三十三(33)只禽。无菌取出每只禽的盲肠，并将其放入无菌塑料采样袋(Fisher Scientific)中以用于弯曲杆菌分离分析。在弯曲杆菌分析之前，将所有样品储存在冰上。
弯曲杆菌计数程序：弯曲杆菌计数程序(直接计数)。对于每个样品，将一(1)ml匀浆化的Bolton肉汤样品转移到96孔两(2)ml深模块的第一行中的三(3)个相邻孔中。将0.1ml的等分试样转移至第二行的0.9ml的Bolton肉汤中，对剩余的行重复该程序(产生十二(12)个十倍的稀释液)，然后将每个孔中的0.1ml摊铺到Campy Cefex琼脂上(表18)。在弯曲杆菌气体存在下，将平板孵育(42℃持续24小时)，记录每个样品的最终稀释度。可疑弯曲杆菌分离菌株通过革兰氏染色证实。
表18弯曲杆菌计数
疾病控制。在研究期间将不使用任何伴随药物疗法。为防止交叉污染，进入房间时要穿一次性塑料靴子，并在每个房间之间更换。
禽的识别。畜舍是度量单位。畜舍的安全性将防止禽迁徙。
监测。监测所有禽类的总体鸡群状况，温度，光照，水，饲料，垫料状况以及意外的鸡舍状况/事件。在正常工作时间内每天两次记录发现的结果(在第35天记录一[1]个观察)。在星期六，星期日和观察到的假期中记录一(1)个观察。
死亡率。每天检查房间的死亡率。淘汰禽只是为了减轻痛苦。记录任何被淘汰(或发现死亡)的禽的日期和移出体重(kg)，对所有被淘汰(或死亡)的禽进行尸检，并记录以下信息：性别和可能的死亡原因。
禽和饲料处置。所有禽，死亡率和剩余饲料(包括混合器冲洗物(mixer flushes))均通过适当的伦理方法进行处置。
源数据控制和处理。数据用擦洗不掉的墨水记录，并带有清晰的条目，每个源数据表都经过签名(或初始化)，并通过单独的记录条目注明日期。所有源数据错误(和/或更改)均已初始化，注明日期，并在表格上直接编写了简短的解释性声明或错误代码。
数据管理。进行体重增加，饲料消耗，饲料转化和弯曲杆菌结果的数据管理和统计分析。
事件日历
表19弯曲杆菌事件日历
实施例
坏死性肠炎
坏死性肠炎是在诸如家禽的食物生产动物中发现的肠道感染。最早由Parish于1961年描述，是在家禽中由细菌产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的，可表现为急性临床疾病或亚临床疾病。尽管产气荚膜梭菌被认为是坏死性肠炎的病原体，但通常还需要其他促成因素使动物容易患病。公认的是，坏死性肠炎是一种多因素疾病过程，具有许多风险因素，包括艾美球虫属感染，去除抗生素生长促进剂，环境和管理条件，生理压力和免疫抑制，以及饮食的性质和形式。
坏死性肠炎是一种潜在的致命疾病，在饲养期间的最后几周内，连续几天可导致每天至多1％的群死亡率，累计总死亡率上升到30-50％。在亚临床形式中，对肠粘膜的损害导致减少的消化和吸收，减少的体重增加和增加的饲料转化率，从而导致商业性能下降。据报道，正是这种疾病的表现在家禽生产行业造成了最大的经济损失。此外，家禽中的产气荚膜梭菌具有通过食物链传播给人类的风险，其中产气荚膜梭菌是人类食物传播疾病暴发中经常分离的细菌病原体之一。
坏死性肠炎以前是由著名的抗菌药物如维吉霉素(virginiamycin)，杆菌肽等控制的。越来越多的国家禁止在食物生产动物中使用抗生素，导致坏死性肠炎的出现对动物和公共健康构成了严重威胁。
产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，存在于土壤，灰尘，粪便，饲料，家禽垫料和肠内容物中。它是极端多产的，能够产生各种毒素和酶。基于四种毒素(α，β，ε和ι)的产生，产气荚膜梭菌菌株被分类为五种毒素型(A，B，C，D和E)。已经提出坏死性肠炎是由A型引起的，在较小程度上由C型引起的，其中A型菌株产生染色体编码的α毒素，而C型菌株产生α毒素以及β毒素。
α毒素是一种磷脂酶C鞘磷脂酶，它水解磷脂并促进膜的组织解体，诱导诸如白三烯、血栓烷、血小板凝集因子和前列环素的介质的合成。这些介质导致血管收缩，血小板聚集和心肌功能障碍，导致急性死亡。β毒素诱导肠黏膜出血性坏死，虽然确切的机制尚不清楚。坏死性肠炎的病理学正在重新评估，同时正在寻找其他毒力因子。最近，有证据表明，α毒素可能在已经提出的坏死性肠炎的发病机理中没有主要作用，研究报告称使用非野生型α毒素使得导致该疾病的能力受损。证据表明，产气荚膜梭菌培养物上清液中的分子注入肠后，重现疾病样病理。最近的证据还表明，来自产气荚膜梭菌的NetB毒素可能在坏死性肠炎的发病机理中起着关键作用。
产气荚膜梭菌以低水平自然存在于肠道中，但正常肠微生物区系的紊乱可能导致该细菌快速增殖，从而导致坏死性肠炎的发展。鸡最通常在2至6周龄时受到感染，但是坏死性肠炎可能会在7至16周龄或甚至至多6个月的禽中发生。
该疾病的临床特征是鸡群死亡率突然增加，通常没有先兆，尽管湿垫料有时是一个早期指标。临床症状可能包括衰弱，脱水，嗜睡，羽毛褶皱，腹泻和饲料消耗减少，尽管死亡前的临床疾病持续时间很短，所以体重增加的减少并不明显。小肠可见肉眼可见的病变。十二指肠，空肠和回肠变得薄壁，易碎，膨胀并充满气体。另外，粘膜表面覆盖着灰棕色至黄绿色的两性膜或假膜。在其他器官以及红细胞和粘液囊的萎缩中也可能发现病变。坏死性肠炎的亚临床形式相当难以识别，对抗生素类似物治疗有反应的病禽通常被认为患有该病。尽管湿垫料并不总是起源于梭菌，但湿垫料通常会促使家禽养殖场立即采取抗生素治疗。另外，在亚临床坏死性肠炎中报告了肠粘膜轻度坏死。实施例1描述了小檗碱硫酸盐(IRP001硫酸盐)在预防或治疗坏死性肠炎中的用途。
实施例1
一项先导研究，旨在利用经过验证的实验模型，确定IRP001硫酸盐在预防(口服，通过饲料)和治疗(口服，通过饮用水)施用给无特定病原体鸡时的剂量反应、功效和安全性，所述鸡经过人工采用产气荚膜梭菌攻击。
材料和方法
研究设计(坏死性肠炎攻击)–隔离器中饲养的商品肉用仔鸡小鸡在9日龄时被1mL的1％(w/v)无菌盐水中的巨型艾美球虫和堆型艾美球虫(E.acervuline)各个5,000个减毒的疫苗菌株孢子形成的卵囊以及布氏艾美球虫2500个孢子形成的卵囊口服感染。
在卵囊攻击后五天和六天(第14和15天)，施用了已知的致病性产气荚膜梭菌菌株(A型菌株EHE-NE36，CSIRO Livestock Industries，Geelong，Australia)，i.t.(
调查研究的兽医产品(IVP)-IRP001小檗碱半硫酸盐(IRP001硫酸盐)
表20攻击和治疗方案
表21事件时间表
结果
表22中位数病变得分的总结数据
表23尸检前肉用仔鸡死亡率
相对于无治疗组和用在水中0.1g/L或在饲料中0.2g/kg治疗组，引入在水中1.0g/L或在饲料中2.0g/kg的IRP001硫酸盐导致NE攻击的肉用仔鸡的死亡率显著降低(见图5)。无治疗、0.1g/L水和0.2g/kg在饲料中组的死亡率与NE攻击的肉用仔鸡的死亡率无显著差异。
发病率也降低了。相对于在接受NE攻击的肉用仔鸡中、无治疗组，引入在水中1.0g/L或在饲料中2.0g/kg的IRP001硫酸盐导致小肠病变得分显著降低(参见图6到12)。相反的是，相对于NE攻击的肉用仔鸡中无治疗，引入在水中0.1g/L或在饲料中0.2g/kg的IRP001没有导致中位数病变得分降低。
实施例2
一项后续研究，用于确定在饲料中或在水中提供给肉用仔鸡小鸡的IRP001半硫酸盐(未掩蔽的)的单一制剂的并入后的饲料的适口性，饲料和水的消耗以及禽生产力。该研究探讨了治疗开始日期方面的最佳治疗方案。
材料与方法
研究设计
阶段1：在收到后，在第0天，依次将两百七十(270)只日龄的商品肉用仔鸡小鸡分配为由十六(16)个只单独的地面畜舍接收所述小鸡，每个畜舍16或17只禽。
阶段2：在收到后，在第22天，依次将九十(90)只日龄的商品肉用仔鸡小鸡分配为由四(4)个单独的地面畜舍接收所述小鸡，每个畜舍22或23只禽。
饲料摄入量，水摄入量，体重增加和死亡率被用作结果参数。
调查研究的兽医产品(IVP)
表24实施例2的IVP
表25阶段1–第0天的日龄小鸡
表26阶段2–第22天接受的日龄小鸡
组
制剂
IVP浓度在饲料中(g/kg)
IVP浓度在水中(g/L)
治疗天数
处死天
17
无
-
-
-
42
18
无
-
-
-
42
19
IVP
2
-
25-42
42
20
IVP
2
-
25-42
42
表27事件时间表
结果
使用每天给每个畜舍提供的饲料和水总量的数字除以每个畜舍中的禽的数量，计算出阶段1和阶段2(以及在组/畜舍2、15和16继续两个阶段的禽类的整个试验)的个体每天的饲料摄入量和个体每天的水摄入量数据(按畜舍，然后按治疗组)。如果称重、施用/饮水或记录(或其他无法解释的饲料和水的损失)中发生错误，则使用在明显误差的任一侧的1-2天的相同的畜舍平均值来校正平均值。同样，阶段1的组平均体重是使用第0天的总体重/禽总数和第7、14、21、28、35和42天的个体体重计算得出的。计算消耗的总(个体)饲料/治疗，并使用以下表达式计算饲料转化率/治疗：总(个体)饲料/总(个体)体重增加。
使用下述线性模型和Tibco SPOTFIRE S+8.2(2010)，针对每个阶段内的治疗以及两个阶段的畜舍2和15/16之间，对个体每天的饲料摄入量和个体每天的水摄入量进行统计比较：
(参数)
模型中包括“天”以允许随时间的变化，“畜舍”作为每次治疗均由2个畜舍组成，而交互项“治疗：天”被包括在内以允许治疗x时间的效果。通过检查残差图来确认模型的适用性；在所有情况下，统计模型都是合适的。
阶段1：
表28阶段1汇总数据
饲料摄入量：“治疗”是显著的，“天”是高度显著的，“畜舍”是不显著的。但是，在治疗的个体成对比较中，未观察到显著差异(p<0.05)。
水摄入量：“治疗”是显著的，“天”是高度显著的。治疗的成对比较数量是显著的，但结果不是结论性的。似乎确实存在中等趋势，即接受较长时期试验治疗(在饮用水中未掩蔽的)的组比治疗较短时期的组和未治疗的对照组饮用更少的水(见图13)。
体重“治疗”是显著的，“天”是高度显著的，“畜舍”是不显著的。但是，在治疗的个体成对比较中，未观察到显著差异(p<0.05)。
在阶段1中，尽管治疗的禽倾向于饮用更少的水，但在不同时期内通过饮用水进行的未掩蔽的治疗似乎不影响饲料摄入量或体重。
阶段2：
表29阶段2汇总数据
饲料摄入量：“治疗”和“畜舍”不是显著的，而“天”是高度显著的。但是，对于两种治疗的成对比较，没有观察到显著差异(p<0.05)。
水摄入量：“治疗”是高度显著的，“天”是高度显著的。对于两种治疗的成对比较，观察到了显著差异，其中治疗的禽(接受在饲料中的治疗的禽)饮用更多水(参见图14)。
体重：“治疗”和“畜舍”并不显著(尽管如预期的“天”是显著的)，对于两种治疗的成对比较，未观察到显著差异(p<0.05)。
在第2阶段的治疗(在饲料中)中似乎没有影响饲料摄入量或体重，而治疗的禽倾向于饮用更多的水(与阶段1相反，其中当在饮水中应用未掩蔽的治疗时，禽倾向于饮用更少的水)。
阶段1+2(未治疗的组-畜舍2vs 15/16，在水中治疗第6-42天)：
饲料摄入量：虽然总体模型中的“治疗”不是显著的(“天”是高度显著的)，但对于两种治疗的成对比较，却存在显著差异(p<0.05)，其中未治疗的禽在整个试验中食用～0.14kg更多的饲料。
水摄入量：“治疗”是高度显著的，“天”是高度显著的。对于两种治疗的成对比较，观察到显著差异(p<0.05)，其中在整个实验中未治疗的禽比未治疗的禽饮用更多的水。
体重：虽然模型中“治疗”是显著的(和如预期的“天”是高度显著的)，但对于两种治疗的成对比较，没有观察到显著差异(p<0.05)。
当通过饲料转化率考虑显著较高饲料摄入量和相似(无显著不同)体重的组合时，相对于无治疗，历经6-42天的治疗似乎具有中等优势(见图15)。治疗的禽消耗了3.84kg饲料，增加了2.35kg(1.6kg饲料的FCR：增加1kg)，而未治疗的禽消耗了4.17kg的饲料，增重了2.14kg(1.95kg饲料的FCR：增重1kg)。
实施例3
为了评估三种剂量率的饲料中IVP小檗碱氯化物对抗商品肉用小鸡中的混合中度球虫病攻击的效果，并评估坏死性肠炎或非特异性肠炎的任何发生。该研究为肉用仔鸡小鸡的IVP最有可能的有效剂量率提供了一个范围界定项目，并评估了与行业标准相比在控制球虫病和随后的坏死性肠炎中可能取得的成功。
材料与方法
获得了球虫卵囊的场地样品(来自肉用仔鸡和蛋鸡来源的艾美球虫属的种)，将其运到实验室，在所述实验室中使其进行过滤，孢子形成，消毒和储存。然后通过PCR鉴定存在的艾美球虫属的种并计数卵囊。这些通过首次用于实验的小鸡进行繁殖，以产生足以满足播种者禽的攻击接种的数量。从商业孵化场获得30只1日龄的肉用小鸡，将它们放在试验设施的养鸡房孵化室笼中，每笼10只小鸡。给它们施用不含药配给量，在第7天，通过管饲法施用孢子形成的卵囊。在第13天，对家禽实施安乐死并移出它们的肠道。分离上部和下部小肠和盲肠，将其放入2％重铬酸钾中，于4℃放置3-5天，然后刮擦以去除粘膜。将其通过粗筛进入新鲜的重铬酸钾溶液中。在其中使卵囊形成孢子，在显微镜下进行检查并计数，并通过PCR鉴定物种。
从商业孵化场中获得一千一百八十(1180)只1日龄的Ross 308小鸡，所述小鸡在孵化场接种了针对传染性支气管炎和新城疫的疫苗。将这些小鸡运到试验设施并随机分入30个地面畜舍，每个畜舍放置36只小鸡(图18)。通过分隔器将畜舍减小到正常尺寸的一半，每个畜舍提供3.5m2的地面空间，目的是提供大约30kg/m2的最终禽密度。另外两个全尺寸的畜舍每个畜舍放置了50只禽(这些用作球虫病攻击的播种者)。
饲料基于合适的平衡基础配给量制剂(育雏期、育成期和育肥期)。将产品按如下方式添加到每种基础配给量中(表30)。
表30治疗组/饲料
以随机的完全区组为基础将饲料分配给畜舍。如下为每个畜舍提供饲料：0.7kg每禽育雏期饲料(约第0-14天)，1.2kg每禽育成期饲料(约第15-28天)和之后的育肥期饲料直至终止(第42天)。播种者禽畜舍获得了1号配给量(不含药)。
在第6天，使用步进式移液管通过单独管饲法为播种者畜舍中的禽提供卵囊接种(每只禽约0.5mL)。使用了三个来自不同养鸡场的孢子形成的卵囊样品，将其给予每个播种者畜舍中的禽的约三分之一。在第12天，第13天和第14天使播种者畜舍中的垫料轻微倾斜。在第14天，收集播种者畜舍中垫料的顶部2-3cm，并充分混合在一起并称重(图19)。垫料的总重量除以30，然后将该量的垫料分配到每个试验畜舍中(每个畜舍接受400gm混合播种的(seeded)垫料，图20)。
将收集混合垫料的四个子样品，卵囊计数如下进行：通过将7gm垫料悬浮在75mL饱和蔗糖中并在100倍放大倍数下的Whitlock Universal计数室中计数可见的卵囊总数。
在第0、14、21、28和42天以畜舍为基础称重禽。在第14、21、28和42天测量饲料消耗。计算每个时间段的饲料转化率(FCR)并针对禽损失和移出进行校正。
记录任何死亡或被淘汰的禽并在尸检时称重并检查。特别注意肠道中与球虫病或肠炎一致的病变。记录性别。
在第21天，从每个试验畜舍中随机选出四只禽，对其进行人道安乐死，并对其肠和盲肠在四个肠段(上，中，下部肠和盲肠)的球虫病病变进行评分，并记录典型的艾美球虫属的种的病变。在这一点也通过视觉评估了总体肠道质量(寻找肠炎)。
在第21天，每个畜舍收集四个单独的粪便样品并将其合并，并评估其卵囊计数。
在第42天，对所有存活的禽实施安乐死，并通过收集受污染的废物处置其尸体(不屠宰以供人类食用)。
结果
表31显示了由伯灵禽实验室(Birling Avian laboratories)通过PCR确定的给予播种者禽的接种物中的艾美球虫属(Eimeria)物种的特征。该PCR仅是定性的，但可以估计每种物种的相对丰度(如果丰度更大，显示为“+”符号的数目增加)。
表31在播种者禽的攻击接种物中检测到的艾美球虫属物种
+，++指示存在的相对量；ND＝未检测到。
表32概述了接种后7天从播种者畜舍中提取的每克混合垫料样品(一式四份计数的样品)中的卵囊计数，卵囊的大小可以明确评估，但种类无法准确确定。孢子形成可以用这种技术判断。
表32用作对每个畜舍的攻击的来自播种者禽的混合垫料样品上的卵囊计数
1大卵囊，典型为巨型艾美球虫或布氏艾美球虫
2中等的卵囊，典型为柔嫩艾美球虫、毒害艾美球虫或早熟艾美球虫
3小卵囊，典型为堆型艾美球虫(E.acervulina)或和缓艾美球虫
根据表32中所示的卵囊计数，第14天，每个畜舍接受在分布的播种的垫料中大约630万个卵囊。
在计数攻击播种的垫料时观察到了几种艾美球虫属典型大小的卵囊(表32中估计的百分比)。然而，似乎只有小的卵囊有孢子形成，而其他大小的卵囊中在垫料铺开的时间很少有孢子形成的迹象。
表33显示了每个称重时间的平均体重，表34显示了每个时期的平均体重增加。图21显示了通过治疗的每日平均体重增加。
表33各年龄段的平均活体重(gm)
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
表34按时期增加的体重
平均值体重增加(gm)在每个时期(天)
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
14天的体重显示出采用治疗的明显的差异，接受0.3g/kg IRP的禽的体重显著低于阴性对照，且两种IRP的剂量率均低。两种含沙利霉素的饲料在14天都处于中间水平。在第7天时，这个趋势变得明显，但是这一年龄段并不显著，这也反映在这些时期的体重增加上。到21天时，0.3g/kg IVP治疗组的禽平均体重显著低于任何其他治疗。为0.03g/kg的IVP在第21天具有最高平均体重，并且显著高于沙利霉素+杆菌肽组和0.3g/kg IRP组。接受IVP0.3g/kg的禽直到实验结束时保持比所有其他组的显著更轻，尽管两组之间在第21天后的增加率没有差异。与治疗组相比，阴性对照所经历的球虫病攻击并未显著降低生长率。
从14天开始，IVP 0.3g/kg组的体重比对照组和较低IVP剂量组显著更轻。该组(饲料#2)在试验中消耗的饲料比任何其他组都要少，并且比用IVP治疗的其他两组少得更多(表35)。该组的饲料颜色为嫩黄色(图22)，到42天时，这些禽的粪便中可见未消化的饲料颗粒(图23)。IVP 0.3g/kg剂量的更慢的生长速度可见于图21。禽总是显得健康。
在攻击的一周(15-21天)中，球虫病攻击并未降低阴性对照组的生长速度。
在整个实验过程中，较低IVP剂量组和沙利霉素和沙利霉素+杆菌肽组的生长速度与对照组在统计学上相似。
表35显示了每只禽的饲料摄入量，表36显示了针对禽类损失校正的饲料转化率(FCR＝饲料：体重增加比)。
0-14天和0-21天内接受IVP 0.3g/kg的禽的饲料摄入量以及0-21天内两种含沙利霉素的饲料的饲料摄入量具有比对照组显著更低的饲料摄入量。0.1g/kg和0.03g/kg的IVP的饲料摄入量与对照组相似。之后没有观察到显著的饲料摄入量差异。
表35每只禽的饲料摄入量
FCR(针对禽损失和移出进行校正)仅在整个实验期(第0-42天)后显示出显著变化。两种含有沙利霉素的饲料(#5和#6)的FCR均显著优于对照，而也含有杆菌肽(#6)的饲料的FCR均显著优于IVP 0.1g/kg组(#3)。在各组之间确定的性别比例上的微小差异对禽的表现没有显著影响(未显示)。
表36针对死亡率校正的FCR
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
表37显示了第21天(暴露于受污染的垫料后7天)的球虫病病变得分的结果。
表37球虫病病变得分
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
球虫病的病变主要是堆型艾美球虫(E.acervulina)的典型病变。攻击垫料的PCR显示了巨型艾美球虫，柔嫩艾美球虫和和缓艾美球虫的存在。这与攻击前的卵囊数据一致，这是因为在攻击前对卵囊进行计数时，只有较小的卵囊(堆型艾美球虫(E.acervulina)和和缓艾美球虫)看来具有良好水平的孢子形成。
阴性对照和最低IVP水平显示十二指肠，空肠和总肠的病变得分最高。病变的位置及其外观是堆型艾美球虫(E.acervulina)的典型特征(见图24至图26)。在十二指肠中，仅沙利霉素加杆菌肽与对照组以及IVP的两种较低剂量率相比，显著减少了病变。空肠病变通常较低，但有一些显著差异。总体而言，最高水平的含IRP和沙利霉素的饲料(#5和#6)显著降低了总肠病变得分。
评估来自每个畜舍的合并的粪便样品的卵囊含量。表38显示了结果。结果显示出一定的一致性，但是一个畜舍(0.1g IVP/kg组)的粪便样品中的卵囊计数极高(检查两次)。这个个体畜舍也显示了很高的球虫病病变得分，这使该治疗组的结果出现偏离。观察到的原始卵囊计数不均匀(通过显著的Levene检验)，因此将计数转换为以10为底的对数，以克服此问题以进行ANOVA分析。转换后的log10结果也显示在表38中。对于IVP治疗的饲料组(#2，#3和#4)，粪便的卵囊计数在数字上有所降低，与阴性对照组相比，只有含有沙利霉素的饲料(#5和#6)显著减少了粪便中的卵囊计数。
表38粪便卵囊计数
A,B–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
表39显示了肠病变得分，其基于Tierlynck等，Avian Pathology,2011，40：139-144(Tierlynck等，2011)。这是一个得分系统，旨在量化一组禽中存在的菌群失调水平，将某些明显可见的异常归因于得分。较高的总分(最高10)反映了较高水平的菌群失调，尽管如果存在球虫病，则可能会受到影响。就我们的目的而言，肠得分仅反映总体肠病理学。图27至图29显示了一些观察到的肠异常的例子。
在此实验中，第21天的平均肠完整性得分低于第28天。在第21天，增加肠得分的肠区域是上部肠中的体腔膨胀(ballooning)，充血，半透明和异常含量以及直肠中未消化的饲料颗粒的存在。在第28天时，得分较高的区域是上部肠中的体腔膨胀(ballooning)，充血，半透明和紧张。
在21天或28天时，所有治疗的总肠健康得分均无显著差异，但是在21天时，与对照组和最低水平IVP(0.03g/kg)相比，较高的两个水平IVP(0.3和0.1g/kg)以及两种含沙利霉素的饲料均降低了上部肠的半透明得分和直肠中未消化的饲料颗粒的存在。在28天时，为0.3g/kg的IVP产生的总肠健康得分与对照组相比接近显著(P＝0.06)。
表40表现与观察值之间的显著相关性(皮尔逊相关系数)。
校正后的第42天饲料转化率与第21天的总球虫病病变得分呈显著强正相关(r＝0.70)(即较高的病变得分与较高的FCR相关，这些病变的变异占FCR变异的83％)。这种关系在图30中以图形方式显示。在第21天，球虫病病变得分与粪便中的卵囊数目呈中等程度正相关(一种变异占另一种变异的62％)。第21天的肠体腔膨胀与第21天的粪便卵囊计数和第42天的FCR中等程度相关。第21天直肠中未消化的饲料颗粒较高水平的存在与较高球虫病变得分和第42天较差(较高)FCR相关。第28天总肠道完整性得分也与第21天球虫病变得分和第42天FCR呈中等程度正相关。
