阅读说明：本技术 甘露糖醛二酸的组合物在治疗血管性痴呆症中的应用 (Application of composition of mannuronic aldehydic acid in treating vascular dementia ) 是由 耿美玉 辛现良 杜晓光 张真庆 丁健 于 2018-06-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种甘露糖醛二酸寡糖组合在治疗血管性痴呆方面的应用。(The invention relates to an application of a mannosyldiacid oligosaccharide composition in treating vascular dementia.)

甘露糖醛二酸的组合物在治疗血管性痴呆症中的应用

技术领域

本发明涉及通过生物活性筛选的方法得到甘露糖醛二酸的最佳组合物在治疗血管性痴呆方面的应用。

背景技术

血管性痴呆(vascular dementia,VD)是指由脑血管疾病所致的严重认知功能障碍综合征。我国VD的患病率为1.1％～3.0％，年发病率在5～9/1000人。其临床主要以治疗原发性脑血管疾病，预防VD发生为主。对于VD患者，主要以维生素E、维生素C和银杏叶制剂等作一定的辅助治疗，目前尚未有良好的治疗药物。

甘露糖醛二酸由于其潜在的药用价值已经受到广泛的重视。甘露糖醛二酸通常以海藻酸为原料经过多步骤制得。

在原料海藻酸的多糖分子中，有由甘露糖醛酸(D-mannuronic acid)通过β-1,4-糖苷键连接形成的M段、古罗糖醛酸(L-guluronic acid)通过α-1,4-糖苷键连接形成的G段，以及由这两种糖杂合形成的MG段。甘露糖醛酸和古罗糖醛酸的结构式如下(Ⅰ)式所示：

M段和G段可以从原料海藻酸中分离。通常的方法可以简单描述为：将海藻酸初步降解后可得到聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的混合多糖，混合多糖再经酸法沉淀后，可以除去其中的聚古罗糖醛酸，进一步精制可以得到纯度在90％以上的均聚甘露糖醛酸(下文中也称“M段中间体”)。例如，可参见中国专利申请No.98806637.8以及CN02823707.2所披露的方法。

制备寡聚甘露糖醛酸的做法如下：将上述得到的M段中间体在酸性条件下加热进一步酸解得到所需分子量范围的小片段甘露糖醛酸聚合物。另外，也有通过氧化降解的办法提升降解效率，同时可以将还原末端氧化为开环的糖二酸，详见耿美玉等人的中国专利申请200580009396.5(专利文献1)及美国专利US 8835403B2(专利文献2)。为了方便叙述，专利文献1和2在下文中统称为在先专利，它们以引证的方式全部并入本文。

在先专利披露的甘露糖醛二酸的反应过程可通过如下反应方程式(Ⅱ)表示，即寡