讨论和结论
尽管所施加的球虫攻击含有几种艾美球虫属，但在攻击时只有堆型艾美球虫(E.acervulina)类型显示出良好的孢子形成。通常认为所有物种的孢子形成条件都是相同的，因此这种观察是不寻常的，其原因未知。该观察结果肯定是准确的，因为在第21天的检查中仅观察到了堆型艾美球虫类型病变。堆型艾美球虫是一种低级致病性物种，不太可能导致死亡，并且对生长速度的影响较小。但是，它可能会引起腹泻并影响饲料转化效率。
所施加的攻击在阴性对照组中产生了中度球虫病病变，所述病变通过含沙利霉素的饲料和含0.30g/kg IVP的饲料被显著减轻；但不通过较低的剂量率减轻。在第21天，只有含沙利霉素的饲料能显著降低粪便中的卵囊水平，而接受IVP水平的所有组均在数值上低于对照。因此，IVP似乎对堆型艾美球虫有一定作用。
接受含0.30g/kg IVP饲料的小鸡的早期生长速度显著低于所有其他组(长达21天)，尽管它们的生长速度随后有所改善，但它们仍是实验中最轻的禽。这与到第21天时每只禽较低的饲料摄入量有关。具有较高IVP水平的饲料颜色为嫩黄色，而食用它的禽则表现出湿润的淡黄色***物。这种较低的饲料摄入量是否是由于适口性造成的，尚不能确切确定，需要进一步评估，松散的***物占优势可能表明在这种引入率下，某种性质的不利影响。
在整个试验中(0-42天)校正后的饲料转化率被所有治疗轻微降低，但与阴性对照相比，仅含沙利霉素的饲料显著降低了前述饲料转化率。FCR与21天的球虫病变得分密切相关，而与粪便卵囊数量和某些肠完整性得分中等程度相关(体腔膨胀，第21天的直肠中未消化的饲料颗粒和第28天的总肠得分)。第42天FCR变异的83％可以用第21天球虫病变得分的变异进行统计学解释。肠体腔膨胀是与球虫病相关的频繁描述的症状。由于第28天的肠得分也与在第21天球虫病变得分有中等程度的相关性，因此我们可以假设在病变消退后肠道中继续存在球虫感染效果(在第28天未观察到球虫病变)。肠道得分系统旨在量化肉用仔鸡小鸡中称为菌群失调的状况的存在和水平，据认为这种状况是由球虫感染引起的。与第21天相比，第28天的肠完整性得分更高(即更严重)，这表明存在一定水平的菌群失调。与阴性对照相比，处理的饲料降低了肠得分，其达到了统计学上的显著水平(P＝0.06)。在这方面，IVP提供了与沙利霉素和沙利霉素加杆菌肽锌相似的改进。这将是合理的证据，其表明IVP可能具有针对菌群失调的某些保护作用。
弯曲杆菌病
弯曲杆菌病是由称为弯曲杆菌(CB)的细菌引起的胃肠疾病。在澳大利亚，CB是细菌性肠胃炎的最常见原因之一，经常与食用受污染的家禽有关。一年中的任何时候都可能发生感染，但在较温暖的月份更常见。在2011年，弯曲杆菌是美国食物传播疾病的第四大诱因。
大多数感染了CB的人会出现腹泻，绞痛，腹痛和发烧，其持续一到两周。通常在感染后2至5天内出现症状。腹泻可能含有血液或粘液。在极少数情况下，CB会进入血流并引起更严重的疾病。
通过食用或饮用受污染的食物(主要是家禽)、水或未经巴氏消毒的牛奶，CB主要传播给人类。CB还可以通过与感染者接触或与携带细菌的猫，狗和家畜接触而传播(图3显示了流行病学)。
任何人都可以患弯曲杆菌病，尽管很小的儿童、老人、免疫力低下的人和与家畜打交道的人感染的风险更大。
大多数人会通过休息和补充水分而从弯曲杆菌病中康复。恢复通常需要一个星期，但可能需要长达两个星期。治疗通常涉及从您的药剂师那里获得的补液溶液，以帮助解决腹泻引起的脱水。在严重或复杂的情况下，可开处方使用诸如红霉素之类的抗生素来减少疾病的持续时间。
家禽尸体/肉的CB污染持续发生。通过清洗和除脏术，控制CB污染的方法已集中在加工厂。但是，据认为，如果在宰杀之前可以控制禽类肠道中CB定殖，那么将减少经加工禽类的污染。
实施例4公开了某些天然化合物对弯曲杆菌的抗微生物活性。
实施例4
实验室工作
鉴定出天然化合物可潜在地用于预防和治疗弯曲杆菌引起的疾病。体外测试了最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
1.小檗碱氯化物
2.小檗碱硫酸盐
3.槟榔碱
4.白头翁素
5.苦参碱
6.氧化苦参碱
7.穿心莲内酯
8.非洲防己碱
9.黄芩苷
材料和方法
此项目采用了临床和实验室标准协会(CLSI)指南。选择十个代表性菌株。每种化合物的测试浓度为：1000、500、250、125、62.5μg/ml。使用的阳性对照是四环素。
表41测试弯曲杆菌菌株的MIC和MBC
结果
表42弯曲杆菌体外结果
测试
结果＊
MIC
两种化合物展示的MIC为62.5μg/ml。
MBC
相同的两种化合物展示的MBC为62.5μg/ml。
＊四环素结果与MIC和MBC的参考标准一致。
猪的疾病
大肠杆菌-泻病(腹泻)
在吮吸仔猪(sucking piglet)的所有疾病中，腹泻是最常见的，可能也是最重要的。在某些暴发中，它是导致高发病率和高死亡率的原因。在运行良好的群中，在任何时候应有少于3％的一窝仔畜需要治疗，腹泻造成的仔猪死亡率应低于0.5％。但是，在严重的暴发中，死亡率水平可能会上升到7％或更高，在个别未治疗的一窝仔畜中，死亡率水平可能上升到至多100％。主要的细菌原因是大肠杆菌。在吮吸期间的任何年龄均可发生仔猪的泻病，但通常在5天之前以及7至14天之间有两个高峰期。
对于急性疾病，唯一的迹象可能是发现一头完全良好的猪死亡。尸体剖检显示出严重的急性肠炎，以至于突然间可能没有外表的泻病迹象。临床上受影响的仔猪挤在一起发抖或躺在角落。直肠和尾巴周围的皮肤是湿的。环顾畜舍周围，可能会出现水样至色拉奶油稠度泻病的迹象。在许多情况下，有独特的气味。随着腹泻的进行，仔猪脱水，眼睛凹陷，皮肤变得象皮革厚。所述泻病通常会粘在其他仔猪的皮肤上，使它们呈橙色到白色。在死亡之前，可能会发现仔猪在侧面划水和嘴起泡沫。
在亚急性疾病中，症状相似，但对仔猪的影响不那么严重，延长的时间更长，死亡率往往更低。通常在7至14日龄之间看到这种泻病，表现为水样至稀薄的色拉奶油稠度腹泻，颜色通常为白色至黄色。
据估计，仔猪泻病每年给澳大利亚养猪业造成的损失超过700万澳元。泻病的发生率和类型，卫生成本和恢复率决定了个体猪损失的程度。止泻药，如膨润土或高岭土，用于保护肠壁。经常在饮用中添加电解质。抗生素用于减少肠细菌群体的数量，尽管因为抗性的发展需要避免药物滥用。当前的抗生素药物列于下表43。
表43用于治疗仔猪腹泻的抗生素
＊在某些国家禁止
实施例5公开了某些天然化合物对猪疾病的抗微生物活性。
实施例5
实验室工作
已鉴定出天然化合物可潜在地用于预防和治疗猪的传染性肠疾病，包括大肠杆菌诱发的泻病。体外测试最小抑菌浓度(MIC)。测试的化合物是。
1.小檗碱氯化物
2.小檗碱硫酸盐
3.槟榔碱
4.白头翁素
5.苦参碱
6.氧化苦参碱
7.穿心莲内酯
8.非洲防己碱
9.黄芩苷
材料和方法
此项目采用了临床和实验室标准协会(CLSI)指南，以遵循从以下调整的方法来评估MIC：Wiegland等人“Agar and broth dilution methods to determine the minimalinhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances”Nature Protocols2008；3(2):163-175。选择代表性菌株。每种化合物的测试浓度为：1000、500、250、125、62.5μg/ml。使用的阳性对照是四环素。
表44针对MIC检测的猪病菌株
结果
小檗碱和非洲防己碱对所有5株引起泻病的大肠杆菌的MIC均为125μg/ml。四环素结果与针对MIC获得的标准结果一致。
艰难梭菌
艰难梭菌(CD)是一种细菌，可引起从腹泻到威胁生命的结肠炎症的状况。CD引起的疾病最常影响老年人或长期护理机构，并且通常在使用抗生素药物疗法后发生。但是，研究表明，在传统上不被认为具有高风险的人群中，例如没有抗生素使用史或未曾接触过卫生保健设施的年轻且健康的个体中，CD感染率正在上升。在美国，每年约有50万人患有CD疾病，并且近年来，随着抗微生物药抗性的上升，CD感染变得更加频繁，严重且难以治疗。
有些人虽然在肠中携带艰难梭菌，但从未生病，尽管他们仍可能传播感染。体征和症状通常在开始服用抗生素后五到十天内会出现，但可能会在第一天或最多两个月后出现。轻度至中度CD感染最常见的症状是腹泻和轻度腹部绞痛。在严重的情况下，人们倾向于脱水，可能需要住院治疗。结肠发炎(结肠炎)，有时可能会形成原始组织的小块，这些小块可能会流血或产生脓液。
最常导致CD感染的抗生素包括氟喹诺酮类，头孢菌素，青霉素和克林霉素。具有讽刺意味的是，CD的标准治疗方法是另一种抗生素。对于轻度至中度感染，尽管未获得FDA批准，但仍经常开据处方使用口服的甲硝唑。对于更严重的情况，开据处方使用口服万古霉素。非达米星是另一种批准的治疗CD的选择，但费用更高。高达20％的CD患者再次生病。复发两次或更多次后，进一步的复发率提高到65％。CD复发的治疗通常涉及万古霉素。可考虑粪便菌群移植或粪便移植，但其尚未获得FDA批准。
因此，本公开内容涉及一种预防或治疗由人类梭菌属细菌引起的传染病的方法，所述方法包括施用小檗碱生物碱。
本公开内容还预期本文公开的小檗碱生物碱或动物饲料可以抑制孢子形成。抗生素治疗后孢子的过度生长被认为是人类的一个问题。因此，本公开内容涉及通过施用本文公开的小檗碱生物碱或动物饲料来预防抗生素治疗后的艰难梭菌孢子过度生长。
实施例6公开了某些天然化合物对梭菌的抗微生物活性。
实施例6
实验室工作
鉴定出天然化合物可潜在地用于预防和治疗艰难梭菌。体外测试了最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。产气荚膜梭菌也进行了测试。测试的天然化合物为：
1.小檗碱氯化物
2.小檗碱硫酸盐
3.槟榔碱
4.白头翁素
5.苦参碱
6.氧化苦参碱
7.穿心莲内酯
8.非洲防己碱
9.黄芩苷
材料与方法
此项目采用了临床和实验室标准协会(CLSI)指南。采用了指南以遵循从以下调整的评估MIC的方法：Wiegland等人“Agar and broth dilution methods to determine theminimal inhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances”NatureProtocols2008；3(2):163-175，和从以下调整的评估MBC的方法：Chen“Novel therapeuticapproaches targeting Clostridium difficile”,in:Biology Dissertations,Boston(Mass.):Northeastern University,2014。选择了代表性菌株。每种化合物的测试浓度为：1000、500、250、125、62.5μg/ml。使用的阳性对照是万古霉素。
结果
表45梭菌体外结果
＊万古霉素的结果与MIC和MBC的标准一致。
实验数据
使用小檗碱硫酸盐作为测试剂和万古霉素作为已建立的对照，对产气荚膜梭菌坏死性肠炎菌株和艰难梭菌临床分离菌株进行了最低抑菌浓度(MIC)测定。得到来自SichuanBioFarm Inc的天然提取物，纯度为98.0％的小檗碱硫酸盐。小檗碱对产气荚膜梭菌的MIC为125μg/ml，但是在62.5μg/ml的浓度下仍可看到部分抑制生长的作用，表示真实MIC在这两个值之间。
小檗碱对产气荚膜梭菌的最小杀菌浓度(MBC)等于MIC(125ug/ml)，在该浓度下观察到100％的活细胞被杀死。发现小檗碱对艰难梭菌的MIC为500-1000ug/ml(重复之间的差异)。小檗碱对艰难梭菌的MBC为1000ug/ml。小檗碱对艰难梭菌的MIC和MBC值等于或小于先前研究值的2倍稀释度。万古霉素MIC在产气荚膜梭菌和艰难梭菌两者的预期范围内。
实施例7
这项研究旨在确定通过饲料经口服方式向商品肉用仔鸡小鸡施用时，天然存在的植物化合物IRP001氯化物(小檗碱氯化物)的组织残留。
总结
肉用仔鸡小鸡接受混入饲料中的0.3g/kg或0.03g/kg IRP001氯化物，或接受不含添加剂的常规饲料(即对照组)。将禽圈入畜舍(每组10只)后立即开始治疗，并继续治疗35天。在第35天对禽进行安乐死以收集组织，或者在第35天后以常规饲料喂食最多7天，以检查清除期后的残留物。另外两个组接受IRP001氯化物添加饲料28天，IRP001氯化物以0.3g/kg或0.03g/kg添加入它们的饲料(即1kg饲料中0.3g IRP001氯化物或1kg饲料中0.03gIRP001氯化物)和随后在安乐死和组织收集之前，以常规食物施用14天的清除期。
从每只禽(在每种情况下从胸脯，大腿和小腿)采集的三种肌肉组织的1g样品中提取IRP001氯化物。使用LC-MS/MS测定IRP001氯化物的残留质量。所述方法允许以2ngIRP001/g组织的下限检测IRP001。在每次测定过程中均对该测定进行了充分验证，并且该测定被证明在5ng/g组织的定量准确度优于±20％。发现低于2ng IRP001/g的水平在测定的基线噪音范围内，并且低于检测下限(LLOD)，即无法检测到IRP001。
在一个实施方案中，对所述方法进行了优化，使得可以确定地以2ng/g组织检测到IRP001氯化物。在每次测定运行过程中均对该测定进行了充分验证，并且该测定被证明在4ng/g或5ng/g组织的定量精密度优于+20％。发现1ng/g组织或更低的水平在测定的基线噪音范围内，并且低于定量下限(LLOQ)。
在高IRP001氯化物浓度下施用35天后，小檗碱的残留是可检测和可量化的。施用35天后无清除的高饲料添加剂浓度下的平均残留水平(n＝3)为每克乳腺，小腿和大腿组织分别为6.1ng，5.5ng和11.6ng。在所有三块肌肉组织中饲料添加剂浓度高时，具有明显的清除效果，在清除4天后达到约1ng/g的水平，低于LLOQ。在所有情况下(无论是否清除)，在低浓度的饲料添加剂的情况下，平均残留水平均低于1ng/g，低于LLOQ。
即使在以0.3g IRP001氯化物/kg饲料喂食35天后不经过清除期的情况下进行测量，该研究中确定的所有残留物含量均低于标称的安全残留水平13ng/g。
高饲料添加剂浓度后，肝脏中的残留水平在未清除的情况下高于13ng/g，但在清除一天后低于13ng/g。鉴于小鸡肝的平均消耗量有限，因此肝脏中IRP001的水平并不令人担忧。
总体上看，数据表明，在饲料添加剂水平等于或低于0.3g小檗碱/kg饲料的情况下，由食用IRP001氯化物施用的小鸡的鸡肉致癌的风险小于百万分之一。
以0.03IRP001/kg饲料给药后，或以0.3g IRP001/kg饲料给药后清除4天后，小鸡肌肉(即鸡肉)中的小檗碱水平低于LLOD。
介绍
小檗碱生物碱(包括小檗碱)是安全的。小檗碱多年来一直被人类用作膳食补充剂，可从多家制造商处以胶囊形式获得。它被销售以每天使用一次或两次，使用的剂量高达400mg小檗碱氯化物/胶囊。此外，在导致本发明的实验中，在42天内用在1kg的市售饲料中1g小檗碱剂量的小檗碱治疗的肉用仔鸡未观察到不良反应或未预料到的事件(参见实施例8)。
如在其他地方所述，在美国，食物药物监督管理局(FDA)负责批准受联邦食物、药品和化妆品法(FD&C Act)管制的人和动物药以及饲料添加剂。
FD&C法要求证明欲用于食物生产动物的化合物是安全的，和证明暴露于这些化合物的动物生产的食物对于人食用是安全的。尤其是，法规(21CFR第500部分，E亚部分-食物生产动物中使用的致癌化合物的规定)禁止在食物生产动物中使用发现在被人或动物摄入时诱发癌症的任何化合物，除非符合某些条件(所谓的“己烯雌酚(DES)限制性条款”)。根据DES限制性条款，如果可以通过规定的检查方法确定在实践中将被遵循的合理确定的使用条件下，由食物生产动物生产的食物中不会发现化合物“残留”，则不禁止使用可疑的致癌化合物。
因此，如果FDA决定将小檗碱作为致癌化合物进行管理，除非适用“无残留”DES限制性条款，否则美国法规禁止在食物生产动物中使用小檗碱。
术语“无残留”是指可食用组织中剩余的任何残留含量如此之低，以至于对消费者而言，其表现出不显著致癌风险。更具体地说，将不显著致癌风险定义为风险增加一百万分之一。
尽管小檗碱具有记录的安全性，但美国政府(国家毒理学研究中心)委托进行了毒理学研究，该研究在高剂量慢性啮齿类动物研究中发现了潜在的致癌性。
因此，要获得GRAS状态，有必要估算可接受的鸡肉中小檗碱的最大残留水平(考虑到鸡肉的典型终生食用)。为了确保食用鸡肉引起的癌症风险低于百万分之一，据估计最大可接受残留水平为每克鸡肉(即胸脯或腿部(leg)肌肉组织)13ng小檗碱。
为了研究所公开的饲料添加剂是否安全并且适合于指定剂量的GRAS状态，进行了适当的残留试验。与Invetus Pty Ltd签订合同以进行试验，收集组织，与MonashUniversity签订合同以分析组织样品中的小檗碱。
残留研究设计
使用肉用仔鸡小鸡的这项研究的规程作为附录B的附件附于实施例。研究了两种浓度的IRP0001氯化物：0.3g/kg饲料和0.03g/kg饲料，分别代表饲料添加剂的高低浓度。
一百八十只禽被分入18个畜舍，每个畜舍含十只禽。为了代表肉用仔鸡小鸡的典型饲养过程，试验禽以高浓度或低浓度接受了含添加剂的饲料35天。35天后，对每种添加剂浓度的一组进行安乐死以收集组织(每个畜舍中有6只最大的禽)。
为了研究在将含IRP001氯化物的饲料替换为常规饲料后是否明显消除(代谢和***)IRP001氯化物，其他组接受IRP001氯化物35天，然后在安乐死和组织收集前1、2、4或7天接受常规饲料。另外两个组接受IRP001氯化物28天，然后接受常规饲料14天(即清除14天)。平行对照组以完全相同的治疗方式治疗，除了在整个研究过程中对照禽接受常规饲料。在所有情况下，均从肌肉组织的三个区域(胸脯，大腿上部和下部)取样。收集样品，冷冻并运输以进行分析。表46总结了研究设计，该研究设计显示了残留研究中18组禽中每组所用的IRP001浓度和喂食方案。
表46每组肉用仔鸡的喂食方案总结
NB-对照组接受无添加剂的常规饲料
LC-MS/MS分析的性能
附录A中概述了用于组织提取和LC-MS/MS的测定方法的详细信息。最初根据简单的溶液中校准了小檗碱的测定方法，随后对组织提取后的测定方法进行了验证。
组织样品小檗碱峰可以在低至2ng/g组织的浓度被检测到，由于组织基质效应和1ng/g组织中的分析物残留(carryover)而产生的干扰，使得在此浓度或更低浓度下难以定量IRP001。在5ng/g(或在某些情况下为4ng/g)下，该测定在±20％真实分析物浓度时可以被验证为准确的。在结果部分，高于5ng/g的IRP001水平被引用作为绝对值，2和5ng/g之间的IRP001水平被认为低于LLOQ，和指示值低于2ng/g的输出被认为在基线噪声之内，低于LLOD，因此是无法检测到的。
在一个实施方案中，来自组织样品的小檗碱峰可以在低至1ng/g组织的浓度被检测到，由于组织基质效应和1ng/g组织中的分析物携带(carryover)而产生的干扰，使得在此浓度或更低浓度下难以定量IRP001。在5ng/g(或在某些情况下为4ng/g)下，该测定在±20％真实分析物浓度时可以被验证为准确的。实际上，小于2ng/g的浓度可以认为低于定量下限(LLOQ)。峰检测的下限为1-2ng/g。
结果
来自每个饲料添加剂组3只禽组织样品通过Monash分析团队接收并通过LC-MS/MS进行分析。测定来自每个对照组的单个样品。
表47显示了针对每组3只禽切除的每个肌肉组织测定的小檗碱的平均浓度和标准偏差。测定了每个对照组的一个代表，发现这些值实际上为零，在结果表中表示为低于LLOD“<LLOD”，即不可检测。
概括地说，胸脯组织样品，大腿和小腿肌肉样品具有可比性，尽管确定的浓度很低，但数据仍显示出明显且合乎逻辑的趋势。在0.03g/kg饲料的低饲料添加剂浓度下，无论是否有清除，在所有情况下均无法检测到小檗碱的平均残留水平(即低于LLOD和LLOQ)。
在较高的IRP001浓度为0.3g/kg饲料时，35天后的平均小檗碱残留在可量化的范围内。胸脯为6.1±1.6，小腿为5.5±3.0ng/g，和大腿组织为11.6±6.6ng/g。在这两个组织中，逐渐清除是明显的。小檗碱残留在1天和2天后下降，而4天后小檗碱水平低于LLOD。
表47肌肉组织中IRP001氯化物的残留
NB
<LLOD＝低于检测下限(即不可检测)
＊星号表示估计值<LLOQ(低于验证的定量下限)
表48显示了从每组3只禽切除的肝脏组织测定的小檗碱的平均浓度和标准偏差。测定了每个对照组的一个代表，发现这些值实际上为零，在结果表中表示为低于LLOD“<LLOD”，即不可检测。
表48肌肉组织中IRP001氯化物的残留
NB
<LLOD＝低于检测下限(即不可检测)
＊星号表示估计值<LLOQ(低于验证的定量下限)
结论
在该研究中确定的肌肉组织(鸡肉)中的所有残留水平均低于标称的安全残留水平13ng/g，即使以0.3g小檗碱/kg饲料喂食35天后在没有清除期的情况下测定也是如此。在所有情况下，在0.03g/kg饲料的较低IRP001浓度残留水平被确定为小于2ng/g组织，并且可以被认为是不可检测的。
给禽喂食0.3g IRP001/kg饲料后，肝脏中的残留水平高于定量限，经过7天的清除期降低，并在14天清除后降至低于定量限。给禽喂食0.03g IRP001/kg饲料后，肝脏中的残留水平低于清除前后的检测极限。
附录A
分析方法
以四氢棕榈精(palmitine)为内标，通过LC-MS/MS测定了小檗碱。
组织样品的制备
1.切出约1g组织并称重到M管中。将组织储存在-20℃的冰箱中，直到准备好均质化为止。
2.对于每克组织，将2体积的MilliQ水添加到管中。
3.将M管连接到GentleMACS匀浆器上，并运行程序方法RNA_01_01(60秒)3次，以确保组织完全匀浆。
4.将组织匀浆以200μL等分试样分配到Eppendorf管中。
5.向组织匀浆的每200μL等分试样中加入10μL内标溶液，然后加入600μL 100％甲醇。将样品在最大设置下涡旋3x 10秒，然后以10,000rpm离心3分钟。
6.将100μL上清液转移至LC小瓶中以进行分析。
方法验证
1.验证了所述方法的选择性，线性，LLOQ，准确度，精密度，回收率，稳定性和基质效应。
2.通过制备掺有高达500ng/g浓度的单个分析物的样品进行选择性评估，每个样品重复5次。将峰值信号与校准标准品(掺有分析物)进行比较，以确保没有干扰。
3.为了评估LLOQ，以6次重复制备了5ng/g和10ng/g的标准。LLOQ是在校准曲线的最低浓度下测定的，其精密度和准确度均≤20％。
4.为了表明准确度和精密度，制备了4种浓度水平，分别为20、50、100和500ng/g(每个重复5次)。准确度表示为与标称浓度的偏差(％)，精密度表示为重复的相对标准偏差(RSD)。
5.为了评估回收率，通过以下制备基质回收样品：提取空白组织，然后掺入分析物溶液，得到多种浓度水平，至多500ng/g(每个重复5次)。通过提取样品的平均峰面积与基质回收样品的平均峰面积之比定义回收率。
6.为评估台式稳定性，制备了20、50、100和500ng/g的4个浓度水平，每个浓度水平重复5次，在提取前将其在室温下放置30分钟。将平均峰面积与新制备的标准品的平均峰面积进行比较。
7.为了评估基质效应(ME)，在净溶液中制备了20、50、100和500ng/g的4个浓度水平，每个浓度水平重复5次。ME定义为回收样品的平均峰面积与净标准品样品的平均峰面积之比。
表49 LCMS测定条件
附录B
合规
根据利用SOP和良好科学实践的经同意的方案进行了组织残留耗竭研究。
研究设计
a.实验单位：实验单位和观察单位均为个体动物。统计单位是治疗组。
b.动物模型：饲料摄入量，每天的水摄入量，体重变化，死亡率和组织中标志物残留用作结果参数。
c.纳入标准：如果动物符合以下概述的标准，则选择它们。
d.排除和移出标准：调查者认为收到后虚弱、患有疾病、受伤或因其他原因不适合纳入研究的动物将被排除在外。
选择后，只有得到发起人或调查者的书面同意，才将可能被认为不适合继续进行研究的动物移出。任何移出的原因将在原始数据和研究报告中得到充分记录和证明。被从研究中移出的动物将得到适当的兽医护理。
e.分配：肉用仔鸡小鸡：在收到后，将符合纳入标准的一百八十(180)只肉用仔鸡小鸡在从运输容器中被取出后、依次分配到十八(18)个单独的治疗组中，每组十(10)只禽。分配和随机化的方法将在原始数据和研究报告中进行描述。
f.盲化：不适用。
调查研究的兽医产品(IVP)
记录所有制剂细节，包括批号，有效期，收到和使用。
a.调查研究的兽医产品：IRP001 Cl作为100％IRP001 Cl。
b.来源：IVP将由发起人提供。
c.储存：IVP应在环境温度下在指定温度区域内储存。记录IVP的储存位置和条件。
d.安全性：发起人提供了SDS或其同等物(如果有)。
e.分析：为IVP提供了分析证书(如果有)。
f.药物处置：记录所有剩余IVP的处置。
治疗
a.剂量计算：剂量基于饲料中IRP001 Cl的固定浓度(0.03或0.1g/kg IRP001Cl)。
b.剂量制备：将粉末状IRP001 Cl并入市售饲料原料成分，然后在例如“混凝土混合器”型设备中充分混合，以提供所概述的饲料中最终浓度。
c.剂量施用方法：根据下表49中详细列出的治疗方案对研究动物进行给药。在相关治疗中，应无限制地向鸡提供含药饲料，作为其唯一的饲料来源。
表50治疗方案-饲料转化率
＊安乐死
＊＊注意：含药饲料在第28天从第6组和第12组撤出，以允许这些组有14天的清除期。
事件时间表
表51事件时间表
测试系统
动物详细信息记录在原始数据中。即：物种，肉用仔鸡小鸡；数量，180；来源，商业的(一批90只)；年龄，一日龄。
动物管理
a.动物福利：对研究动物进行类似管理，并适当考虑其福利。根据动物伦理委员会(AEC)的要求观察研究动物，并完成“动物照管记录”。
b.健康管理：如有必要，应尽快进行任何常规的预防性治疗并记录下来(产品名称，批号，有效期，剂量，施用途径和日期)。
从第0天开始，在合适的位置根据标准操作规程(SOP)每天两次观察研究动物。记录任何需要进一步检查的健康问题。
所有健康问题和不良事件必须在一个工作日内报告给调查者。调查者认为与产品相关、导致死亡、危及生命、涉及大量动物或人类不良事件的任何不良事件，都必须记录并在一个工作日内报告给发起人和AEC。
可以执行常规兽医护理和程序，并在原始数据中进行描述。出于标准管理实践和人道原因，可以在调查者和发起人(如果相关)事先批准的情况下，并用药物疗法。没有施用类似于IVP的治疗。记录所有并用药物疗法，以提供所用材料的标识(产品名称，批号和有效期)，动物ID，使用原因，施用途径，施用的剂量和日期，并包括在原始数据(试验日志)和研究报告中。
如果受伤或疾病导致研究动物安乐死或死亡，应对此进行记录并在可能的情况下由兽医进行验尸。原始数据中包括“验尸报告”，包括可能的死亡原因。
研究报告中包括所有健康问题，不良事件和动物死亡率，包括它们与治疗的关系。
c.畜舍环境：治疗组将鸡饲养在经过批准的动物设施内的两个单独且离散的受控环境房间中的专用的鸡地面畜舍。一个房间可容纳第13至18组(含第13组和第18组)的所有未用药的禽，第二个房间可容纳第1至12组(含第1组和第12组)的所有用药的禽。每个畜舍的地面空间为约1.5m2。根据正常的商业惯例，将鸡在垫料上饲养。
到第49天为止，共有18个地面畜舍，每个畜舍有10只鸡。研究结束时，每个畜舍的最大鸡体重都远低于澳大利亚实用标准中建议的肉用小鸡最大值40kg/m2。
注意-第13至18组(含第13组和第18组)的禽(未治疗的对照动物)与药物治疗的第1至12组禽保持在相似但物理分离的隔离室中，从而确保研究期间无交叉污染。
d.实验饮食：在整个研究过程中，施用配制的商业育雏期(starter)配给量然后育成期(grower)配给量。原始数据中包含显示饲料成分的饲料袋标签或同等物的副本。
e.饲料和水摄入量：称重并记录每天添加的饲料，并计算每天的饲料摄入量(按治疗组)。测量并记录每天的水体积，并计算每天的水摄入量(按治疗组)。
f.动物处置：根据AEC的批准，对研究动物进行人道安乐死，并按照事件时间表中列出的间隔进行记录(表50)。
研究程序
a.试验日志：记录研究期间所有计划的和计划外的事件。
效果评估
a.体重：在第0天(组体重)和第7、14、21、28和35天称重鸡-记录各个动物的体重。在称重前后，使用校准的测试砝码检查称重秤并记录。将研究终止时的体重在各组之间进行比较，以确定治疗效果(如果有)。
b.检查：在总体病理学和组织收集时，对安乐死进行了单独的临床检查。记录临床检查。可以适当记录数字静态图像。
c.观察结果：每天两次检查禽的总体健康状况，通常是在早上8点之前和下午4点之后。因此，两次观察之间的典型间隔是白天9小时，过夜15小时。如果调查者认为显著患有异常临床症状(例如明显的衰弱且恢复可能性较低)，则记录显示异常临床症状的禽，对其仔细观察并对其实施安乐死。
d.尸检检查：在第35至49天之间，按照时间表-表14对所有禽实施安乐死和尸检。
e.总体病理学：对来自所有第1至18组的所有禽进行尸检并检查总体视觉病理学变化，这些变化被适当描述和评分(按个体禽)。
f.组织残留分析：按照时间表、表50，从每组(第1至18组(包含第1组和第18组))中6只(6)最重的禽收集肝脏、肾脏、胸脯肌肉(1)、腿部肌肉(2)[大腿上部和下部]和具有完整脂肪的全部的皮肤的双份代表性样品，并将其冷冻储存(<10摄氏度)，用于随后的标志物残留分析。在第35天将第13至18组的禽作为未治疗的对照禽处死，并收集组织以满足组织测定(tissue assay)要求。
样品将用不干胶标签标记，所述标签列出研究编号，动物ID，时间点，日期，样品类型和重复样品(replicate)。
为了进行残留分析，将样品融化，然后将已知重量的组织(约1g)在2ml水中匀浆。离心样品，并取出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析。
表52分析矩阵
g.样品的储存，转移和处置：记录样品的储存，转移和处置。将重复样品1组织样品在第10节中概述的时间在湿冰上冷冻运输到分析实验室。根据标准操作规程(SOP)，将样品与随附的温度数据记录仪和冷冻水瓶一起转移。在最后一个样品收集时间点之后，将重复样品2组织样品冷冻储存6个月的期间。超出这一点，根据研究现场的决定可将其丢弃，除非发起人代表明确要求不这样做。
统计分析
方法记录在研究报告中。
数据记录
方案规范将取代设施SOP。可以在研究过程中根据需要添加或修改研究表格，而无需进行方案修订或偏离。
a.方案批准：研究开始之前，方案由所有相关人员批准并签署(请参阅第1页)。
b.修改/偏离：修改是在执行更改或修改的任务之前对方案进行的更改或修改。修改必须说明更改的原因，并有书面记录的发起人授权。该修改必须由调查者和发起人签署。
在确定偏离时，调查者应记录、签署相对于本方案或适用的SOP的偏离和注明日期。将评估对研究的整体结果或完整性的影响。必须在切实可行的范围内尽快将偏离告知发起人。
相应地记录所有方案的修改和偏离，并根据发生的日期或识别的日期顺序编号。
c.文件注释：对文件注释进行了相应记录，以澄清否则从原始数据来看可能不明显的事件或情况。必须在切实可行的范围内尽快将文件注释告知发起人。
d.研究人员的变更：研究调查者或其他负责任研究人员的变更应相应记录。
e.原始数据：所有起始原始数据页均由进行观察的人员和记录信息的人员进行分页，用研究编号标识并签名并注明日期。
f.通讯日志：调查者保留与研究相关的所有信件的副本。记录会导致研究文档编制、设计、进行或研究报告发生变化的任何电话交谈。
g.许可：本方案中详细介绍的研究应包含在政府机构许可(例如APVMA小试验许可)中。
研究报告
研究报告由调查者或指定人员准备。包括测量的每个变量的数据清单。研究调查者的合规声明包含在研究报告中。附有原始数据和统计报告的原始签名研究报告将提交给发起人并存档。
实施例8
这项研究通过组织学检查评估了IRP001氯化物在肉用仔鸡中的安全性。
总结与结论
组织学结果示于表53。
表53组织学
从以上看，累积病理学和肠炎得分等于或低于对照治疗1无组。总之，在生产环境中，所鉴定的所有胃肠道(GIT)组织学病变均在肉用仔鸡小鸡的正常限度内。在生产环境中，所鉴定的所有肝脏组织学病变均在肉用仔鸡小鸡正常限度内。
实验说明和方案
研究目的
这项研究的目的是通过组织学检查来检验IRP001氯化物在饲养到市场重量的肉用仔鸡中的一般安全性。
实验设计
实验由以下治疗组成(每治疗1畜舍，表54)。
表54治疗
TRT
禽类型
开始天
在饲料中加入药物
G/Kg
1
肉用仔鸡
0
无
0.0
2
肉用仔鸡
0
IRP001
0.05
3
肉用仔鸡
0
IRP001
0.5
4
肉用仔鸡
0
IRP001
1.0
地面畜舍的描述和管理
将禽饲养在面积为4x 10＝40ft2的畜舍中，并用干净的木材刨花作为垫层，其厚度为约4英寸。该畜舍有5英尺高的侧壁，底部1 1/2英尺是实木，可以防止禽迁徙。
监测建筑物的温度。试验期间的环境条件(温度)对于动物的年龄是适合(最佳)。放置在畜舍上方的荧光灯提供照明。每个畜舍在一个管式投饲机中无限制地提供饮食。从D0到D7，饲料也被供应到放置在每个畜舍垫料上的托盘上。每个畜舍无限制地从一个Plasson饮水器提供水。
在整个实验中都使用了标准的地面畜舍管理规范。每天两次对动物和畜舍环境设施进行检查，观察并记录总体健康状况，恒定的饲料和水供应以及温度，清除所有死禽并识别意外事件。在研究期间发现死亡的禽记录在每日死亡率记录中，不会被替换。记录畜舍数，死亡日期，性别，体重和诊断。
禽
获得孵化日的科布(Cobb)雄性小鸡，每个畜舍放置十只雄性肉用仔鸡小鸡。在动物处置表上记录所有测试动物和任何其他禽的可计量性。禽在孵化场进行了性别鉴定。记录了孵化场的种鸡群历史和疫苗接种记录。在D0和42记录畜舍的禽体重。
饲料
所有饲料均被制备成碎裂料/粒料并被喂食。
记录所有用于准备治疗批次的基础饲料和项目的数量。将每批饲料混合并分开装袋。确定每个袋子的研究编号，混合日期，饲料类型和正确的治疗编号。保留了饲料混合和测试物品清单的完整记录。
饲料样品
收集治疗饲料样品(每个
施用时间表
所有的重量都按畜舍计。从D0至21喂食治疗育雏期饲料。在D21，按畜舍称重未消耗的育雏期饲料并将其丢弃。发出育成期饲料并施用直到D35。在D35，按畜舍称重未消耗的育成期饲料并将其丢弃。喂食育肥期(finisher)饲料直到D42。在D42，按畜舍称重未消耗的育肥期(finisher)饲料并将其丢弃。
饮食
饮食细节见表55和表56。
表55营养
使用的主要成分是玉米，大豆粉和动物副产品。
表56成分
1维生素混合物提供以下(每kg饮食)：硫胺·一硝酸盐，2.4mg；烟酸44mg；核黄素4.4mg；D-泛酸钙，12mg；维生素B12(钴胺)，12.0μg；吡多辛·HCl，4.7mg；D-生物素，0.11mg；叶酸5.5mg；亚硫酸氢钠甲萘醌络合物，3.34mg；氯化胆碱，220mg；胆钙化醇27.5ug；反式视黄醇乙酸酯，1,892ug；全外消旋α生育酚乙酸酯，11mg；乙氧喹125mg
2微量矿物质混合物提供了以下(每kg饮食)：锰(MnSO4·H2O)，60mg；铁(FeSO4·7H2O)，30mg；锌(ZnO)，50mg；铜(CuSO4·5H2O)，5mg；碘(乙二胺二氢碘化物)，0.15mg；硒(NaSe03)，0.3mg。
基础饲料不含任何益生菌/益生元饲料添加剂，NSPases，抗球虫药或抗生素生长促进剂。所有饮食均含有植酸酶。
组织学样品
在研究结束的当天(D42)，对每个畜舍的五只禽进行了人道安乐死，并收集了上，中，下肠切片以及肝叶，并将其储存在中性缓冲***中。这些样品被运送以进行分析。
程序
1.在整个实验过程中使用标准的地面畜舍管理惯例。监测建筑物的温度。试验期间的环境条件(温度)对于动物的年龄是适合(最佳)的。放置在畜舍上方的荧光灯提供照明。照明方案是从D0到D14点亮24小时，然后点亮18小时直到D42。
2.每个畜舍在一个管式投饲机中无限制地提供饮食。从第1天至第7天，饲料也被供应到放置在每个畜舍的垫料上的托盘上。
3.施用和饮水的方法。无限制的。
4.环境控制。有环境湿度。
5.疾病控制。研究期间未使用任何伴随药物疗法。
6.禽识别。畜舍是度量单位。畜舍的安全性阻止了禽的迁徙。
7.在研究过程中，记录针对一般鸡群状况的每天两次观察。所观察到的包括饲料和水的可获得性，温度控制以及任何异常情况。仔细观察了禽是否有异常反应。
数据条目与分析
源数据使用擦洗不掉的墨水录入。条目清晰易读，由进行观察录入的人员签名或初始化，并注明日期。每张源数据表均由负责该数据的人员签名。对源数据的任何错误或更改进行初始化并注明日期，并添加关于更改原因的更正代码或声明。
禽和饲料的处置
所有禽和饲料都按照SOP被埋。处置记录包含在源数据中。
源数据的位置
原始源数据表和最终报告发送给发起人。保留文件的精确副本和最终报告。
实施例9
这项研究测量了IRP001对堆型艾美球虫，巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的混合物的抗球虫功效/敏感性。
实验设计
实验由72个笼子组成，以8只雄性小鸡开始。将治疗以6个区组重复，每个随机分配在12个笼子的区组内。Southern Poultry Research，Inc.(SPR，雅典，GA 30607)提供了用于治疗和区组的畜舍分配的随机程序，该公司为发起人进行了研究。
治疗组列于表57。
表57治疗组
Trt
描述
1
没有治疗/没有攻击
2
没有治疗/攻击
3
IRP001-0.03g/kg
4
IRP001-0.1g/kg
管理
1.对设施进行彻底检查，以确保所有笼子在每个笼子中都有可获得的水和饲料。保持建筑物温度适合禽类的年龄。
2.通过沿墙壁垂直悬挂的荧光灯提供均匀连续照明。
3.无限制地提供饲料和水。
4.每天两次检查笼子。记录观察结果，包括饲料可获得性，水，温度和任何异常情况。
5.从笼子中取出死亡禽后，将笼子编号，日期，禽体重，性别和可能的死因记录在每日死亡率记录中。
实验配给量
配制了与佐治亚州北部常用的饲料混合的未加药的商业育雏期配给量。从小鸡到达之日起直至研究结束前，无限制地施用这种配给量(以糊状物形式)。实验饮食是从统一的基础饮食中制备的。记录用于制备治疗批次的所有基础饲料和测试物品的数量。混合治疗饮食以确保测试物品的均匀分布。在含药治疗饮食之间冲洗混合器。将饲料转移至2号楼，并分配到相同治疗的笼子中。
称量已发出并保留在DOT 14和20的饲料。
饲料样品
收集每批治疗饮食的开始，中间和结束各一次，并混合以形成复合样品。对于每种治疗，从复合物中取出一个样品，并保持直到研究完成。
动物
获得孵化日小鸡(Cobb 500)用于研究。记录菌株，来源和疫苗接种记录。到达后，将小鸡分配到治疗养鸡房笼中。将小鸡(DOT 0)分成8组，称重，并放入指定的笼子中。参加测试的禽总数为576。所有禽的可计量性记录在源数据中。
按照笼子在DOT 0、14和20称重禽。
卵囊接种
球虫卵囊接种程序在SPR SOP中进行了描述。在研究的DOT 14，所有T1禽通过口服移液管(口服)接受1ml蒸馏水。所有其他禽均接受稀释至1ml体积(口服)的球虫接种物。接种物是堆型艾美球虫(100,000个卵囊/禽)，巨型艾美球虫(50,000个卵囊/禽)和柔嫩艾美球虫(75,000个卵囊/禽)的混合物。
每克粪便材料中的卵囊
在DOT 19，清洁了所有粪便收集盘。在DOT 20，从所有治疗笼子中收集粪便样品。将从每个笼子收集的粪便充分混合，并准备好以进行粪便漂浮。检查每个样品的每克粪便材料的卵囊数量。
病变评分
在DOT 20，对每个笼子中的所有禽均进行了病变评分。约翰逊和里德(Johnsonand Reid，1970)的球虫病病变评分方法用于对肠道的感染区域进行评分(Johnson J,ReidWM.“Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques in battery and floor-penexperiments with chickens”Exp Parasitol.1970Aug；28(1):30-6)。
收集数据
1.数据收集遵循以下时间表：
DOT 0发出饲料，按笼子称重并分配禽。
DOT 14使禽接种球虫(T1除外)。
DOT 19清洁***物盘
DOT 20按笼称重禽。将剩余饲料称重。粪便材料按笼收集。对所有禽球虫病病变进行了评分。
2.尸检记录死亡重量，以确定可能的死亡原因。
记录每天两次的临床观察。
测试动物和饲料的处置
根据SPR SOP，将所有禽和剩余的饲料埋入SPR坑中。处置记录包括在源数据中。
数据分析
计算组体重增加，饲料消耗，饲料转化率，opgs，球虫病得分和死亡率的平均值。根据用于数据分析的SPR标准操作程序对原始数据进行分析。使用STATIX程序LSD测试分析原始数据。当ANOVA F值显著(p≤0.05)时，使用P值0.05分离均值。
记录
最终报告和原始源数据表发送给发起人。Southern Poultry Research，Inc.保留了准确的副本。
结果
饲料摄入量，校正后的饲料转化率(Adj.FCR)，体重增加(Wt.Gain)，死亡率(％Cocci Mort.)的结果；病变得分；和粪便卵囊的计数(堆型艾美球虫(E.acer)，巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫)示于表58。
表58实施例9的结果
本领域技术人员将认识到，在不脱离如广泛描述的本发明的范围的情况下，可以对如具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是说明性的而非限制性的。
具体实施方式
图1描绘了AMR从食物生产动物到人类的传播。图取自https://www.cdc.gov/ foodsafety/challenges/from-farm-to-table.html。
图2描述了沙门氏菌感染和食物中毒的各个方面。图取自http://thelancet.com/ journals/lancet/article/PIIS0140-6736(11)61752-2/fulltext和https:// www.epainassist.com/abdominal-pain/stomach/food-poisoning。
图3描述了弯曲杆菌流行病学。图取自https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/10/ 6/04-0403-f1。
图4描绘了小檗碱季铵阳离子、小檗碱氯化物和小檗碱半硫酸盐的分子结构。
图5至图12描绘了实施例1中所述的鸡坏死性肠炎先导研究的结果。
图5是每组在尸检之前的禽死亡率的图。
图6是描述按治疗/攻击组的中位数小肠病变得分的图。
图7描绘了坏死性肠炎病变得分。
图8第9组禽十二指肠的照片；NE攻击的，IVP/小檗碱水1.0g/L
图9第6组禽十二指肠的照片；NE攻击的，无小檗碱治疗
图10第12组禽十二指肠的照片；NE攻击的IVP/小檗碱饲料2.0g/kg
图11第4组禽十二指肠的照片；无攻击IVP小檗碱水1.0g/L。
图12第6组禽十二指肠的照片；NE攻击的，没有IVP/小檗碱。
图13描绘了本公开内容中所指的代表性化合物的分子结构和名称。
图14描绘了本发明的其他代表性化合物的分子结构和名称：
图15描绘了实施例2中所述的坏死性肠炎先导研究的总个体水摄入量(阶段1)。
图16描述了实施例2中所述的坏死性肠炎先导研究的总个体水摄入量(阶段2)。
图17描绘了实施例2中所述的坏死性肠炎先导研究的饲料转化率(阶段1和2)。
图18描绘了用于实施例3中描述的研究的具有日龄小鸡的畜舍布置。
图19描述了在实施例3中描述的研究的第14天从播种者(seeder)畜舍收集的垫料(litter)。
图20描绘了在实施例3中描述的研究的第14天每个畜舍分配的400克垫料。
图21是按治疗组在实施例3中描述的研究中禽的平均日体重增加的图：y轴的平均日增加(ADG)(g/天)相对于x轴的生长期(天)。治疗组1(对照组)：治疗组2(IVP 0.30g/kg)；治疗组3(IVP 0.10g/kg)；治疗组4(IVP 0.03g/kg)；治疗组5(沙利霉素(Salino)60ppm)；治疗组6(沙利霉素+杆菌肽锌(Zn Bacitracin)50ppm(Salino Zn Bac))。
图22描述了在对照育肥期(finisher)和实施例3、治疗组2中使用的IVP之间的比较(IVP的剂量为0.30g/kg)。
图23描绘了来自实施例3的治疗组2的禽类在第42天的粪便(IVP的剂量为0.30g/kg)。
图24来自实施例3的堆型艾美球虫(E.acervulina)型病变(来自十二指肠的外部和内部)，得分+1。
图25来自实施例3的堆型艾美球虫(E.acervulina)型病变，得分+2和+3。
图26实施例3的堆型艾美球虫(E.acervulina)型病变，得分+4。
图27来自实施例3的肠的体腔膨胀(ballooning)。
图28实施例3的上部肠(upper gut)充血(白色箭头；左侧标题)和肠半透明(黑色箭头；右侧标题)。
图29来自实施例3的含水的肠内容物，包括橙色粘液。
图30描绘了在42天时校正的饲料转化率与在21天时肠球虫病病变总得分之间的相关性。实线显示最佳拟合线；虚线显示95％置信区间。
下面描述本公开内容的特定实施方案。将意识到，这些实施方案是说明性的而非限制性的。
发明详述
本公开内容涉及预防和/或治疗动物中的传染病的方法，其中所述方法包括向所述动物施用小檗碱生物碱或其可接受的盐。
在本文公开的方法(和动物饲料；给药方案和用途)中：动物优选是人。所述动物优选是非人。优选地，非人动物是食物生产动物。食物生产动物优选选自鸡或猪。优选地，动物是水生动物。水生动物优选是有鳍鱼(finfish)。优选地，水生动物是水生有壳类动物(shellfish)。水生有壳类动物(shellfish)优选选自甲壳动物或软体动物。优选地，甲壳动物选自螃蟹，鳌虾(crayfish)，龙虾，对虾(prawn)和小虾。软体动物优选地选自蛤(clam)，贻贝，牡蛎，扇贝和田螺(winkle)。优选地，动物是哺乳动物。哺乳动物优选是人，马，狗，猫，绵羊，牛，猪或灵长类动物。优选地，动物是禽。禽优选是鸡，鹅，火鸡或鸭。
斑点性肝疾病
优选地，传染病是肝疾病或肠疾病。优选地，传染病是肠疾病。肝疾病优选是斑点性肝疾病，动物是鸡。优选地，鸡是产蛋鸡。斑点性肝疾病优选由弯曲杆菌属(Campylobacter)细菌引起。优选地，弯曲杆菌是抗生素抗性的。
沙门氏菌病(Salmonellosis)
优选地，传染病与食物中毒有关。食物中毒优选是沙门氏菌病。优选地，沙门氏菌病是由沙门氏菌的抗生素抗性菌株引起的。
弯曲杆菌病(Campylobacteriosis)
优选地，传染病是弯曲杆菌病。弯曲杆菌病优选地由弯曲杆菌的抗生素抗性菌株引起。
病原体为大肠杆菌的传染病：猪腹泻/泻病(Scour)
优选地，传染病是由大肠杆菌引起的。
在吮吸仔猪(sucking piglet)的所有疾病中，腹泻是最常见的，可能也是最重要的。在某些暴发中，它是导致高发病率和高死亡率的原因。在运行良好的群中，在任何时候应有少于3％的一窝仔畜需要治疗，腹泻造成的仔猪死亡率应低于0.5％。但是，在严重的暴发中，死亡率水平可能会上升到7％或更高，在个别未治疗的仔猪中，死亡率水平可能上升到至多100％。主要的细菌原因是大肠杆菌。在吮吸期间的任何年龄均可发生仔猪的泻病，但通常在5天之前以及7至14天之间有两个高峰期。
传染病优选是腹泻，而动物是猪。优选地，传染病是泻病，而动物是猪。传染病优选是痢疾，而动物是猪。
优选地，传染病是由大肠杆菌的抗生素抗性菌株引起的。
与短螺旋体属(Brachyspira)有关的猪痢疾
猪痢疾(SD)是由一种称为短螺旋体属的气旋细菌引起的，其中包括猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)，多毛短螺旋体(Brachyspira piloscoli)和汉普森短螺旋体(Brachyspira hampsonii)。该生物体引起大肠的严重炎症，其伴有血性粘液腹泻(bloody mucous diarrhoea)。该疾病的高昂费用与发病率，死亡率，生长抑制和饲料转化效率以及持续不断的饲料内药物治疗费用有关。
优选地，传染病是由短螺旋体属细菌引起的。传染病优选是痢疾，而动物是猪。优选地，传染病是由短螺旋体属的抗生素抗性菌株引起的。
传染病优选由劳森菌(Lawsonia)属细菌引起。优选地，传染病是由劳森菌属的抗生素抗性细菌菌株引起的。传染病优选由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)引起。
猪回肠炎相关胞内劳森菌
回肠炎包括一组病症，该病症涉及与细菌胞内劳森菌相关的小肠的病理变化。该疾病有四种不同形式。第一种形式是猪肠腺病(PIA)，是沿肠排列的细胞的异常增殖。PIA可以发展为其他三种罕见的形式：坏死性肠炎(NE)，其中小肠的增殖细胞死亡并脱落，伴有小肠的总增厚(软管状肠(hosepipe gut))。局限性回肠炎(RI)，小肠终部发炎和增生性出血性肠病(PHE)或“血肠(bloody gut)”，其中小肠大量出血。PHE是生长猪中最常见的回肠炎形式。PHE在60公斤的猪和后备母猪(gilt)中更为常见。
优选地，传染病由选自以下的一组病症代表：猪肠腺病，坏死性肠炎，局限性回肠炎和增生性出血性肠病，并且所述动物是猪。
艾美球虫(Eimeria)为病原体的传染病
优选地，传染病是由艾美球虫属的寄生虫引起的。所述寄生虫优选选自巨型艾美球虫(E.maxima)，堆型艾美球虫(E.acervuline)和布氏艾美球虫(E.brunette)。优选地，传染病是由艾美球虫属的抗生素抗性寄生虫引起的。抗生素抗性寄生虫优选选自巨型艾美球虫，堆型艾美球虫(E.acervuline)和布氏艾美球虫抗生素抗性细菌菌株。优选地，传染病是球虫病，而动物是鸡。
梭菌为病原体的传染病
优选地，传染病是由梭菌属细菌引起的。细菌优选地选自：艰难梭菌(Clostridiumdifficile)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)。
优选地，细菌是艰难梭菌(C.difficile)。传染病优选是腹泻，而动物是人。优选地，传染病是结肠炎，而动物是人。
鸡产气荚膜梭菌和坏死性肠炎
优选地，传染病由梭菌属的细菌引起，其中细菌是产气荚膜梭菌。传染病是由梭菌属的抗生素抗性细菌引起的，其中，抗生素抗性细菌是抗生素抗性产气荚膜梭菌。
传染病优选是坏死性肠炎，而动物是鸡。优选地，坏死性肠炎是由产气荚膜梭菌A型菌株引起的。产气荚膜梭菌A型菌株优选为产气荚膜梭菌A型菌株EHE-NE36。优选地，产气荚膜梭菌A型菌株是产气荚膜梭菌A型菌株EHE-NE18。坏死性肠炎优选由产气荚膜梭菌C型菌株引起。
优选地，经由鸡的饲料或水进行施用。饲料优选为碎裂料(crumble)或粒料(pellet)的形式。
优选地，小檗碱生物碱以0.001g/kg至2.0g/kg饲料的剂量在鸡的饲料中施用。小檗碱生物碱优选以0.003g/kg至0.3g/kg饲料的剂量在饲料中施用。小檗碱生物碱优选以0.001g/L至1g/L水的剂量在鸡的水中施用。
优选地，减少病变得分和/或减少粪便卵囊计数(fecal oocyst count)。优选地，减少病变得分。优选地，减少粪便卵囊计数。优选降低发病率。优选地，降低死亡率。优选地，FCR降低。优选地，在平均每日体重增加中有增加。
饲料安全性和残留水平
出于安全性原因，对人和动物药物和动物饲料添加剂进行了严格管制。在澳大利亚，治疗产品管理局(TGA)负责管理供人类使用的治疗产品，而澳大利亚农药和兽药管理局(APMVA)负责对农药和兽药进行评估和注册。在美国，食物药物管理局(FDA)负责批准受联邦食物、药物和化妆品法案(FD&C Act)管制的人和动物药物以及饲料添加剂。
FD&C法案要求证明用于食物生产动物的化合物是安全的，由暴露于这些化合物的动物生产的食物对于人消费是安全的。尤其是，法规(21CFR第500部分，E亚部分-食物生产动物中使用的致癌化合物的规定)禁止在食物生产动物中使用当被人或动物摄入时被发现诱发癌症的任何化合物，除非某些条件被符合(所谓的“二乙基己烯雌酚(DES)限制性条款(Proviso)”)。根据DES限制性条款，如果可以通过规定的检查方法确定在合理确定在实践中一定要遵循的使用条件下，由食物生产动物生产的食物中发现可疑的致癌化合物“无残留”，则不禁止使用所述可疑的致癌化合物。
尽管小檗碱生物碱类的安全性被例如小檗碱生物碱类作为人类膳食补充剂的广泛使用证明，但小檗碱却被怀疑是一种致癌剂，尽管小檗碱本身具有抗癌活性。(Ma,W.；Zhu,M.；Zhang,D.；Yang,L.；Yang,T.；Li,X.；和Zhang,Y.“Berberine inhibits theproliferationand migration of breast cancer ZR-75-30cells by targetingEphrin-B2”Phytomedicine 2017,25:45-51)。因此，如果FDA决定将小檗碱作为致癌化合物进行管理，除非适用“无残留”DES限制性条款，否则美国法规禁止在食物生产动物中使用小檗碱。
术语“无残留”是指可食用组织中剩余的任何残留含量如此之低，以至于对消费者而言，其表现出不显著的致癌风险。更具体地说，将癌症的不显著的风险定义为风险增加1百万分之一。
如本文所用，小檗碱的“安全”残留水平是造成疾病、特别是癌症的不显著的风险的水平。
优选地，治疗期后动物中小檗碱生物碱的残留水平低。在治疗期之后，动物中优选存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期之后，在鸡的肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。每g肌肉组织的残留水平至少低于约13ng小檗碱生物碱。
优选地，每g肌肉组织的残留水平为约10ng小檗碱生物碱。残留物含量优选为约5ng/g。
优选地，小檗碱生物碱已经以约0.3g/kg的比率在鸡的饲料中施用。鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平优选如下：
鸡胸脯(breast of chicken)的肌肉组织中约6.1ng/g；
鸡小腿(lower leg of chicken)的肌肉组织中约5.5ng/g；和
鸡大腿(upper leg of chicken)的肌肉组织中约11.6ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以小于约小于0.1g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，小檗碱生物碱以约0.03g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。35.鸡肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平优选如下：
鸡胸脯的肌肉组织中低于2ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中低于2ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中低于2ng/g。
优选地，在治疗期和清除期后，动物的肌肉组织中存在低残留水平的小檗碱生物碱。在治疗期和清除期之后，优选在动物的肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期和清除期之后，在鸡的肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，清除期为1-2周。清除期优选选自以下的期间：1天至14天之间；1天至7天之间；1天至4天之间；和1天至2天之间。优选地，清除期是选自1天、2天、4天、7天和14天的期间。
优选地，在1天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平如下：
鸡胸脯的肌肉组织中约5.7ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中约3.2ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中约6.0ng/g。
优选地，在2天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平如下：
鸡胸脯的肌肉组织中约3.6ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中约3.1ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中约4.5ng/g。
优选地，在4、7和14天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平低于2ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以约0.3g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
残留水平优选至少低于每g肌肉组织13ng小檗碱生物碱。残留水平优选为每g肌肉组织约10ng小檗碱生物碱。优选地，残留水平为约5ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以约大于0.1g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在的小檗碱生物碱的残留水平低。优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期之后，在鸡的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。鸡的肝脏和肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平优选低于2ng/g。优选地，小檗碱生物碱以约0.03g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期和清除期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在低残留水平的小檗碱生物碱。优选地，在治疗期和清除期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期和清除期之后，在鸡的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。清除期优选为1周至2周之间的期间。优选地，清除期是选自以下的期间：1天至14天之间；1天至7天之间；1天至4天之间；和1天至2天之间。清除期优选为选自1天、2天、4天、7天和14天的期间。
优选地，在1天的清除期后，鸡的肌肉组织中小檗碱生物碱的残留水平如下：
鸡胸脯的肌肉组织中约5.7ng/g；
鸡小腿的肌肉组织中约3.2ng/g；和
鸡大腿的肌肉组织中约6.0ng/g，
和鸡的肝脏组织中的小檗碱生物碱残留水平为约8.0ng/g。
优选地，在7天的清除期后，鸡的胸脯、小腿和大腿的肌肉组织中的小檗碱生物碱的残留水平低于2ng/g，并且鸡的肝脏组织中的小檗碱生物碱的残留水平为约6.5ng/g。
优选地，在14天的清除期之后，鸡的胸脯、小腿和大腿的肌肉组织中的小檗碱生物碱的残留水平低于2ng/g，并且鸡的肝脏组织中的小檗碱生物碱的残留水平为约3.0ng/g。
优选地，小檗碱生物碱以约0.3g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在低残留水平的小檗碱生物碱。优选地，在治疗期之后，动物的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。
优选地，在治疗期之后，在鸡的肝脏和肌肉组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。鸡的肝脏组织和胸脯、小腿和大腿的肌肉组织中的小檗碱生物碱的残留水平优选低于2ng/g。优选地，小檗碱生物碱以约0.03g/kg的剂量在鸡的饲料中施用。
优选地，在治疗期和清除期之后，在鸡的肝脏组织中存在安全残留水平的小檗碱生物碱。清除期优选为选自1周至2周之间的期间。优选地，清除期是选自以下的期间：1天至14天之间；1天至7天之间；1天至4天之间；和1天至2天之间。清除期优选为选自1天、2天、4天、7天和14天的期间。
优选地，在1天的清除期后，鸡的肝脏组织中小檗碱生物碱的残留水平为约8.0ng/g。在7天的清除期后，鸡的肝脏组织中小檗碱生物碱的残留水平优选为约6.5ng/g。优选地，在14天的清除期后，鸡的肝脏组织中小檗碱生物碱的残留水平为约3.0ng/g。小檗碱生物碱优选以约0.3g/kg的剂量在鸡饲料中施用。
优选地，治疗期为35天。
其他地方描述了“残留研究”。小檗碱生物碱的残留水平可以通过实验确定。使用LC-MS/MS确定动物组织中小檗碱生物碱残留水平的示例方案如下：
安乐死后，从每只禽切除胸脯，小腿(leg)和大腿(thigh)的肌肉以及肝脏和肾脏样品。将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品并移出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析小檗碱，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱的ng)。
小檗碱制剂的施用
优选地，小檗碱生物碱是小檗碱半硫酸盐。小檗碱生物碱优选为小檗碱氯化物。
优选地，所述方法进一步包括掩蔽小檗碱生物碱或可接受的盐的苦味的添加剂。
小檗碱
小檗碱是从黄连(Rhizoma coptidis)，黄柏(Phellodendri chinensis cortex)和其他草药中提取的异喹啉生物碱。根据中国药典，黄连，黄柏(Phellodendri chinensis)和黄檗(Phellodendron amurense)和三颗针(Berberidis radix)的小檗碱含量分别为5.5％，3.0％，0.6％和0.6％。黄连(Rhizoma coptidis)(汉语拼音为Huanglian)属于毛莨科(Ranunculaceae)，包含三个主要的黄连属的种：味连(Coptis chinensis，汉语拼音为Weilian)，雅连(Coptis deltoidea，汉语拼音为Yalian)和云连(Coptis teeta，汉语拼音为Yunlian)。黄连在秋季被收获，除去纤维状根后切成薄片。那些具有嫩黄色的部分和非常苦的味道的黄连被认为是优质的。小檗碱(和本文公开的其他小檗碱生物碱类)的苦味使得掩蔽味道/适口性成为配制用于施用给动物受试者的小檗碱生物碱类时要考虑的重要问题。
小檗碱是黄色粉末。氯化物盐微溶于冷水，但易溶于沸水。它实际上不溶于冷乙醇。半硫酸盐可溶于约30份水，微溶于乙醇。小檗碱是一种季铵阳离子，分子式为C20H18NO4 +，分子量为336.36。图4描绘了小檗碱铵阳离子，小檗碱氯化物盐和小檗碱半硫酸盐的分子结构。
小檗碱可以肠内施用可接受的任何形式施用。用于肠内施用的合适的非限制性形式包括片剂，胶囊，糊剂，颗粒剂，可咀嚼的薄片(chewable wafer)，凝胶剂，口服液，注射液，含药水和含药饲料(medicated feed)以及栓剂。然而，对于经济利益重要的食物生产动物，小檗碱的优选施用方法是通过颗粒形式的饲料添加剂或含药饲料。也可以通过将水与小檗碱的合适溶液或悬浮液混合，通过动物受试者的饮用水来施用小檗碱。
本公开内容还预期提供可以添加到食物和水中的颗粒剂和液体制剂，其使得本文公开的制剂对例如食物生产动物受试者更可口。例如，可口的小檗碱生物碱制剂可包含小檗碱和适于形成粒状产品的可接受的赋形剂。适于形成粒状产品的可接受的赋形剂是例如玉米淀粉或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一个实例中，液体制剂是液体浓缩物。
也有许多化合物具有与小檗碱相似的结构和特性，包括原小檗碱：小檗红碱，异种荷包牡丹碱，四氢非洲防己碱，药根碱，13-羟基小檗碱氯化物，甲氧檗因，7,8-二氢-13-甲基小檗碱，黄藤素(非洲防己碱)和13-苄基小檗碱。原小檗碱与小檗碱一起适用于本发明的组合物/方法/用途，并且在说明书中称为“小檗碱生物碱类”。
黄藤素(非洲防己碱)
黄藤素或非洲防己碱是从黄藤(Fibauera recisa Pierre)提取的苦味生物碱。根据中国药典的规定，黄藤含有不少于2.0％的黄藤素。其它来源是黄连(Coptidisrhizoma)，味连(Coptis chinensis Franch)、雅连(Coptis deltoidea)和云连(Coptisteeta Wall)的根茎。黄连包含不少于1.5％的黄藤素。
氯化非洲防己碱为黄色固体，溶于热水，微溶于水，微溶于乙醇。熔点为196-198℃。其分子式为C21H22NO4Cl，分子量为387.86。图13列出了非洲防己碱季铵阳离子的分子结构和氯化物盐的结构。
制备的饲料中抗微生物化合物的总有效量或剂量可以为0.001g/kg至2g/kg。制备的饲料中的抗微生物化合物总量的示例量为：0.001g/kg(0.0001％)，0.003g/kg(0.0003％)，0.01g/kg(0.001％)，0.03g/kg(0.003％)，0.1g/kg(0.01％)，0.3g/kg(0.03％)，1.0g/kg(0.1％)和2g/kg(0.2％)。
本公开内容还涉及包含小檗碱生物碱和动物食品的动物饲料，其中小檗碱生物碱的量为动物食品的约0.001％至1％w/w。
食品中小檗碱生物碱的量可以在0.001g/kg至2g/kg的范围内，即0.001％至0.2％w/w。食品中小檗碱生物碱的示例含量为：0.001g/kg(0.0001％)，0.003g/kg(0.0003％)，0.01g/kg(0.001％)，0.03g/kg(0.003％)，0.1g/kg(0.01％)，0.3g/kg(0.03％)，1.0g/kg(0.1％)和2.0g/kg(0.2％)。
饲料优选为碎裂料(crumble)；粒料形式；或水性形式。
本公开内容还涉及一种给药方案，该给药方案包括向动物施用本文所公开的小檗碱生物碱或动物饲料，其中所述小檗碱生物碱或所述组合物或动物饲料以有效预防和/或治疗动物的传染病的量施用1至6周。
优选地，将小檗碱生物碱或动物饲料喂食1、2、3、4、5或6周。优选地，将小檗碱生物碱或动物饲料喂食1至6周；2至5周；或3到4周之间。
优选地，小檗碱生物碱以约0.6g/L水中或约1.2g/kg饲料中的浓度施用。饲料中小檗碱生物碱的量可以在0.001g/kg至2g/kg，即0.0001％至0.2％w/w的范围内。食品中的小檗碱生物碱或可接受的盐的示例量为：0.001g/kg(0.0001％)，0.003g/kg(0.0003％)，0.01g/kg(0.0001％)，0.03g/kg(0.0003％)，0.1g/kg(0.01％)，0.3g/kg(0.03％)，1.0g/kg(0.1％)和2g/kg(0.2％)。
本公开内容还涉及一种用于降低食物生产动物中的饲料转化率的方法，其中所述方法包括向食物生产动物施用小檗碱生物碱的步骤。
优选地，食物生产动物没有疾病。食物生产动物优选患病。优选地，食物生产动物选自鸡或猪。食物生产动物优选是鸡。
本公开内容还涉及一种用于预防或治疗动物中的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及一种用于预防或治疗动物中传染性肠疾病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
本公开内容还涉及一种用于预防或治疗动物中由艾美球虫属引起的传染病的方法，其包括施用本文公开的动物饲料。
优选地，传染病是由艾美球虫属的抗生素抗性寄生虫引起的。传染病优选是球虫病，而动物是鸡。
优选地，传染病是坏死性肠炎，而动物是鸡。
本公开内容还涉及小檗碱生物碱在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
本公开内容还涉及小檗碱生物碱在预防和/或治疗以下中的用途：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
本公开内容还涉及用于预防和/或治疗以下的小檗碱生物碱：
动物中的传染病；
动物中的传染性肠疾病；
动物中由艾美球虫属引起的传染病；或
由梭菌属细菌引起的传染病，其中细菌是产气荚膜梭菌。
在以下研究中描述了用于预防或治疗动物中的传染病的制剂，剂量和方案的开发。
制剂和适口性研究
在给肉用仔鸡(broiler)小鸡施用四种IRP001制剂后确定饲料适口性和禽生产率的研究。
研究设计–收到后，将二百四十只(240)日龄的商品肉用仔鸡小鸡平均分入单独的地面畜舍上，并使其适应环境7天。在第7天，将禽称重并按顺序将它们分配给十六(16)组，每组15只禽。饲料摄入量，水摄入量，体重增加和死亡率被用作结果参数。
调查研究的兽医产品(IVP)
表1用于制剂和适口性研究的IVP
名称
组分
剂量水平(g/kg)＊
掩蔽的IRP001氯化物
30％IRP001
2.7，5.3和10.7
掩蔽的IRP001硫酸盐
10％IRP001
8.0，16.0和32.0
未掩蔽的IRP001氯化物
100％IRP001
0.4，0.8和1.6
未掩蔽的IRP001硫酸盐
100％IRP001
0.4，0.8和1.6
＊剂量基于饲料中IRP001的固定浓度
根据下表2中详述的治疗方案对研究动物给药。无限制地在相关治疗中向鸡提供含药饲料，因为鸡的唯一饲料来源，饮用水也是无限制地提供的。
表2治疗方案
表3事件时间表
根据上面可以记录动物(和安乐死后的器官)的食物和水摄入量以及体重。可以计算出整个治疗期的平均体重增加，平均每日体重增加以及饲料转化率(FCR)。可以通过这些参数评估动物的表现。同样，食物和水摄入量参数可以指示药物的适口性，而体重增加和饲料转化率(FCR)参数可以提供IVP的抗生素作用，即IVP促进生长的程度。
饲料转化效率研究
确定当通过饲料向商品肉用仔鸡小鸡施用时IRP001的饲料转化效率和组织残留的研究。还研究了清除期为1周的残留。
调查研究的兽医产品(IVP)
表4饲料转化效率研究的IVP
名称
组分
剂量水平(g/kg)
IRP001氯化物
100％IRP001氯化物
1.0，0.1，0.03和0.01
表5治疗方案
表6事件时间表
观察1周的清除期后，IRP0001的残留水平通过以下实验确定：
安乐死后，从每只禽切除胸脯，小腿和大腿以及肝脏和肾脏的肌肉样品。将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品，并取出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析IRP001，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱ng)。
IRP001对工业标准杆菌肽锌(Zinc Bacitracin)的功效研究
通过施用IRP001确定预防或治疗坏死性肠炎的功效，包括研究剂量反应，饲料转化率，组织残留和安全性。使用经过验证的实验模型，通过饲料将IRP001施用给采用艾美球虫属的种(Eimeria spp)和产气荚膜梭菌的致病菌株通过人工攻击(challenged)的肉用仔鸡小鸡。当前工业标准的治疗、杆菌肽锌用于功效和FCR比较。
研究设计(坏死性肠炎攻击)–隔离器中饲养(housed)的商品肉用仔鸡小鸡在9日龄时被在1mL的1％(w/v)无菌盐水中的巨型艾美球虫和堆型艾美球虫(E.acervuline)各自5,000株减毒的疫苗菌株孢子形成的卵囊和布氏艾美球虫2,500株孢子形成的卵囊口服感染。
在卵囊攻击后六天(第15天)，施用已知的致病性产气荚膜梭菌菌株(A型菌株NE18)，i.t.(
尸检时的饲料摄入量，体重增加，死亡率和NE病变得分均用作结果参数。
调查研究的兽医产品(IVP)-IRP001
表7 IRP001对工业标准杆菌肽锌的功效研究的IVP和剂量水平
名称
组成
剂量水平(克/公斤)
IRP001
100％IRP001
1.0、0.3、0.1、0.03
杆菌肽锌
工业标准
工业标准
表8攻击和治疗方案
表9事件时间表
IRP0001的残留水平可以通过以下实验确定：
安乐死后从每只禽切除胸脯，小腿和大腿以及肝脏和肾脏的肌肉样品，将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品并移出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析IRP001，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱的ng)。
剂量率研究
研究目的是评估IRP001在饲料中的三种剂量率对商品肉用小鸡中的中度混合球虫病攻击(艾美球虫属的种)的功效，和评估坏死性肠炎或非特异性肠炎的任何发生情况。安全性数据和组织残留数据将被获得。
研究设计(艾美球虫属攻击)–饲养在畜舍中的商品肉用仔鸡小鸡在14日龄(第14天)被野生型艾美球虫属卵囊感染；大约12,000个柔嫩艾美球虫(E.tenella)，40,000个堆型艾美球虫(E.acervuline)和尽可能多的巨型艾美球虫卵囊/禽。
卵囊攻击后7天(第21天)，从每个试验畜舍中随机选择每组四只禽并进行人道安乐死。
评估在第21天和尸检时的总体肠健康(肠炎)和病变得分，将饲料摄入量、体重增加和死亡率作为结果参数，计算每个时间段的饲料转化率。
调查研究的兽医产品(IVP)-IRP001
表10剂量率研究的IVP和对照
名称
组成
剂量水平(g/kg)
IRP001
100％IRP001
1.0、0.3和0.1
沙利霉素
工业标准
60ppm
沙利霉素+杆菌肽锌
工业标准
60ppm+50ppm
表11治疗和攻击方案
表12事件时间表
IRP0001的残留水平可以通过以下实验确定：
安乐死后从每只禽切除胸脯，小腿和大腿以及肝脏和肾脏的肌肉样品，将已知重量的组织(约1g)在2mL水中匀浆。离心样品并移出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析IRP001，以提供肌肉组织中小檗碱的残留水平(每g肌肉组织中小檗碱的ng)。
残留研究
这项研究和方案旨在通过对在整个生产周期内通过饲料喂食而治疗的肉用仔鸡小鸡中的标志物组织残留进行定量，来确定以最大标签剂量率施用的天然存在的IVP的残留消耗状况(depletion profile)。
背景
抗微生物药被广泛用于畜牧业，以控制和预防密集化畜牧业中潜在的致命疾病暴发。有人认为这是产生抗性微生物的原因，政府监管机构现在正在实施控制这些抗微生物剂的使用的指令。
发明人已经鉴定出几种天然存在的化合物，它们可以用作天然抗生素，以代替目前用于食物生产动物如家禽和猪中使用的抗生素。
候选制剂经过测试以符合监管标准，如例如按照澳大利亚农药和兽药管理局(APVMA)和美国食物药物监督管理局(FDA)要求的监管标准。在此方面，确定动物保健治疗的残留消耗状况是产品开发过程中必不可少的部分。这使政府监管部门可以设置适当的保留期(with-holding period)(WHP)，以保护人类健康和农产品贸易。
IRP001已被选为候选IVP，因为它已被确定为安全且无毒。由于鸡业广泛依赖抗微生物药来预防或治疗由肠病原体引起的多种疾病，因此已将家禽选为目标动物物种。这些临床上重要的肠病原体可能对IRP001有潜在反应。
合规
应当根据议定的方案使用SOP和良好的科学实践进行这个组织残留消耗研究。
研究设计
a.实验单位：实验单位和观察单位均为动物，统计单位为治疗组。
b.动物模型：将饲料摄入量，每天的水摄入量，体重变化，死亡率和组织中的标志物残留用作结果参数。
c.纳入标准：如果动物符合以下第10节中概述的标准，则将选择所述动物进行研究。
d.排除和移除标准：调查者认为收到后虚弱、患有疾病、受伤或因其他原因不适合纳入研究的动物将被排除在外。
选择后，只有得到发起人或调查者的书面同意，才将可能被认为不适合继续进行研究的动物移出。任何移出的原因将在原始数据和研究报告中得到充分记录和证明。被从研究中移出的动物将得到适当的兽医护理。
e.分配：肉用仔鸡小鸡：在收到后，将符合纳入标准的一百八十(180)只肉用仔鸡小鸡在从运输容器中被取出后、依次分配到十八(18)个单独的治疗组中，每组十(10)只禽。分配和随机化的方法将在原始数据和研究报告中进行描述。
f.盲化：不适用。
调查研究的兽医产品(IVP)
记录所有制剂细节，包括批号，有效期，收到和使用。
a.调查研究的兽医产品：IRP001 Cl作为100％IRP001 Cl。
b.来源：IVP将由发起人提供。
c.储存：IVP应在环境温度下在指定温度区域内储存。记录IVP的储存位置和条件。
d.安全性：发起人提供了SDS或其同等物(如果有)。
e.分析：为IVP提供了分析证书(如果有)。
f.药物处置：记录所有剩余IVP的处置。
治疗
a.剂量计算：剂量基于饲料中IRP001 Cl的固定浓度(0.03或0.1g/kg IRP001Cl)。
b.剂量制备：将粉末状IRP001 Cl并入市售饲料原料成分，然后在例如“混凝土混合器”型设备中充分混合，以提供所概述的饲料中最终浓度。
c.剂量施用方法：根据下表1中详细列出的治疗方案对研究动物进行给药。在相关治疗中，应无限制地向鸡提供含药饲料，作为其唯一的饲料来源。
表13治疗方案-饲料转化率
＊安乐死
＊＊注意：含药饲料在第28天从第6组和第12组撤出，以允许这些组有14天的清除期。
事件时间表
表1***时间表
测试系统
动物详细信息记录在原始数据中。即：物种，肉用仔鸡小鸡；数量，180；来源，商业的(一批90只)；年龄，一日龄。
动物管理
a.动物福利：对研究动物进行类似管理，并适当考虑其福利。根据动物伦理委员会(AEC)的要求观察研究动物，并完成“动物照管记录”。
b.健康管理：如有必要，应尽快进行任何常规的预防性治疗并记录下来(产品名称，批号，有效期，剂量，施用途径和日期)。
从第0天开始，在合适的位置根据标准操作规程(SOP)每天两次观察研究动物。记录任何需要进一步检查的健康问题。
所有健康问题和不良事件必须在一个工作日内报告给调查者。调查者认为与产品相关、导致死亡、危及生命、涉及大量动物或人类不良事件的任何不良事件，都必须记录并在一个工作日内报告给发起人和AEC。
可以执行常规兽医护理和程序，并在原始数据中进行描述。出于标准管理实践和人道原因，可以在调查者和发起人(如果相关)事先批准的情况下，并用药物疗法。没有施用类似于IVP的治疗。记录所有并用药物疗法，以提供所用材料的标识(产品名称，批号和有效期)，动物ID，使用原因，施用途径，施用的剂量和日期，并包括在原始数据(试验日志)和研究报告中。
如果受伤或疾病导致研究动物安乐死或死亡，应对此进行记录并在可能的情况下由兽医进行验尸。原始数据中包括“验尸报告”，包括可能的死亡原因。
研究报告中包括所有健康问题，不良事件和动物死亡率，包括它们与治疗的关系。
c.畜舍环境：治疗组将鸡饲养在经过批准的动物设施内的两个单独且离散的受控环境房间中的专用的鸡地面畜舍。一个房间可容纳第13至18组(含第13组和第18组)的所有未用药的禽，第二个房间可容纳第1至12组(含第1组和第12组)的所有用药的禽。每个畜舍的地面空间为约1.5m2。根据正常的商业惯例，将鸡在垫料上饲养。
到第49天为止，共有18个地面畜舍，每个畜舍有10只鸡。研究结束时，每个畜舍的最大鸡体重都远低于澳大利亚实用标准中建议的肉用小鸡最大值40kg/m2。
注意-第13至18组(含第13组和第18组)的禽(未治疗的对照动物)与药物治疗的第1至12组禽保持在相似但物理分离的隔离室中，从而确保研究期间无交叉污染。
d.实验饮食：在整个研究过程中，施用配制的商业育雏期(starter)配给量然后育成期(grower)配给量。原始数据中包含显示饲料成分的饲料袋标签或同等物的副本。
e.饲料和水摄入量：称重并记录每天添加的饲料，并计算每天的饲料摄入量(按治疗组)。测量并记录每天的水体积，并计算每天的水摄入量(按治疗组)。
f.动物处置：根据AEC的批准，对研究动物进行人道安乐死，并按照事件时间表中列出的间隔进行记录(表14)。
研究程序
a.试验日志：记录研究期间所有计划的和计划外的事件。
效果评估
a.体重：在第0天(组体重)和第7、14、21、28和35天称重鸡-记录各个动物的体重。在称重前后，使用校准的测试砝码检查称重秤并记录。将研究终止时的体重在各组之间进行比较，以确定治疗效果(如果有)。
b.检查：在总体病理学和组织收集时，对安乐死进行了单独的临床检查。记录临床检查。可以适当记录数字静态图像。
c.观察结果：每天两次检查禽的总体健康状况，通常是在早上8点之前和下午4点之后。因此，两次观察之间的典型间隔是白天9小时，过夜15小时。如果调查者认为显著患有异常临床症状(例如明显的衰弱且恢复可能性较低)，则记录显示异常临床症状的禽，对其仔细观察并对其实施安乐死。
d.尸检检查：在第35至49天之间，按照时间表-表14对所有禽实施安乐死和尸检。
e.总体病理学：对来自所有第1至18组的所有禽进行尸检并检查总体视觉病理学变化，这些变化被适当描述和评分(按个体禽)。
f.组织残留分析：按照时间表、表1，从每组(第1至18组(包含第1组和第18组))中六只(6)最重的禽收集肝脏、肾脏、胸脯肌肉(1)、腿部肌肉(2)[大腿上部和下部]和具有完整脂肪的全部的皮肤的双份代表性样品，并将其冷冻储存(<10摄氏度)，用于随后的标志物残留分析。在第35天将第13至18组的禽作为未治疗的对照禽处死，并收集组织以满足组织测定(tissue assay)要求。
样品将用不干胶标签标记，所述标签列出研究编号，动物ID，时间点，日期，样品类型和重复样品(replicate)。
为了进行残留分析，将样品融化，然后将已知重量的组织(约1g)在2ml水中匀浆。离心样品，并取出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析。
表15分析矩阵
g.样品的储存，转移和处置：记录样品的储存，转移和处置。将重复样品1组织样品在第10节中概述的时间在湿冰上冷冻运输到分析实验室。根据标准操作规程(SOP)，将样品与随附的温度数据记录仪和冷冻水瓶一起转移。在最后一个样品收集时间点之后，将重复样品2组织样品冷冻储存6个月的期间。超出这一点，根据研究现场的决定可将其丢弃，除非发起人代表明确要求不这样做。
统计分析
方法记录在研究报告中。
数据记录
方案规范将取代设施SOP。可以在研究过程中根据需要添加或修改研究表格，而无需进行方案修订或偏离。
a.方案批准：研究开始之前，方案由所有相关人员批准并签署(请参阅第1页)。
b.修改/偏离：修改是在执行更改或修改的任务之前对方案进行的更改或修改。修改必须说明更改的原因，并有书面记录的发起人授权。该修改必须由调查者和发起人签署。
在确定偏离时，调查者应记录、签署相对于本方案或适用的SOP的偏离和注明日期。将评估对研究的整体结果或完整性的影响。必须在切实可行的范围内尽快将偏离告知发起人。
相应地记录所有方案的修改和偏离，并根据发生的日期或识别的日期顺序编号。
c.文件注释：对文件注释进行了相应记录，以澄清否则从原始数据来看可能不明显的事件或情况。必须在切实可行的范围内尽快将文件注释告知发起人。
d.研究人员的变更：研究调查者或其他负责任研究人员的变更应相应记录。
e.原始数据：所有起始原始数据页均由进行观察的人员和记录信息的人员进行分页，用研究编号标识并签名并注明日期。
f.通讯日志：调查者保留与研究相关的所有信件的副本。记录会导致研究文档编制、设计、进行或研究报告发生变化的任何电话交谈。
g.许可：本方案中详细介绍的研究应包含在政府机构许可(例如APVMA小试验许可)中。
研究报告
研究报告由调查者或指定人员准备。包括测量的每个变量的数据清单。研究调查者的合规声明包含在研究报告中。附有原始数据和统计报告的原始签名研究报告将提交给发起人并存档。
沙门氏菌和弯曲杆菌的研究
本公开内容内容还预期预防或治疗由沙门氏菌或弯曲杆菌引起的传染病。以下描述用于研究小檗碱生物碱或小檗碱生物碱组合物在预防或治疗沙门氏菌或弯曲杆菌感染引起的疾病中的有效性的研究。这些研究以已发布的方案为模型：Alali，W.Q等人“Effectof essential oil compound on shedding and colonization of Salmonella entericserovar heidelberg in broilers”,Poultry Science,2013,92:836-841；Berghaus,R.等人“Enumeration of Salmonella and Campylobacter in environmental farm samplesand processing plant carcass rinses from commercial broiler chicken flocks”,Appl.Environ.Microbiol.2013,1-37；Cochran,W.G.,和G.M.Cox,Experimental Design.第二版John Wiley&Sons,New York,NY.第582-583页,1992(Cochran和Cox,1992)。
沙门氏菌研究
这项研究的目的是评估IVP作为控制肉用仔鸡禽类中海德堡沙门氏菌(Salmonella heidelberg)的一种手段的有效性。
实验设计
在这项十二(12)个畜舍的研究中，将六百(600)只小鸡分配到三(3)个治疗组中，每组有四(4)个重复区组(replicate block)，并分为每个畜舍五十(50)只禽。
使用随机完整区组设计将治疗组分配给畜舍(Cochran和Cox，1992)。治疗组如下：
1.无治疗–海德堡沙门氏菌攻击对照
2.治疗1-海德堡沙门氏菌攻击
3.治疗2-海德堡沙门氏菌攻击
该研究从放置禽(孵化日；DOT 0)开始，此时将禽分配给实验畜舍。仅将呈现健康的禽分配给研究用途，并记录所有未分配禽的最终数量和处置。在研究过程中，不会更换任何禽。在研究开始(DOT0)，DOT 35和结束(DOT 42)时记录畜舍的禽重量(kg)。
材料和方法
禽。获得了六百(600)只孵化日的Ross x Ross直孵(straight-run)肉用仔鸡小鸡。禽接受常规疫苗接种(HVTSB1)，并记录种鸡群数量信息。所有禽都以推荐剂量接种了商业球虫病疫苗。
畜舍和环境控制。在研究开始时，将在经过改良的具有坚固侧面和泥土地面的常规禽舍中，将五十(50)只肉用仔鸡小鸡分配到十二(12)个地面畜舍，其畜舍的尺寸为5x 10(1.00ft2/禽放养密度)。该设施采用风扇冷却。恒温控制燃气加热器是主要的热源。辅助加热灯(每个畜舍一[1]个灯)提供热量(需要时)。根据主要饲养员的建议，在环境湿度下饲养禽，并为其提供照明程序。放置时，每个畜舍包含大约四(4)英寸的新鲜松木屑。在研究过程中不更换垫料。每个畜舍包含一(1)个管投饲机和一(1)个钟形饮水器，从而形成五十(50)只禽/投饲机和饮水器的比例。
施用和饮水方法.无限制的.
饮食。施用的配给量如下：育雏期DOT 0到DOT 14，育成期DOT 14到DOT 35，以及育肥期DOT 35到DOT42。饮食以碎裂料(育雏期饲料)或粒料(育成期和育肥期饲料)的形式施用。这项研究的饲料制剂包括未加药的商业型肉用仔鸡育雏期、育成期和育肥期饮食，混合有适当的饲料，经计算分析可达到或超过NRC标准，除非明确规定要作为治疗方案的组成部分，否则不在任何饲料中添加抗生素。实验治疗饲料是从基础育雏期饲料制备的，所有基础饲料和用于制备治疗批次的测试物品的数量均已记录。为了确保所有测试物品的均匀分布，将治疗的饲料混合并在80℃的加利福尼亚制粒机中制粒(记录制粒温度)。混合完成后，将饲料分配到指定治疗组的畜舍中。将测试物品储存在SPRG气候控制储存区中。所有饮食，制剂和其他饲料信息被记录。
饲料变更。禽类从DOT 0到DOT 42接受适合的治疗的饲料。在DOT 14将配给量从育雏期更改为育成期，在DOT 35将配给量从育成期更改为育肥期。在那时，所有先前的饲料从每个畜舍移除，分别称重并替换为育肥期饲料。在DOT 42，将所有未消耗的育肥期饲料从畜舍上取下，分别称重并丢弃。
沙门氏菌接种。在DOT 0，每个畜舍的二十五(25)只小鸡(50％播种者)被标记，颜色编码(用于鉴定)，并经口给药(通过管饲法)107CFU抗萘啶酸的海德堡沙门氏菌。
沙门氏菌采样。从所有畜舍DOT 14和DOT 42收集Bootsocks拭子(bootsock swab)样品以测定沙门氏菌的环境污染。在完成每个拭子之间更换手套以减少潜在的样品交叉污染。从无菌袋中取出预先弄湿的Bootsock拭子(Solar Biologicals，Inc.，目录号BT SW-001)，放到用干净的新塑料靴子覆盖的脚上，在畜舍的周边和内部走动，取出Bootsock，然后将其放入标有畜舍号的无菌袋中。对每个畜舍重复该过程后，样品被适当地储存，然后提交以用于沙门氏菌分析。
盲肠沙门氏菌培养。在DOT 42完成盲肠采样。在DOT 42上，从每个畜舍中取出十(10)只水平暴露(未标记)的禽，对其进行安乐死(通过颈脱位法)，并无菌取出每只禽的盲肠。取出盲肠样品后，将其放入一(1)个无菌塑料样品袋(Fisher Scientific)中，贴上标签，储存在冰上，并提交以用于沙门氏菌分析。
沙门氏菌的分离和鉴定。所有提交的用于沙门氏菌分离和鉴定的样品(bootsock拭子和/或盲肠)在分析之前都在无菌Whirl Pack袋中的冰上储存。到达后，将四硫代硫酸盐(tetrothionate)肉汤加到Bootsock拭子样品中，同时称重盲肠，加入无菌盐水，将样品均质化(stomachered)。取出一(1)mL等分试样用于MPN分析，添加10X四硫代硫酸盐肉汤(Difco)溶液，并将样品在41.5℃孵育过夜。将一圈样品敲入木糖赖氨酸tergitol-4琼脂(XLT-4，Difco)平板上，将其在37℃孵育过夜。使用Poly-O沙门氏菌特异性抗血清(MiraVista，印第安纳波利斯，印第安纳州(Indianapolis,IN))，选择最多3个(三个)黑色菌落并确认为沙门氏菌阳性。(Berghaus等，2013；Alali等，2013)
沙门氏菌计数程序(MPN方法)。对于所有十(10)个水平暴露(未标记)和五(5)个直接攻击(标记)样品，将一(1)ml均质化的(stomachered)蛋白胨肉汤样品转移至96孔两(2)ml深模块(block)的第一行中的三(3)个相邻孔中。将0.1ml等分试样的样品转移至第二行0.9ml的四硫代硫酸盐肉汤中，对剩余各行重复上述程序(以产生五(5)个十倍的稀释液)，并孵育模块(在42℃持续24小时)(表16)。用针工具复制器将每个孔的一(1)μl转移到XLT-4琼脂(含萘啶酸)上，孵育平板(在37℃持续24小时)，记录每个样品的最终稀释度，并输入MPN计算器(确定样品MPN)。可疑沙门氏菌分离菌株已通过Poly-O沙门氏菌特异性抗血清(MiraVista，印第安纳波利斯，印第安纳州(Indianapolis,IN))确认。(Berghaus等，2013；Alali等，2013)。
表16沙门氏菌计数
疾病和球虫病控制。所有禽在一(1)日龄时通过喷雾柜接种美国农业部(USDA)批准的球虫疫苗。在研究期间不使用任何伴随药物疗法。为了防止交叉污染，进入畜舍时要穿塑料一次性靴子，并在每个畜舍之间进行更换。
禽的识别。畜舍是度量单位。畜舍的安全性将防止禽迁徙。
监测。监测所有禽类的总体鸡群(flock)状况，温度，光照，水，饲料，垫料状况以及意外的鸡舍状况/事件。在正常工作时间内每天两次记录发现的结果(在最后研究天记录一[1]个观察)。在星期六，星期日和观察到的假期中记录一(1)个观察。
死亡率。每天检查畜舍的死亡率。淘汰禽只是为了减轻痛苦。记录任何被淘汰(或发现死亡)的禽的日期和移出体重(kg)，对所有被淘汰(或死亡)的禽进行尸检，并记录以下信息：性别和可能的死亡原因。
禽和饲料处置。所有禽，死亡率和剩余饲料(包括混合器冲洗物(mixer flushes))均通过适当的伦理方法进行处置。
源数据控制和处理。数据用擦洗不掉的墨水记录，并带有清晰的条目，每个源数据表都经过签名(或初始化)，并通过单独的记录条目注明日期。所有源数据错误(和/或更改)均已初始化，注明日期，并在表格上直接编写了简短的解释性声明或错误代码。
数据管理。进行体重增加，饲料消耗，饲料转化和沙门氏菌结果的数据管理和统计分析。
事件日历
表17沙门氏菌研究事件日历
弯曲杆菌研究
这项研究是为了确定调查研究的兽医产品(IVP)减少空肠弯曲杆菌在肉用仔鸡盲肠中脱落(shed)(水平传播)和定殖的功效。
实验设计
收到一百二十(120)只日龄(非SPF)的商品肉用仔鸡。五(5)只禽通过颈脱位法而被安乐死，并为空肠弯曲杆菌培养其盲肠。剩余选定的一百零五(105)只禽在一个隔离室中随机分为三(3)组，该隔离室又分为三份，每组有35只禽。实验变量如下所示。给所有禽施用肉用仔鸡开始碎裂料饲料，并按以下规定进行治疗。
房间数量-1个分为3个禽空间
小鸡总数-120
立即被安乐死的小鸡数量-05
可再分为治疗组的禽数-105个治疗组-3
重复区组–N/A
每个房细分的禽-35
治疗组
1.没有治疗-空肠弯曲杆菌攻击
2.治疗1-空肠弯曲杆菌攻击
3.治疗2-空肠弯曲杆菌攻击
材料和方法
禽。获得了一百一十(110)只孵化日的Ross 708雄性肉用仔鸡小鸡。对禽进行性别鉴定，使其接受常规疫苗接种(HVTSB1)，并记录种鸡群数量信息。根据制造商的建议，禽在一(1)日龄的时候接受一(1)剂量商业批准的球虫疫苗。
畜舍和环境控制。在研究开始时，将一百零五(105)只孵化日的Ross 708雄性肉仔鸡小鸡分配到一(1)个隔离房间中。房间被细分为三(3)个相等的禽空间。每个空间三十五(35)只小鸡放置在每个房间中。每个房间的尺寸为13.4’x 15.7’(约2.0英尺2的放养密度)。隔离房间的环境由独立的HEPA过滤系统和带有一(1)个加热灯的加热泵单元控制，该加热灯在育雏过程中提供补充热量。禽在环境湿度下饲养。放置时，每个畜舍包含约四(4)英寸的窑干袋装新鲜松木屑。在本研究过程中不更换垫料。每个空间包含一(1)个管投饲机和一(1)个钟形饮水器(35禽/投饲机与饮水器的比率)。每天为禽提供光照二十四(24)小时。
施用和饮水方法。无限制的。
饮食。在整个研究过程中，给禽喂食肉用仔鸡育雏期饮食。未加药的商业型肉用仔鸡育雏期饮食与适当的饲料混合，经计算分析可达到或超过NRC标准，除非明确规定要作为治疗方案的组成部分，否则不在任何饲料中添加抗生素。饲料是从基础育雏期饲料制备的。混合完成后，将饲料分配到指定治疗组的畜舍中。测试物品储存在气候控制区域。所有饮食，制剂和饲料都有文件记录。
饲料变更。禽从DOT 0到DOT 35接受育雏期饲料。
空肠弯曲杆菌的施用方法：在DOT 14，每治疗35只禽口服管饲0.1ml空肠弯曲杆菌JB菌株肉汤，其中含有约106CFU/ml(小鸡剂量为约105CFU/ml)。
弯曲杆菌定殖评价：在DOT 0，培养五(5)只禽以用于空肠弯曲杆菌的患病率；DOT35，每次治疗通过颈脱位法安乐死三十三(33)只禽。无菌取出每只禽的盲肠，并将其放入无菌塑料采样袋(Fisher Scientific)中以用于弯曲杆菌分离分析。在弯曲杆菌分析之前，将所有样品储存在冰上。
弯曲杆菌计数程序：弯曲杆菌计数程序(直接计数)。对于每个样品，将一(1)ml匀浆化的Bolton肉汤样品转移到96孔两(2)ml深模块的第一行中的三(3)个相邻孔中。将0.1ml的等分试样转移至第二行的0.9ml的Bolton肉汤中，对剩余的行重复该程序(产生十二(12)个十倍的稀释液)，然后将每个孔中的0.1ml摊铺到Campy Cefex琼脂上(表18)。在弯曲杆菌气体存在下，将平板孵育(42℃持续24小时)，记录每个样品的最终稀释度。可疑弯曲杆菌分离菌株通过革兰氏染色证实。
表18弯曲杆菌计数
疾病控制。在研究期间将不使用任何伴随药物疗法。为防止交叉污染，进入房间时要穿一次性塑料靴子，并在每个房间之间更换。
禽的识别。畜舍是度量单位。畜舍的安全性将防止禽迁徙。
监测。监测所有禽类的总体鸡群状况，温度，光照，水，饲料，垫料状况以及意外的鸡舍状况/事件。在正常工作时间内每天两次记录发现的结果(在第35天记录一[1]个观察)。在星期六，星期日和观察到的假期中记录一(1)个观察。
死亡率。每天检查房间的死亡率。淘汰禽只是为了减轻痛苦。记录任何被淘汰(或发现死亡)的禽的日期和移出体重(kg)，对所有被淘汰(或死亡)的禽进行尸检，并记录以下信息：性别和可能的死亡原因。
禽和饲料处置。所有禽，死亡率和剩余饲料(包括混合器冲洗物(mixer flushes))均通过适当的伦理方法进行处置。
源数据控制和处理。数据用擦洗不掉的墨水记录，并带有清晰的条目，每个源数据表都经过签名(或初始化)，并通过单独的记录条目注明日期。所有源数据错误(和/或更改)均已初始化，注明日期，并在表格上直接编写了简短的解释性声明或错误代码。
数据管理。进行体重增加，饲料消耗，饲料转化和弯曲杆菌结果的数据管理和统计分析。
事件日历
表19弯曲杆菌事件日历
实施例
坏死性肠炎
坏死性肠炎是在诸如家禽的食物生产动物中发现的肠道感染。最早由Parish于1961年描述，是在家禽中由细菌产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引起的，可表现为急性临床疾病或亚临床疾病。尽管产气荚膜梭菌被认为是坏死性肠炎的病原体，但通常还需要其他促成因素使动物容易患病。公认的是，坏死性肠炎是一种多因素疾病过程，具有许多风险因素，包括艾美球虫属感染，去除抗生素生长促进剂，环境和管理条件，生理压力和免疫抑制，以及饮食的性质和形式。
坏死性肠炎是一种潜在的致命疾病，在饲养期间的最后几周内，连续几天可导致每天至多1％的群死亡率，累计总死亡率上升到30-50％。在亚临床形式中，对肠粘膜的损害导致减少的消化和吸收，减少的体重增加和增加的饲料转化率，从而导致商业性能下降。据报道，正是这种疾病的表现在家禽生产行业造成了最大的经济损失。此外，家禽中的产气荚膜梭菌具有通过食物链传播给人类的风险，其中产气荚膜梭菌是人类食物传播疾病暴发中经常分离的细菌病原体之一。
坏死性肠炎以前是由著名的抗菌药物如维吉霉素(virginiamycin)，杆菌肽等控制的。越来越多的国家禁止在食物生产动物中使用抗生素，导致坏死性肠炎的出现对动物和公共健康构成了严重威胁。
产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，存在于土壤，灰尘，粪便，饲料，家禽垫料和肠内容物中。它是极端多产的，能够产生各种毒素和酶。基于四种毒素(α，β，ε和ι)的产生，产气荚膜梭菌菌株被分类为五种毒素型(A，B，C，D和E)。已经提出坏死性肠炎是由A型引起的，在较小程度上由C型引起的，其中A型菌株产生染色体编码的α毒素，而C型菌株产生α毒素以及β毒素。
α毒素是一种磷脂酶C鞘磷脂酶，它水解磷脂并促进膜的组织解体，诱导诸如白三烯、血栓烷、血小板凝集因子和前列环素的介质的合成。这些介质导致血管收缩，血小板聚集和心肌功能障碍，导致急性死亡。β毒素诱导肠黏膜出血性坏死，虽然确切的机制尚不清楚。坏死性肠炎的病理学正在重新评估，同时正在寻找其他毒力因子。最近，有证据表明，α毒素可能在已经提出的坏死性肠炎的发病机理中没有主要作用，研究报告称使用非野生型α毒素使得导致该疾病的能力受损。证据表明，产气荚膜梭菌培养物上清液中的分子注入肠后，重现疾病样病理。最近的证据还表明，来自产气荚膜梭菌的NetB毒素可能在坏死性肠炎的发病机理中起着关键作用。
产气荚膜梭菌以低水平自然存在于肠道中，但正常肠微生物区系的紊乱可能导致该细菌快速增殖，从而导致坏死性肠炎的发展。鸡最通常在2至6周龄时受到感染，但是坏死性肠炎可能会在7至16周龄或甚至至多6个月的禽中发生。
该疾病的临床特征是鸡群死亡率突然增加，通常没有先兆，尽管湿垫料有时是一个早期指标。临床症状可能包括衰弱，脱水，嗜睡，羽毛褶皱，腹泻和饲料消耗减少，尽管死亡前的临床疾病持续时间很短，所以体重增加的减少并不明显。小肠可见肉眼可见的病变。十二指肠，空肠和回肠变得薄壁，易碎，膨胀并充满气体。另外，粘膜表面覆盖着灰棕色至黄绿色的两性膜或假膜。在其他器官以及红细胞和粘液囊的萎缩中也可能发现病变。坏死性肠炎的亚临床形式相当难以识别，对抗生素类似物治疗有反应的病禽通常被认为患有该病。尽管湿垫料并不总是起源于梭菌，但湿垫料通常会促使家禽养殖场立即采取抗生素治疗。另外，在亚临床坏死性肠炎中报告了肠粘膜轻度坏死。实施例1描述了小檗碱硫酸盐(IRP001硫酸盐)在预防或治疗坏死性肠炎中的用途。
实施例1
一项先导研究，旨在利用经过验证的实验模型，确定IRP001硫酸盐在预防(口服，通过饲料)和治疗(口服，通过饮用水)施用给无特定病原体鸡时的剂量反应、功效和安全性，所述鸡经过人工采用产气荚膜梭菌攻击。
材料和方法
研究设计(坏死性肠炎攻击)–隔离器中饲养的商品肉用仔鸡小鸡在9日龄时被1mL的1％(w/v)无菌盐水中的巨型艾美球虫和堆型艾美球虫(E.acervuline)各个5,000个减毒的疫苗菌株孢子形成的卵囊以及布氏艾美球虫2500个孢子形成的卵囊口服感染。
在卵囊攻击后五天和六天(第14和15天)，施用了已知的致病性产气荚膜梭菌菌株(A型菌株EHE-NE36，CSIRO Livestock Industries，Geelong，Australia)，i.t.(
调查研究的兽医产品(IVP)-IRP001小檗碱半硫酸盐(IRP001硫酸盐)
表20攻击和治疗方案
表21事件时间表
结果
表22中位数病变得分的总结数据
表23尸检前肉用仔鸡死亡率
相对于无治疗组和用在水中0.1g/L或在饲料中0.2g/kg治疗组，引入在水中1.0g/L或在饲料中2.0g/kg的IRP001硫酸盐导致NE攻击的肉用仔鸡的死亡率显著降低(见图5)。无治疗、0.1g/L水和0.2g/kg在饲料中组的死亡率与NE攻击的肉用仔鸡的死亡率无显著差异。
发病率也降低了。相对于在接受NE攻击的肉用仔鸡中、无治疗组，引入在水中1.0g/L或在饲料中2.0g/kg的IRP001硫酸盐导致小肠病变得分显著降低(参见图6到12)。相反的是，相对于NE攻击的肉用仔鸡中无治疗，引入在水中0.1g/L或在饲料中0.2g/kg的IRP001没有导致中位数病变得分降低。
实施例2
一项后续研究，用于确定在饲料中或在水中提供给肉用仔鸡小鸡的IRP001半硫酸盐(未掩蔽的)的单一制剂的并入后的饲料的适口性，饲料和水的消耗以及禽生产力。该研究探讨了治疗开始日期方面的最佳治疗方案。
材料与方法
研究设计
阶段1：在收到后，在第0天，依次将两百七十(270)只日龄的商品肉用仔鸡小鸡分配为由十六(16)个只单独的地面畜舍接收所述小鸡，每个畜舍16或17只禽。
阶段2：在收到后，在第22天，依次将九十(90)只日龄的商品肉用仔鸡小鸡分配为由四(4)个单独的地面畜舍接收所述小鸡，每个畜舍22或23只禽。
饲料摄入量，水摄入量，体重增加和死亡率被用作结果参数。
调查研究的兽医产品(IVP)
表24实施例2的IVP
表25阶段1–第0天的日龄小鸡
表26阶段2–第22天接受的日龄小鸡
组
制剂
IVP浓度在饲料中(g/kg)
IVP浓度在水中(g/L)
治疗天数
处死天
17
无
-
-
-
42
18
无
-
-
-
42
19
IVP
2
-
25-42
42
20
IVP
2
-
25-42
42
表27事件时间表
结果
使用每天给每个畜舍提供的饲料和水总量的数字除以每个畜舍中的禽的数量，计算出阶段1和阶段2(以及在组/畜舍2、15和16继续两个阶段的禽类的整个试验)的个体每天的饲料摄入量和个体每天的水摄入量数据(按畜舍，然后按治疗组)。如果称重、施用/饮水或记录(或其他无法解释的饲料和水的损失)中发生错误，则使用在明显误差的任一侧的1-2天的相同的畜舍平均值来校正平均值。同样，阶段1的组平均体重是使用第0天的总体重/禽总数和第7、14、21、28、35和42天的个体体重计算得出的。计算消耗的总(个体)饲料/治疗，并使用以下表达式计算饲料转化率/治疗：总(个体)饲料/总(个体)体重增加。
使用下述线性模型和Tibco SPOTFIRE S+8.2(2010)，针对每个阶段内的治疗以及两个阶段的畜舍2和15/16之间，对个体每天的饲料摄入量和个体每天的水摄入量进行统计比较：
(参数)
模型中包括“天”以允许随时间的变化，“畜舍”作为每次治疗均由2个畜舍组成，而交互项“治疗：天”被包括在内以允许治疗x时间的效果。通过检查残差图来确认模型的适用性；在所有情况下，统计模型都是合适的。
阶段1：
表28阶段1汇总数据
饲料摄入量：“治疗”是显著的，“天”是高度显著的，“畜舍”是不显著的。但是，在治疗的个体成对比较中，未观察到显著差异(p<0.05)。
水摄入量：“治疗”是显著的，“天”是高度显著的。治疗的成对比较数量是显著的，但结果不是结论性的。似乎确实存在中等趋势，即接受较长时期试验治疗(在饮用水中未掩蔽的)的组比治疗较短时期的组和未治疗的对照组饮用更少的水(见图13)。
体重“治疗”是显著的，“天”是高度显著的，“畜舍”是不显著的。但是，在治疗的个体成对比较中，未观察到显著差异(p<0.05)。
在阶段1中，尽管治疗的禽倾向于饮用更少的水，但在不同时期内通过饮用水进行的未掩蔽的治疗似乎不影响饲料摄入量或体重。
阶段2：
表29阶段2汇总数据
饲料摄入量：“治疗”和“畜舍”不是显著的，而“天”是高度显著的。但是，对于两种治疗的成对比较，没有观察到显著差异(p<0.05)。
水摄入量：“治疗”是高度显著的，“天”是高度显著的。对于两种治疗的成对比较，观察到了显著差异，其中治疗的禽(接受在饲料中的治疗的禽)饮用更多水(参见图14)。
体重：“治疗”和“畜舍”并不显著(尽管如预期的“天”是显著的)，对于两种治疗的成对比较，未观察到显著差异(p<0.05)。
在第2阶段的治疗(在饲料中)中似乎没有影响饲料摄入量或体重，而治疗的禽倾向于饮用更多的水(与阶段1相反，其中当在饮水中应用未掩蔽的治疗时，禽倾向于饮用更少的水)。
阶段1+2(未治疗的组-畜舍2vs 15/16，在水中治疗第6-42天)：
饲料摄入量：虽然总体模型中的“治疗”不是显著的(“天”是高度显著的)，但对于两种治疗的成对比较，却存在显著差异(p<0.05)，其中未治疗的禽在整个试验中食用～0.14kg更多的饲料。
水摄入量：“治疗”是高度显著的，“天”是高度显著的。对于两种治疗的成对比较，观察到显著差异(p<0.05)，其中在整个实验中未治疗的禽比未治疗的禽饮用更多的水。
体重：虽然模型中“治疗”是显著的(和如预期的“天”是高度显著的)，但对于两种治疗的成对比较，没有观察到显著差异(p<0.05)。
当通过饲料转化率考虑显著较高饲料摄入量和相似(无显著不同)体重的组合时，相对于无治疗，历经6-42天的治疗似乎具有中等优势(见图15)。治疗的禽消耗了3.84kg饲料，增加了2.35kg(1.6kg饲料的FCR：增加1kg)，而未治疗的禽消耗了4.17kg的饲料，增重了2.14kg(1.95kg饲料的FCR：增重1kg)。
实施例3
为了评估三种剂量率的饲料中IVP小檗碱氯化物对抗商品肉用小鸡中的混合中度球虫病攻击的效果，并评估坏死性肠炎或非特异性肠炎的任何发生。该研究为肉用仔鸡小鸡的IVP最有可能的有效剂量率提供了一个范围界定项目，并评估了与行业标准相比在控制球虫病和随后的坏死性肠炎中可能取得的成功。
材料与方法
获得了球虫卵囊的场地样品(来自肉用仔鸡和蛋鸡来源的艾美球虫属的种)，将其运到实验室，在所述实验室中使其进行过滤，孢子形成，消毒和储存。然后通过PCR鉴定存在的艾美球虫属的种并计数卵囊。这些通过首次用于实验的小鸡进行繁殖，以产生足以满足播种者禽的攻击接种的数量。从商业孵化场获得30只1日龄的肉用小鸡，将它们放在试验设施的养鸡房孵化室笼中，每笼10只小鸡。给它们施用不含药配给量，在第7天，通过管饲法施用孢子形成的卵囊。在第13天，对家禽实施安乐死并移出它们的肠道。分离上部和下部小肠和盲肠，将其放入2％重铬酸钾中，于4℃放置3-5天，然后刮擦以去除粘膜。将其通过粗筛进入新鲜的重铬酸钾溶液中。在其中使卵囊形成孢子，在显微镜下进行检查并计数，并通过PCR鉴定物种。
从商业孵化场中获得一千一百八十(1180)只1日龄的Ross 308小鸡，所述小鸡在孵化场接种了针对传染性支气管炎和新城疫的疫苗。将这些小鸡运到试验设施并随机分入30个地面畜舍，每个畜舍放置36只小鸡(图18)。通过分隔器将畜舍减小到正常尺寸的一半，每个畜舍提供3.5m2的地面空间，目的是提供大约30kg/m2的最终禽密度。另外两个全尺寸的畜舍每个畜舍放置了50只禽(这些用作球虫病攻击的播种者)。
饲料基于合适的平衡基础配给量制剂(育雏期、育成期和育肥期)。将产品按如下方式添加到每种基础配给量中(表30)。
表30治疗组/饲料
以随机的完全区组为基础将饲料分配给畜舍。如下为每个畜舍提供饲料：0.7kg每禽育雏期饲料(约第0-14天)，1.2kg每禽育成期饲料(约第15-28天)和之后的育肥期饲料直至终止(第42天)。播种者禽畜舍获得了1号配给量(不含药)。
在第6天，使用步进式移液管通过单独管饲法为播种者畜舍中的禽提供卵囊接种(每只禽约0.5mL)。使用了三个来自不同养鸡场的孢子形成的卵囊样品，将其给予每个播种者畜舍中的禽的约三分之一。在第12天，第13天和第14天使播种者畜舍中的垫料轻微倾斜。在第14天，收集播种者畜舍中垫料的顶部2-3cm，并充分混合在一起并称重(图19)。垫料的总重量除以30，然后将该量的垫料分配到每个试验畜舍中(每个畜舍接受400gm混合播种的(seeded)垫料，图20)。
将收集混合垫料的四个子样品，卵囊计数如下进行：通过将7gm垫料悬浮在75mL饱和蔗糖中并在100倍放大倍数下的Whitlock Universal计数室中计数可见的卵囊总数。
在第0、14、21、28和42天以畜舍为基础称重禽。在第14、21、28和42天测量饲料消耗。计算每个时间段的饲料转化率(FCR)并针对禽损失和移出进行校正。
记录任何死亡或被淘汰的禽并在尸检时称重并检查。特别注意肠道中与球虫病或肠炎一致的病变。记录性别。
在第21天，从每个试验畜舍中随机选出四只禽，对其进行人道安乐死，并对其肠和盲肠在四个肠段(上，中，下部肠和盲肠)的球虫病病变进行评分，并记录典型的艾美球虫属的种的病变。在这一点也通过视觉评估了总体肠道质量(寻找肠炎)。
在第21天，每个畜舍收集四个单独的粪便样品并将其合并，并评估其卵囊计数。
在第42天，对所有存活的禽实施安乐死，并通过收集受污染的废物处置其尸体(不屠宰以供人类食用)。
结果
表31显示了由伯灵禽实验室(Birling Avian laboratories)通过PCR确定的给予播种者禽的接种物中的艾美球虫属(Eimeria)物种的特征。该PCR仅是定性的，但可以估计每种物种的相对丰度(如果丰度更大，显示为“+”符号的数目增加)。
表31在播种者禽的攻击接种物中检测到的艾美球虫属物种
+，++指示存在的相对量；ND＝未检测到。
表32概述了接种后7天从播种者畜舍中提取的每克混合垫料样品(一式四份计数的样品)中的卵囊计数，卵囊的大小可以明确评估，但种类无法准确确定。孢子形成可以用这种技术判断。
表32用作对每个畜舍的攻击的来自播种者禽的混合垫料样品上的卵囊计数
1大卵囊，典型为巨型艾美球虫或布氏艾美球虫
2中等的卵囊，典型为柔嫩艾美球虫、毒害艾美球虫或早熟艾美球虫
3小卵囊，典型为堆型艾美球虫(E.acervulina)或和缓艾美球虫
根据表32中所示的卵囊计数，第14天，每个畜舍接受在分布的播种的垫料中大约630万个卵囊。
在计数攻击播种的垫料时观察到了几种艾美球虫属典型大小的卵囊(表32中估计的百分比)。然而，似乎只有小的卵囊有孢子形成，而其他大小的卵囊中在垫料铺开的时间很少有孢子形成的迹象。
表33显示了每个称重时间的平均体重，表34显示了每个时期的平均体重增加。图21显示了通过治疗的每日平均体重增加。
表33各年龄段的平均活体重(gm)
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
表34按时期增加的体重
平均值体重增加(gm)在每个时期(天)
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
14天的体重显示出采用治疗的明显的差异，接受0.3g/kg IRP的禽的体重显著低于阴性对照，且两种IRP的剂量率均低。两种含沙利霉素的饲料在14天都处于中间水平。在第7天时，这个趋势变得明显，但是这一年龄段并不显著，这也反映在这些时期的体重增加上。到21天时，0.3g/kg IVP治疗组的禽平均体重显著低于任何其他治疗。为0.03g/kg的IVP在第21天具有最高平均体重，并且显著高于沙利霉素+杆菌肽组和0.3g/kg IRP组。接受IVP0.3g/kg的禽直到实验结束时保持比所有其他组的显著更轻，尽管两组之间在第21天后的增加率没有差异。与治疗组相比，阴性对照所经历的球虫病攻击并未显著降低生长率。
从14天开始，IVP 0.3g/kg组的体重比对照组和较低IVP剂量组显著更轻。该组(饲料#2)在试验中消耗的饲料比任何其他组都要少，并且比用IVP治疗的其他两组少得更多(表35)。该组的饲料颜色为嫩黄色(图22)，到42天时，这些禽的粪便中可见未消化的饲料颗粒(图23)。IVP 0.3g/kg剂量的更慢的生长速度可见于图21。禽总是显得健康。
在攻击的一周(15-21天)中，球虫病攻击并未降低阴性对照组的生长速度。
在整个实验过程中，较低IVP剂量组和沙利霉素和沙利霉素+杆菌肽组的生长速度与对照组在统计学上相似。
表35显示了每只禽的饲料摄入量，表36显示了针对禽类损失校正的饲料转化率(FCR＝饲料：体重增加比)。
0-14天和0-21天内接受IVP 0.3g/kg的禽的饲料摄入量以及0-21天内两种含沙利霉素的饲料的饲料摄入量具有比对照组显著更低的饲料摄入量。0.1g/kg和0.03g/kg的IVP的饲料摄入量与对照组相似。之后没有观察到显著的饲料摄入量差异。
表35每只禽的饲料摄入量
FCR(针对禽损失和移出进行校正)仅在整个实验期(第0-42天)后显示出显著变化。两种含有沙利霉素的饲料(#5和#6)的FCR均显著优于对照，而也含有杆菌肽(#6)的饲料的FCR均显著优于IVP 0.1g/kg组(#3)。在各组之间确定的性别比例上的微小差异对禽的表现没有显著影响(未显示)。
表36针对死亡率校正的FCR
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
表37显示了第21天(暴露于受污染的垫料后7天)的球虫病病变得分的结果。
表37球虫病病变得分
A,B,C–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
球虫病的病变主要是堆型艾美球虫(E.acervulina)的典型病变。攻击垫料的PCR显示了巨型艾美球虫，柔嫩艾美球虫和和缓艾美球虫的存在。这与攻击前的卵囊数据一致，这是因为在攻击前对卵囊进行计数时，只有较小的卵囊(堆型艾美球虫(E.acervulina)和和缓艾美球虫)看来具有良好水平的孢子形成。
阴性对照和最低IVP水平显示十二指肠，空肠和总肠的病变得分最高。病变的位置及其外观是堆型艾美球虫(E.acervulina)的典型特征(见图24至图26)。在十二指肠中，仅沙利霉素加杆菌肽与对照组以及IVP的两种较低剂量率相比，显著减少了病变。空肠病变通常较低，但有一些显著差异。总体而言，最高水平的含IRP和沙利霉素的饲料(#5和#6)显著降低了总肠病变得分。
评估来自每个畜舍的合并的粪便样品的卵囊含量。表38显示了结果。结果显示出一定的一致性，但是一个畜舍(0.1g IVP/kg组)的粪便样品中的卵囊计数极高(检查两次)。这个个体畜舍也显示了很高的球虫病病变得分，这使该治疗组的结果出现偏离。观察到的原始卵囊计数不均匀(通过显著的Levene检验)，因此将计数转换为以10为底的对数，以克服此问题以进行ANOVA分析。转换后的log10结果也显示在表38中。对于IVP治疗的饲料组(#2，#3和#4)，粪便的卵囊计数在数字上有所降低，与阴性对照组相比，只有含有沙利霉素的饲料(#5和#6)显著减少了粪便中的卵囊计数。
表38粪便卵囊计数
A,B–上标不同的平均值具有显著性差异(P<0.05)，ANOVA，使用Duncan多范围检验进行分离。
表39显示了肠病变得分，其基于Tierlynck等，Avian Pathology,2011，40：139-144(Tierlynck等，2011)。这是一个得分系统，旨在量化一组禽中存在的菌群失调水平，将某些明显可见的异常归因于得分。较高的总分(最高10)反映了较高水平的菌群失调，尽管如果存在球虫病，则可能会受到影响。就我们的目的而言，肠得分仅反映总体肠病理学。图27至图29显示了一些观察到的肠异常的例子。
在此实验中，第21天的平均肠完整性得分低于第28天。在第21天，增加肠得分的肠区域是上部肠中的体腔膨胀(ballooning)，充血，半透明和异常含量以及直肠中未消化的饲料颗粒的存在。在第28天时，得分较高的区域是上部肠中的体腔膨胀(ballooning)，充血，半透明和紧张。
在21天或28天时，所有治疗的总肠健康得分均无显著差异，但是在21天时，与对照组和最低水平IVP(0.03g/kg)相比，较高的两个水平IVP(0.3和0.1g/kg)以及两种含沙利霉素的饲料均降低了上部肠的半透明得分和直肠中未消化的饲料颗粒的存在。在28天时，为0.3g/kg的IVP产生的总肠健康得分与对照组相比接近显著(P＝0.06)。
表40表现与观察值之间的显著相关性(皮尔逊相关系数)。
校正后的第42天饲料转化率与第21天的总球虫病病变得分呈显著强正相关(r＝0.70)(即较高的病变得分与较高的FCR相关，这些病变的变异占FCR变异的83％)。这种关系在图30中以图形方式显示。在第21天，球虫病病变得分与粪便中的卵囊数目呈中等程度正相关(一种变异占另一种变异的62％)。第21天的肠体腔膨胀与第21天的粪便卵囊计数和第42天的FCR中等程度相关。第21天直肠中未消化的饲料颗粒较高水平的存在与较高球虫病变得分和第42天较差(较高)FCR相关。第28天总肠道完整性得分也与第21天球虫病变得分和第42天FCR呈中等程度正相关。
讨论和结论
尽管所施加的球虫攻击含有几种艾美球虫属，但在攻击时只有堆型艾美球虫(E.acervulina)类型显示出良好的孢子形成。通常认为所有物种的孢子形成条件都是相同的，因此这种观察是不寻常的，其原因未知。该观察结果肯定是准确的，因为在第21天的检查中仅观察到了堆型艾美球虫类型病变。堆型艾美球虫是一种低级致病性物种，不太可能导致死亡，并且对生长速度的影响较小。但是，它可能会引起腹泻并影响饲料转化效率。
所施加的攻击在阴性对照组中产生了中度球虫病病变，所述病变通过含沙利霉素的饲料和含0.30g/kg IVP的饲料被显著减轻；但不通过较低的剂量率减轻。在第21天，只有含沙利霉素的饲料能显著降低粪便中的卵囊水平，而接受IVP水平的所有组均在数值上低于对照。因此，IVP似乎对堆型艾美球虫有一定作用。
接受含0.30g/kg IVP饲料的小鸡的早期生长速度显著低于所有其他组(长达21天)，尽管它们的生长速度随后有所改善，但它们仍是实验中最轻的禽。这与到第21天时每只禽较低的饲料摄入量有关。具有较高IVP水平的饲料颜色为嫩黄色，而食用它的禽则表现出湿润的淡黄色***物。这种较低的饲料摄入量是否是由于适口性造成的，尚不能确切确定，需要进一步评估，松散的***物占优势可能表明在这种引入率下，某种性质的不利影响。
在整个试验中(0-42天)校正后的饲料转化率被所有治疗轻微降低，但与阴性对照相比，仅含沙利霉素的饲料显著降低了前述饲料转化率。FCR与21天的球虫病变得分密切相关，而与粪便卵囊数量和某些肠完整性得分中等程度相关(体腔膨胀，第21天的直肠中未消化的饲料颗粒和第28天的总肠得分)。第42天FCR变异的83％可以用第21天球虫病变得分的变异进行统计学解释。肠体腔膨胀是与球虫病相关的频繁描述的症状。由于第28天的肠得分也与在第21天球虫病变得分有中等程度的相关性，因此我们可以假设在病变消退后肠道中继续存在球虫感染效果(在第28天未观察到球虫病变)。肠道得分系统旨在量化肉用仔鸡小鸡中称为菌群失调的状况的存在和水平，据认为这种状况是由球虫感染引起的。与第21天相比，第28天的肠完整性得分更高(即更严重)，这表明存在一定水平的菌群失调。与阴性对照相比，处理的饲料降低了肠得分，其达到了统计学上的显著水平(P＝0.06)。在这方面，IVP提供了与沙利霉素和沙利霉素加杆菌肽锌相似的改进。这将是合理的证据，其表明IVP可能具有针对菌群失调的某些保护作用。
弯曲杆菌病
弯曲杆菌病是由称为弯曲杆菌(CB)的细菌引起的胃肠疾病。在澳大利亚，CB是细菌性肠胃炎的最常见原因之一，经常与食用受污染的家禽有关。一年中的任何时候都可能发生感染，但在较温暖的月份更常见。在2011年，弯曲杆菌是美国食物传播疾病的第四大诱因。
大多数感染了CB的人会出现腹泻，绞痛，腹痛和发烧，其持续一到两周。通常在感染后2至5天内出现症状。腹泻可能含有血液或粘液。在极少数情况下，CB会进入血流并引起更严重的疾病。
通过食用或饮用受污染的食物(主要是家禽)、水或未经巴氏消毒的牛奶，CB主要传播给人类。CB还可以通过与感染者接触或与携带细菌的猫，狗和家畜接触而传播(图3显示了流行病学)。
任何人都可以患弯曲杆菌病，尽管很小的儿童、老人、免疫力低下的人和与家畜打交道的人感染的风险更大。
大多数人会通过休息和补充水分而从弯曲杆菌病中康复。恢复通常需要一个星期，但可能需要长达两个星期。治疗通常涉及从您的药剂师那里获得的补液溶液，以帮助解决腹泻引起的脱水。在严重或复杂的情况下，可开处方使用诸如红霉素之类的抗生素来减少疾病的持续时间。
家禽尸体/肉的CB污染持续发生。通过清洗和除脏术，控制CB污染的方法已集中在加工厂。但是，据认为，如果在宰杀之前可以控制禽类肠道中CB定殖，那么将减少经加工禽类的污染。
实施例4公开了某些天然化合物对弯曲杆菌的抗微生物活性。
实施例4
实验室工作
鉴定出天然化合物可潜在地用于预防和治疗弯曲杆菌引起的疾病。体外测试了最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。
1.小檗碱氯化物
2.小檗碱硫酸盐
3.槟榔碱
4.白头翁素
5.苦参碱
6.氧化苦参碱
7.穿心莲内酯
8.非洲防己碱
9.黄芩苷
材料和方法
此项目采用了临床和实验室标准协会(CLSI)指南。选择十个代表性菌株。每种化合物的测试浓度为：1000、500、250、125、62.5μg/ml。使用的阳性对照是四环素。
表41测试弯曲杆菌菌株的MIC和MBC
结果
表42弯曲杆菌体外结果
测试
结果＊
MIC
两种化合物展示的MIC为62.5μg/ml。
MBC
相同的两种化合物展示的MBC为62.5μg/ml。
＊四环素结果与MIC和MBC的参考标准一致。
猪的疾病
大肠杆菌-泻病(腹泻)
在吮吸仔猪(sucking piglet)的所有疾病中，腹泻是最常见的，可能也是最重要的。在某些暴发中，它是导致高发病率和高死亡率的原因。在运行良好的群中，在任何时候应有少于3％的一窝仔畜需要治疗，腹泻造成的仔猪死亡率应低于0.5％。但是，在严重的暴发中，死亡率水平可能会上升到7％或更高，在个别未治疗的一窝仔畜中，死亡率水平可能上升到至多100％。主要的细菌原因是大肠杆菌。在吮吸期间的任何年龄均可发生仔猪的泻病，但通常在5天之前以及7至14天之间有两个高峰期。
对于急性疾病，唯一的迹象可能是发现一头完全良好的猪死亡。尸体剖检显示出严重的急性肠炎，以至于突然间可能没有外表的泻病迹象。临床上受影响的仔猪挤在一起发抖或躺在角落。直肠和尾巴周围的皮肤是湿的。环顾畜舍周围，可能会出现水样至色拉奶油稠度泻病的迹象。在许多情况下，有独特的气味。随着腹泻的进行，仔猪脱水，眼睛凹陷，皮肤变得象皮革厚。所述泻病通常会粘在其他仔猪的皮肤上，使它们呈橙色到白色。在死亡之前，可能会发现仔猪在侧面划水和嘴起泡沫。
在亚急性疾病中，症状相似，但对仔猪的影响不那么严重，延长的时间更长，死亡率往往更低。通常在7至14日龄之间看到这种泻病，表现为水样至稀薄的色拉奶油稠度腹泻，颜色通常为白色至黄色。
据估计，仔猪泻病每年给澳大利亚养猪业造成的损失超过700万澳元。泻病的发生率和类型，卫生成本和恢复率决定了个体猪损失的程度。止泻药，如膨润土或高岭土，用于保护肠壁。经常在饮用中添加电解质。抗生素用于减少肠细菌群体的数量，尽管因为抗性的发展需要避免药物滥用。当前的抗生素药物列于下表43。
表43用于治疗仔猪腹泻的抗生素
＊在某些国家禁止
实施例5公开了某些天然化合物对猪疾病的抗微生物活性。
实施例5
实验室工作
已鉴定出天然化合物可潜在地用于预防和治疗猪的传染性肠疾病，包括大肠杆菌诱发的泻病。体外测试最小抑菌浓度(MIC)。测试的化合物是。
1.小檗碱氯化物
2.小檗碱硫酸盐
3.槟榔碱
4.白头翁素
5.苦参碱
6.氧化苦参碱
7.穿心莲内酯
8.非洲防己碱
9.黄芩苷
材料和方法
此项目采用了临床和实验室标准协会(CLSI)指南，以遵循从以下调整的方法来评估MIC：Wiegland等人“Agar and broth dilution methods to determine the minimalinhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances”Nature Protocols2008；3(2):163-175。选择代表性菌株。每种化合物的测试浓度为：1000、500、250、125、62.5μg/ml。使用的阳性对照是四环素。
表44针对MIC检测的猪病菌株
结果
小檗碱和非洲防己碱对所有5株引起泻病的大肠杆菌的MIC均为125μg/ml。四环素结果与针对MIC获得的标准结果一致。
艰难梭菌
艰难梭菌(CD)是一种细菌，可引起从腹泻到威胁生命的结肠炎症的状况。CD引起的疾病最常影响老年人或长期护理机构，并且通常在使用抗生素药物疗法后发生。但是，研究表明，在传统上不被认为具有高风险的人群中，例如没有抗生素使用史或未曾接触过卫生保健设施的年轻且健康的个体中，CD感染率正在上升。在美国，每年约有50万人患有CD疾病，并且近年来，随着抗微生物药抗性的上升，CD感染变得更加频繁，严重且难以治疗。
有些人虽然在肠中携带艰难梭菌，但从未生病，尽管他们仍可能传播感染。体征和症状通常在开始服用抗生素后五到十天内会出现，但可能会在第一天或最多两个月后出现。轻度至中度CD感染最常见的症状是腹泻和轻度腹部绞痛。在严重的情况下，人们倾向于脱水，可能需要住院治疗。结肠发炎(结肠炎)，有时可能会形成原始组织的小块，这些小块可能会流血或产生脓液。
最常导致CD感染的抗生素包括氟喹诺酮类，头孢菌素，青霉素和克林霉素。具有讽刺意味的是，CD的标准治疗方法是另一种抗生素。对于轻度至中度感染，尽管未获得FDA批准，但仍经常开据处方使用口服的甲硝唑。对于更严重的情况，开据处方使用口服万古霉素。非达米星是另一种批准的治疗CD的选择，但费用更高。高达20％的CD患者再次生病。复发两次或更多次后，进一步的复发率提高到65％。CD复发的治疗通常涉及万古霉素。可考虑粪便菌群移植或粪便移植，但其尚未获得FDA批准。
因此，本公开内容涉及一种预防或治疗由人类梭菌属细菌引起的传染病的方法，所述方法包括施用小檗碱生物碱。
本公开内容还预期本文公开的小檗碱生物碱或动物饲料可以抑制孢子形成。抗生素治疗后孢子的过度生长被认为是人类的一个问题。因此，本公开内容涉及通过施用本文公开的小檗碱生物碱或动物饲料来预防抗生素治疗后的艰难梭菌孢子过度生长。
实施例6公开了某些天然化合物对梭菌的抗微生物活性。
实施例6
实验室工作
鉴定出天然化合物可潜在地用于预防和治疗艰难梭菌。体外测试了最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。产气荚膜梭菌也进行了测试。测试的天然化合物为：
1.小檗碱氯化物
2.小檗碱硫酸盐
3.槟榔碱
4.白头翁素
5.苦参碱
6.氧化苦参碱
7.穿心莲内酯
8.非洲防己碱
9.黄芩苷
材料与方法
此项目采用了临床和实验室标准协会(CLSI)指南。采用了指南以遵循从以下调整的评估MIC的方法：Wiegland等人“Agar and broth dilution methods to determine theminimal inhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances”NatureProtocols2008；3(2):163-175，和从以下调整的评估MBC的方法：Chen“Novel therapeuticapproaches targeting Clostridium difficile”,in:Biology Dissertations,Boston(Mass.):Northeastern University,2014。选择了代表性菌株。每种化合物的测试浓度为：1000、500、250、125、62.5μg/ml。使用的阳性对照是万古霉素。
结果
表45梭菌体外结果
＊万古霉素的结果与MIC和MBC的标准一致。
实验数据
使用小檗碱硫酸盐作为测试剂和万古霉素作为已建立的对照，对产气荚膜梭菌坏死性肠炎菌株和艰难梭菌临床分离菌株进行了最低抑菌浓度(MIC)测定。得到来自SichuanBioFarm Inc的天然提取物，纯度为98.0％的小檗碱硫酸盐。小檗碱对产气荚膜梭菌的MIC为125μg/ml，但是在62.5μg/ml的浓度下仍可看到部分抑制生长的作用，表示真实MIC在这两个值之间。
小檗碱对产气荚膜梭菌的最小杀菌浓度(MBC)等于MIC(125ug/ml)，在该浓度下观察到100％的活细胞被杀死。发现小檗碱对艰难梭菌的MIC为500-1000ug/ml(重复之间的差异)。小檗碱对艰难梭菌的MBC为1000ug/ml。小檗碱对艰难梭菌的MIC和MBC值等于或小于先前研究值的2倍稀释度。万古霉素MIC在产气荚膜梭菌和艰难梭菌两者的预期范围内。
实施例7
这项研究旨在确定通过饲料经口服方式向商品肉用仔鸡小鸡施用时，天然存在的植物化合物IRP001氯化物(小檗碱氯化物)的组织残留。
总结
肉用仔鸡小鸡接受混入饲料中的0.3g/kg或0.03g/kg IRP001氯化物，或接受不含添加剂的常规饲料(即对照组)。将禽圈入畜舍(每组10只)后立即开始治疗，并继续治疗35天。在第35天对禽进行安乐死以收集组织，或者在第35天后以常规饲料喂食最多7天，以检查清除期后的残留物。另外两个组接受IRP001氯化物添加饲料28天，IRP001氯化物以0.3g/kg或0.03g/kg添加入它们的饲料(即1kg饲料中0.3g IRP001氯化物或1kg饲料中0.03gIRP001氯化物)和随后在安乐死和组织收集之前，以常规食物施用14天的清除期。
从每只禽(在每种情况下从胸脯，大腿和小腿)采集的三种肌肉组织的1g样品中提取IRP001氯化物。使用LC-MS/MS测定IRP001氯化物的残留质量。所述方法允许以2ngIRP001/g组织的下限检测IRP001。在每次测定过程中均对该测定进行了充分验证，并且该测定被证明在5ng/g组织的定量准确度优于±20％。发现低于2ng IRP001/g的水平在测定的基线噪音范围内，并且低于检测下限(LLOD)，即无法检测到IRP001。
在一个实施方案中，对所述方法进行了优化，使得可以确定地以2ng/g组织检测到IRP001氯化物。在每次测定运行过程中均对该测定进行了充分验证，并且该测定被证明在4ng/g或5ng/g组织的定量精密度优于+20％。发现1ng/g组织或更低的水平在测定的基线噪音范围内，并且低于定量下限(LLOQ)。
在高IRP001氯化物浓度下施用35天后，小檗碱的残留是可检测和可量化的。施用35天后无清除的高饲料添加剂浓度下的平均残留水平(n＝3)为每克乳腺，小腿和大腿组织分别为6.1ng，5.5ng和11.6ng。在所有三块肌肉组织中饲料添加剂浓度高时，具有明显的清除效果，在清除4天后达到约1ng/g的水平，低于LLOQ。在所有情况下(无论是否清除)，在低浓度的饲料添加剂的情况下，平均残留水平均低于1ng/g，低于LLOQ。
即使在以0.3g IRP001氯化物/kg饲料喂食35天后不经过清除期的情况下进行测量，该研究中确定的所有残留物含量均低于标称的安全残留水平13ng/g。
高饲料添加剂浓度后，肝脏中的残留水平在未清除的情况下高于13ng/g，但在清除一天后低于13ng/g。鉴于小鸡肝的平均消耗量有限，因此肝脏中IRP001的水平并不令人担忧。
总体上看，数据表明，在饲料添加剂水平等于或低于0.3g小檗碱/kg饲料的情况下，由食用IRP001氯化物施用的小鸡的鸡肉致癌的风险小于百万分之一。
以0.03IRP001/kg饲料给药后，或以0.3g IRP001/kg饲料给药后清除4天后，小鸡肌肉(即鸡肉)中的小檗碱水平低于LLOD。
介绍
小檗碱生物碱(包括小檗碱)是安全的。小檗碱多年来一直被人类用作膳食补充剂，可从多家制造商处以胶囊形式获得。它被销售以每天使用一次或两次，使用的剂量高达400mg小檗碱氯化物/胶囊。此外，在导致本发明的实验中，在42天内用在1kg的市售饲料中1g小檗碱剂量的小檗碱治疗的肉用仔鸡未观察到不良反应或未预料到的事件(参见实施例8)。
如在其他地方所述，在美国，食物药物监督管理局(FDA)负责批准受联邦食物、药品和化妆品法(FD&C Act)管制的人和动物药以及饲料添加剂。
FD&C法要求证明欲用于食物生产动物的化合物是安全的，和证明暴露于这些化合物的动物生产的食物对于人食用是安全的。尤其是，法规(21CFR第500部分，E亚部分-食物生产动物中使用的致癌化合物的规定)禁止在食物生产动物中使用发现在被人或动物摄入时诱发癌症的任何化合物，除非符合某些条件(所谓的“己烯雌酚(DES)限制性条款”)。根据DES限制性条款，如果可以通过规定的检查方法确定在实践中将被遵循的合理确定的使用条件下，由食物生产动物生产的食物中不会发现化合物“残留”，则不禁止使用可疑的致癌化合物。
因此，如果FDA决定将小檗碱作为致癌化合物进行管理，除非适用“无残留”DES限制性条款，否则美国法规禁止在食物生产动物中使用小檗碱。
术语“无残留”是指可食用组织中剩余的任何残留含量如此之低，以至于对消费者而言，其表现出不显著致癌风险。更具体地说，将不显著致癌风险定义为风险增加一百万分之一。
尽管小檗碱具有记录的安全性，但美国政府(国家毒理学研究中心)委托进行了毒理学研究，该研究在高剂量慢性啮齿类动物研究中发现了潜在的致癌性。
因此，要获得GRAS状态，有必要估算可接受的鸡肉中小檗碱的最大残留水平(考虑到鸡肉的典型终生食用)。为了确保食用鸡肉引起的癌症风险低于百万分之一，据估计最大可接受残留水平为每克鸡肉(即胸脯或腿部(leg)肌肉组织)13ng小檗碱。
为了研究所公开的饲料添加剂是否安全并且适合于指定剂量的GRAS状态，进行了适当的残留试验。与Invetus Pty Ltd签订合同以进行试验，收集组织，与MonashUniversity签订合同以分析组织样品中的小檗碱。
残留研究设计
使用肉用仔鸡小鸡的这项研究的规程作为附录B的附件附于实施例。研究了两种浓度的IRP0001氯化物：0.3g/kg饲料和0.03g/kg饲料，分别代表饲料添加剂的高低浓度。
一百八十只禽被分入18个畜舍，每个畜舍含十只禽。为了代表肉用仔鸡小鸡的典型饲养过程，试验禽以高浓度或低浓度接受了含添加剂的饲料35天。35天后，对每种添加剂浓度的一组进行安乐死以收集组织(每个畜舍中有6只最大的禽)。
为了研究在将含IRP001氯化物的饲料替换为常规饲料后是否明显消除(代谢和***)IRP001氯化物，其他组接受IRP001氯化物35天，然后在安乐死和组织收集前1、2、4或7天接受常规饲料。另外两个组接受IRP001氯化物28天，然后接受常规饲料14天(即清除14天)。平行对照组以完全相同的治疗方式治疗，除了在整个研究过程中对照禽接受常规饲料。在所有情况下，均从肌肉组织的三个区域(胸脯，大腿上部和下部)取样。收集样品，冷冻并运输以进行分析。表46总结了研究设计，该研究设计显示了残留研究中18组禽中每组所用的IRP001浓度和喂食方案。
表46每组肉用仔鸡的喂食方案总结
NB-对照组接受无添加剂的常规饲料
LC-MS/MS分析的性能
附录A中概述了用于组织提取和LC-MS/MS的测定方法的详细信息。最初根据简单的溶液中校准了小檗碱的测定方法，随后对组织提取后的测定方法进行了验证。
组织样品小檗碱峰可以在低至2ng/g组织的浓度被检测到，由于组织基质效应和1ng/g组织中的分析物残留(carryover)而产生的干扰，使得在此浓度或更低浓度下难以定量IRP001。在5ng/g(或在某些情况下为4ng/g)下，该测定在±20％真实分析物浓度时可以被验证为准确的。在结果部分，高于5ng/g的IRP001水平被引用作为绝对值，2和5ng/g之间的IRP001水平被认为低于LLOQ，和指示值低于2ng/g的输出被认为在基线噪声之内，低于LLOD，因此是无法检测到的。
在一个实施方案中，来自组织样品的小檗碱峰可以在低至1ng/g组织的浓度被检测到，由于组织基质效应和1ng/g组织中的分析物携带(carryover)而产生的干扰，使得在此浓度或更低浓度下难以定量IRP001。在5ng/g(或在某些情况下为4ng/g)下，该测定在±20％真实分析物浓度时可以被验证为准确的。实际上，小于2ng/g的浓度可以认为低于定量下限(LLOQ)。峰检测的下限为1-2ng/g。
结果
来自每个饲料添加剂组3只禽组织样品通过Monash分析团队接收并通过LC-MS/MS进行分析。测定来自每个对照组的单个样品。
表47显示了针对每组3只禽切除的每个肌肉组织测定的小檗碱的平均浓度和标准偏差。测定了每个对照组的一个代表，发现这些值实际上为零，在结果表中表示为低于LLOD“<LLOD”，即不可检测。
概括地说，胸脯组织样品，大腿和小腿肌肉样品具有可比性，尽管确定的浓度很低，但数据仍显示出明显且合乎逻辑的趋势。在0.03g/kg饲料的低饲料添加剂浓度下，无论是否有清除，在所有情况下均无法检测到小檗碱的平均残留水平(即低于LLOD和LLOQ)。
在较高的IRP001浓度为0.3g/kg饲料时，35天后的平均小檗碱残留在可量化的范围内。胸脯为6.1±1.6，小腿为5.5±3.0ng/g，和大腿组织为11.6±6.6ng/g。在这两个组织中，逐渐清除是明显的。小檗碱残留在1天和2天后下降，而4天后小檗碱水平低于LLOD。
表47肌肉组织中IRP001氯化物的残留
NB
<LLOD＝低于检测下限(即不可检测)
＊星号表示估计值<LLOQ(低于验证的定量下限)
表48显示了从每组3只禽切除的肝脏组织测定的小檗碱的平均浓度和标准偏差。测定了每个对照组的一个代表，发现这些值实际上为零，在结果表中表示为低于LLOD“<LLOD”，即不可检测。
表48肌肉组织中IRP001氯化物的残留
NB
<LLOD＝低于检测下限(即不可检测)
＊星号表示估计值<LLOQ(低于验证的定量下限)
结论
在该研究中确定的肌肉组织(鸡肉)中的所有残留水平均低于标称的安全残留水平13ng/g，即使以0.3g小檗碱/kg饲料喂食35天后在没有清除期的情况下测定也是如此。在所有情况下，在0.03g/kg饲料的较低IRP001浓度残留水平被确定为小于2ng/g组织，并且可以被认为是不可检测的。
给禽喂食0.3g IRP001/kg饲料后，肝脏中的残留水平高于定量限，经过7天的清除期降低，并在14天清除后降至低于定量限。给禽喂食0.03g IRP001/kg饲料后，肝脏中的残留水平低于清除前后的检测极限。
附录A
分析方法
以四氢棕榈精(palmitine)为内标，通过LC-MS/MS测定了小檗碱。
组织样品的制备
1.切出约1g组织并称重到M管中。将组织储存在-20℃的冰箱中，直到准备好均质化为止。
2.对于每克组织，将2体积的MilliQ水添加到管中。
3.将M管连接到GentleMACS匀浆器上，并运行程序方法RNA_01_01(60秒)3次，以确保组织完全匀浆。
4.将组织匀浆以200μL等分试样分配到Eppendorf管中。
5.向组织匀浆的每200μL等分试样中加入10μL内标溶液，然后加入600μL 100％甲醇。将样品在最大设置下涡旋3x 10秒，然后以10,000rpm离心3分钟。
6.将100μL上清液转移至LC小瓶中以进行分析。
方法验证
1.验证了所述方法的选择性，线性，LLOQ，准确度，精密度，回收率，稳定性和基质效应。
2.通过制备掺有高达500ng/g浓度的单个分析物的样品进行选择性评估，每个样品重复5次。将峰值信号与校准标准品(掺有分析物)进行比较，以确保没有干扰。
3.为了评估LLOQ，以6次重复制备了5ng/g和10ng/g的标准。LLOQ是在校准曲线的最低浓度下测定的，其精密度和准确度均≤20％。
4.为了表明准确度和精密度，制备了4种浓度水平，分别为20、50、100和500ng/g(每个重复5次)。准确度表示为与标称浓度的偏差(％)，精密度表示为重复的相对标准偏差(RSD)。
5.为了评估回收率，通过以下制备基质回收样品：提取空白组织，然后掺入分析物溶液，得到多种浓度水平，至多500ng/g(每个重复5次)。通过提取样品的平均峰面积与基质回收样品的平均峰面积之比定义回收率。
6.为评估台式稳定性，制备了20、50、100和500ng/g的4个浓度水平，每个浓度水平重复5次，在提取前将其在室温下放置30分钟。将平均峰面积与新制备的标准品的平均峰面积进行比较。
7.为了评估基质效应(ME)，在净溶液中制备了20、50、100和500ng/g的4个浓度水平，每个浓度水平重复5次。ME定义为回收样品的平均峰面积与净标准品样品的平均峰面积之比。
表49 LCMS测定条件
附录B
合规
根据利用SOP和良好科学实践的经同意的方案进行了组织残留耗竭研究。
研究设计
a.实验单位：实验单位和观察单位均为个体动物。统计单位是治疗组。
b.动物模型：饲料摄入量，每天的水摄入量，体重变化，死亡率和组织中标志物残留用作结果参数。
c.纳入标准：如果动物符合以下概述的标准，则选择它们。
d.排除和移出标准：调查者认为收到后虚弱、患有疾病、受伤或因其他原因不适合纳入研究的动物将被排除在外。
选择后，只有得到发起人或调查者的书面同意，才将可能被认为不适合继续进行研究的动物移出。任何移出的原因将在原始数据和研究报告中得到充分记录和证明。被从研究中移出的动物将得到适当的兽医护理。
e.分配：肉用仔鸡小鸡：在收到后，将符合纳入标准的一百八十(180)只肉用仔鸡小鸡在从运输容器中被取出后、依次分配到十八(18)个单独的治疗组中，每组十(10)只禽。分配和随机化的方法将在原始数据和研究报告中进行描述。
f.盲化：不适用。
调查研究的兽医产品(IVP)
记录所有制剂细节，包括批号，有效期，收到和使用。
a.调查研究的兽医产品：IRP001 Cl作为100％IRP001 Cl。
b.来源：IVP将由发起人提供。
c.储存：IVP应在环境温度下在指定温度区域内储存。记录IVP的储存位置和条件。
d.安全性：发起人提供了SDS或其同等物(如果有)。
e.分析：为IVP提供了分析证书(如果有)。
f.药物处置：记录所有剩余IVP的处置。
治疗
a.剂量计算：剂量基于饲料中IRP001 Cl的固定浓度(0.03或0.1g/kg IRP001Cl)。
b.剂量制备：将粉末状IRP001 Cl并入市售饲料原料成分，然后在例如“混凝土混合器”型设备中充分混合，以提供所概述的饲料中最终浓度。
c.剂量施用方法：根据下表49中详细列出的治疗方案对研究动物进行给药。在相关治疗中，应无限制地向鸡提供含药饲料，作为其唯一的饲料来源。
表50治疗方案-饲料转化率
＊安乐死
＊＊注意：含药饲料在第28天从第6组和第12组撤出，以允许这些组有14天的清除期。
事件时间表
表51事件时间表
测试系统
动物详细信息记录在原始数据中。即：物种，肉用仔鸡小鸡；数量，180；来源，商业的(一批90只)；年龄，一日龄。
动物管理
a.动物福利：对研究动物进行类似管理，并适当考虑其福利。根据动物伦理委员会(AEC)的要求观察研究动物，并完成“动物照管记录”。
b.健康管理：如有必要，应尽快进行任何常规的预防性治疗并记录下来(产品名称，批号，有效期，剂量，施用途径和日期)。
从第0天开始，在合适的位置根据标准操作规程(SOP)每天两次观察研究动物。记录任何需要进一步检查的健康问题。
所有健康问题和不良事件必须在一个工作日内报告给调查者。调查者认为与产品相关、导致死亡、危及生命、涉及大量动物或人类不良事件的任何不良事件，都必须记录并在一个工作日内报告给发起人和AEC。
可以执行常规兽医护理和程序，并在原始数据中进行描述。出于标准管理实践和人道原因，可以在调查者和发起人(如果相关)事先批准的情况下，并用药物疗法。没有施用类似于IVP的治疗。记录所有并用药物疗法，以提供所用材料的标识(产品名称，批号和有效期)，动物ID，使用原因，施用途径，施用的剂量和日期，并包括在原始数据(试验日志)和研究报告中。
如果受伤或疾病导致研究动物安乐死或死亡，应对此进行记录并在可能的情况下由兽医进行验尸。原始数据中包括“验尸报告”，包括可能的死亡原因。
研究报告中包括所有健康问题，不良事件和动物死亡率，包括它们与治疗的关系。
c.畜舍环境：治疗组将鸡饲养在经过批准的动物设施内的两个单独且离散的受控环境房间中的专用的鸡地面畜舍。一个房间可容纳第13至18组(含第13组和第18组)的所有未用药的禽，第二个房间可容纳第1至12组(含第1组和第12组)的所有用药的禽。每个畜舍的地面空间为约1.5m2。根据正常的商业惯例，将鸡在垫料上饲养。
到第49天为止，共有18个地面畜舍，每个畜舍有10只鸡。研究结束时，每个畜舍的最大鸡体重都远低于澳大利亚实用标准中建议的肉用小鸡最大值40kg/m2。
注意-第13至18组(含第13组和第18组)的禽(未治疗的对照动物)与药物治疗的第1至12组禽保持在相似但物理分离的隔离室中，从而确保研究期间无交叉污染。
d.实验饮食：在整个研究过程中，施用配制的商业育雏期(starter)配给量然后育成期(grower)配给量。原始数据中包含显示饲料成分的饲料袋标签或同等物的副本。
e.饲料和水摄入量：称重并记录每天添加的饲料，并计算每天的饲料摄入量(按治疗组)。测量并记录每天的水体积，并计算每天的水摄入量(按治疗组)。
f.动物处置：根据AEC的批准，对研究动物进行人道安乐死，并按照事件时间表中列出的间隔进行记录(表50)。
研究程序
a.试验日志：记录研究期间所有计划的和计划外的事件。
效果评估
a.体重：在第0天(组体重)和第7、14、21、28和35天称重鸡-记录各个动物的体重。在称重前后，使用校准的测试砝码检查称重秤并记录。将研究终止时的体重在各组之间进行比较，以确定治疗效果(如果有)。
b.检查：在总体病理学和组织收集时，对安乐死进行了单独的临床检查。记录临床检查。可以适当记录数字静态图像。
c.观察结果：每天两次检查禽的总体健康状况，通常是在早上8点之前和下午4点之后。因此，两次观察之间的典型间隔是白天9小时，过夜15小时。如果调查者认为显著患有异常临床症状(例如明显的衰弱且恢复可能性较低)，则记录显示异常临床症状的禽，对其仔细观察并对其实施安乐死。
d.尸检检查：在第35至49天之间，按照时间表-表14对所有禽实施安乐死和尸检。
e.总体病理学：对来自所有第1至18组的所有禽进行尸检并检查总体视觉病理学变化，这些变化被适当描述和评分(按个体禽)。
f.组织残留分析：按照时间表、表50，从每组(第1至18组(包含第1组和第18组))中6只(6)最重的禽收集肝脏、肾脏、胸脯肌肉(1)、腿部肌肉(2)[大腿上部和下部]和具有完整脂肪的全部的皮肤的双份代表性样品，并将其冷冻储存(<10摄氏度)，用于随后的标志物残留分析。在第35天将第13至18组的禽作为未治疗的对照禽处死，并收集组织以满足组织测定(tissue assay)要求。
样品将用不干胶标签标记，所述标签列出研究编号，动物ID，时间点，日期，样品类型和重复样品(replicate)。
为了进行残留分析，将样品融化，然后将已知重量的组织(约1g)在2ml水中匀浆。离心样品，并取出已知体积的上清液，以通过LC-MS/MS分析。
表52分析矩阵
g.样品的储存，转移和处置：记录样品的储存，转移和处置。将重复样品1组织样品在第10节中概述的时间在湿冰上冷冻运输到分析实验室。根据标准操作规程(SOP)，将样品与随附的温度数据记录仪和冷冻水瓶一起转移。在最后一个样品收集时间点之后，将重复样品2组织样品冷冻储存6个月的期间。超出这一点，根据研究现场的决定可将其丢弃，除非发起人代表明确要求不这样做。
统计分析
方法记录在研究报告中。
数据记录
方案规范将取代设施SOP。可以在研究过程中根据需要添加或修改研究表格，而无需进行方案修订或偏离。
a.方案批准：研究开始之前，方案由所有相关人员批准并签署(请参阅第1页)。
b.修改/偏离：修改是在执行更改或修改的任务之前对方案进行的更改或修改。修改必须说明更改的原因，并有书面记录的发起人授权。该修改必须由调查者和发起人签署。
在确定偏离时，调查者应记录、签署相对于本方案或适用的SOP的偏离和注明日期。将评估对研究的整体结果或完整性的影响。必须在切实可行的范围内尽快将偏离告知发起人。
相应地记录所有方案的修改和偏离，并根据发生的日期或识别的日期顺序编号。
c.文件注释：对文件注释进行了相应记录，以澄清否则从原始数据来看可能不明显的事件或情况。必须在切实可行的范围内尽快将文件注释告知发起人。
d.研究人员的变更：研究调查者或其他负责任研究人员的变更应相应记录。
e.原始数据：所有起始原始数据页均由进行观察的人员和记录信息的人员进行分页，用研究编号标识并签名并注明日期。
f.通讯日志：调查者保留与研究相关的所有信件的副本。记录会导致研究文档编制、设计、进行或研究报告发生变化的任何电话交谈。
g.许可：本方案中详细介绍的研究应包含在政府机构许可(例如APVMA小试验许可)中。
研究报告
研究报告由调查者或指定人员准备。包括测量的每个变量的数据清单。研究调查者的合规声明包含在研究报告中。附有原始数据和统计报告的原始签名研究报告将提交给发起人并存档。
实施例8
这项研究通过组织学检查评估了IRP001氯化物在肉用仔鸡中的安全性。
总结与结论
组织学结果示于表53。
表53组织学
从以上看，累积病理学和肠炎得分等于或低于对照治疗1无组。总之，在生产环境中，所鉴定的所有胃肠道(GIT)组织学病变均在肉用仔鸡小鸡的正常限度内。在生产环境中，所鉴定的所有肝脏组织学病变均在肉用仔鸡小鸡正常限度内。
实验说明和方案
研究目的
这项研究的目的是通过组织学检查来检验IRP001氯化物在饲养到市场重量的肉用仔鸡中的一般安全性。
实验设计
实验由以下治疗组成(每治疗1畜舍，表54)。
表54治疗
TRT
禽类型
开始天
在饲料中加入药物
G/Kg
1
肉用仔鸡
0
无
0.0
2
肉用仔鸡
0
IRP001
0.05
3
肉用仔鸡
0
IRP001
0.5
4
肉用仔鸡
0
IRP001
1.0
地面畜舍的描述和管理
将禽饲养在面积为4x 10＝40ft2的畜舍中，并用干净的木材刨花作为垫层，其厚度为约4英寸。该畜舍有5英尺高的侧壁，底部1 1/2英尺是实木，可以防止禽迁徙。
监测建筑物的温度。试验期间的环境条件(温度)对于动物的年龄是适合(最佳)。放置在畜舍上方的荧光灯提供照明。每个畜舍在一个管式投饲机中无限制地提供饮食。从D0到D7，饲料也被供应到放置在每个畜舍垫料上的托盘上。每个畜舍无限制地从一个Plasson饮水器提供水。
在整个实验中都使用了标准的地面畜舍管理规范。每天两次对动物和畜舍环境设施进行检查，观察并记录总体健康状况，恒定的饲料和水供应以及温度，清除所有死禽并识别意外事件。在研究期间发现死亡的禽记录在每日死亡率记录中，不会被替换。记录畜舍数，死亡日期，性别，体重和诊断。
禽
获得孵化日的科布(Cobb)雄性小鸡，每个畜舍放置十只雄性肉用仔鸡小鸡。在动物处置表上记录所有测试动物和任何其他禽的可计量性。禽在孵化场进行了性别鉴定。记录了孵化场的种鸡群历史和疫苗接种记录。在D0和42记录畜舍的禽体重。
饲料
所有饲料均被制备成碎裂料/粒料并被喂食。
记录所有用于准备治疗批次的基础饲料和项目的数量。将每批饲料混合并分开装袋。确定每个袋子的研究编号，混合日期，饲料类型和正确的治疗编号。保留了饲料混合和测试物品清单的完整记录。
饲料样品
收集治疗饲料样品(每个
施用时间表
所有的重量都按畜舍计。从D0至21喂食治疗育雏期饲料。在D21，按畜舍称重未消耗的育雏期饲料并将其丢弃。发出育成期饲料并施用直到D35。在D35，按畜舍称重未消耗的育成期饲料并将其丢弃。喂食育肥期(finisher)饲料直到D42。在D42，按畜舍称重未消耗的育肥期(finisher)饲料并将其丢弃。
饮食
饮食细节见表55和表56。
表55营养
使用的主要成分是玉米，大豆粉和动物副产品。
表56成分
1维生素混合物提供以下(每kg饮食)：硫胺·一硝酸盐，2.4mg；烟酸44mg；核黄素4.4mg；D-泛酸钙，12mg；维生素B12(钴胺)，12.0μg；吡多辛·HCl，4.7mg；D-生物素，0.11mg；叶酸5.5mg；亚硫酸氢钠甲萘醌络合物，3.34mg；氯化胆碱，220mg；胆钙化醇27.5ug；反式视黄醇乙酸酯，1,892ug；全外消旋α生育酚乙酸酯，11mg；乙氧喹125mg
2微量矿物质混合物提供了以下(每kg饮食)：锰(MnSO4·H2O)，60mg；铁(FeSO4·7H2O)，30mg；锌(ZnO)，50mg；铜(CuSO4·5H2O)，5mg；碘(乙二胺二氢碘化物)，0.15mg；硒(NaSe03)，0.3mg。
基础饲料不含任何益生菌/益生元饲料添加剂，NSPases，抗球虫药或抗生素生长促进剂。所有饮食均含有植酸酶。
组织学样品
在研究结束的当天(D42)，对每个畜舍的五只禽进行了人道安乐死，并收集了上，中，下肠切片以及肝叶，并将其储存在中性缓冲***中。这些样品被运送以进行分析。
程序
1.在整个实验过程中使用标准的地面畜舍管理惯例。监测建筑物的温度。试验期间的环境条件(温度)对于动物的年龄是适合(最佳)的。放置在畜舍上方的荧光灯提供照明。照明方案是从D0到D14点亮24小时，然后点亮18小时直到D42。
2.每个畜舍在一个管式投饲机中无限制地提供饮食。从第1天至第7天，饲料也被供应到放置在每个畜舍的垫料上的托盘上。
3.施用和饮水的方法。无限制的。
4.环境控制。有环境湿度。
5.疾病控制。研究期间未使用任何伴随药物疗法。
6.禽识别。畜舍是度量单位。畜舍的安全性阻止了禽的迁徙。
7.在研究过程中，记录针对一般鸡群状况的每天两次观察。所观察到的包括饲料和水的可获得性，温度控制以及任何异常情况。仔细观察了禽是否有异常反应。
数据条目与分析
源数据使用擦洗不掉的墨水录入。条目清晰易读，由进行观察录入的人员签名或初始化，并注明日期。每张源数据表均由负责该数据的人员签名。对源数据的任何错误或更改进行初始化并注明日期，并添加关于更改原因的更正代码或声明。
禽和饲料的处置
所有禽和饲料都按照SOP被埋。处置记录包含在源数据中。
源数据的位置
原始源数据表和最终报告发送给发起人。保留文件的精确副本和最终报告。
实施例9
这项研究测量了IRP001对堆型艾美球虫，巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的混合物的抗球虫功效/敏感性。
实验设计
实验由72个笼子组成，以8只雄性小鸡开始。将治疗以6个区组重复，每个随机分配在12个笼子的区组内。Southern Poultry Research，Inc.(SPR，雅典，GA 30607)提供了用于治疗和区组的畜舍分配的随机程序，该公司为发起人进行了研究。
治疗组列于表57。
表57治疗组
Trt
描述
1
没有治疗/没有攻击
2
没有治疗/攻击
3
IRP001-0.03g/kg
4
IRP001-0.1g/kg
管理
1.对设施进行彻底检查，以确保所有笼子在每个笼子中都有可获得的水和饲料。保持建筑物温度适合禽类的年龄。
2.通过沿墙壁垂直悬挂的荧光灯提供均匀连续照明。
3.无限制地提供饲料和水。
4.每天两次检查笼子。记录观察结果，包括饲料可获得性，水，温度和任何异常情况。
5.从笼子中取出死亡禽后，将笼子编号，日期，禽体重，性别和可能的死因记录在每日死亡率记录中。
实验配给量
配制了与佐治亚州北部常用的饲料混合的未加药的商业育雏期配给量。从小鸡到达之日起直至研究结束前，无限制地施用这种配给量(以糊状物形式)。实验饮食是从统一的基础饮食中制备的。记录用于制备治疗批次的所有基础饲料和测试物品的数量。混合治疗饮食以确保测试物品的均匀分布。在含药治疗饮食之间冲洗混合器。将饲料转移至2号楼，并分配到相同治疗的笼子中。
称量已发出并保留在DOT 14和20的饲料。
饲料样品
收集每批治疗饮食的开始，中间和结束各一次，并混合以形成复合样品。对于每种治疗，从复合物中取出一个样品，并保持直到研究完成。
动物
获得孵化日小鸡(Cobb 500)用于研究。记录菌株，来源和疫苗接种记录。到达后，将小鸡分配到治疗养鸡房笼中。将小鸡(DOT 0)分成8组，称重，并放入指定的笼子中。参加测试的禽总数为576。所有禽的可计量性记录在源数据中。
按照笼子在DOT 0、14和20称重禽。
卵囊接种
球虫卵囊接种程序在SPR SOP中进行了描述。在研究的DOT 14，所有T1禽通过口服移液管(口服)接受1ml蒸馏水。所有其他禽均接受稀释至1ml体积(口服)的球虫接种物。接种物是堆型艾美球虫(100,000个卵囊/禽)，巨型艾美球虫(50,000个卵囊/禽)和柔嫩艾美球虫(75,000个卵囊/禽)的混合物。
每克粪便材料中的卵囊
在DOT 19，清洁了所有粪便收集盘。在DOT 20，从所有治疗笼子中收集粪便样品。将从每个笼子收集的粪便充分混合，并准备好以进行粪便漂浮。检查每个样品的每克粪便材料的卵囊数量。
病变评分
在DOT 20，对每个笼子中的所有禽均进行了病变评分。约翰逊和里德(Johnsonand Reid，1970)的球虫病病变评分方法用于对肠道的感染区域进行评分(Johnson J,ReidWM.“Anticoccidial drugs:lesion scoring techniques in battery and floor-penexperiments with chickens”Exp Parasitol.1970Aug；28(1):30-6)。
收集数据
1.数据收集遵循以下时间表：
DOT 0发出饲料，按笼子称重并分配禽。
DOT 14使禽接种球虫(T1除外)。
DOT 19清洁***物盘
DOT 20按笼称重禽。将剩余饲料称重。粪便材料按笼收集。对所有禽球虫病病变进行了评分。
2.尸检记录死亡重量，以确定可能的死亡原因。
记录每天两次的临床观察。
测试动物和饲料的处置
根据SPR SOP，将所有禽和剩余的饲料埋入SPR坑中。处置记录包括在源数据中。
数据分析
计算组体重增加，饲料消耗，饲料转化率，opgs，球虫病得分和死亡率的平均值。根据用于数据分析的SPR标准操作程序对原始数据进行分析。使用STATIX程序LSD测试分析原始数据。当ANOVA F值显著(p≤0.05)时，使用P值0.05分离均值。
记录
最终报告和原始源数据表发送给发起人。Southern Poultry Research，Inc.保留了准确的副本。
结果
饲料摄入量，校正后的饲料转化率(Adj.FCR)，体重增加(Wt.Gain)，死亡率(％Cocci Mort.)的结果；病变得分；和粪便卵囊的计数(堆型艾美球虫(E.acer)，巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫)示于表58。
表58实施例9的结果
本领域技术人员将认识到，在不脱离如广泛描述的本发明的范围的情况下，可以对如具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是说明性的而非限制性的。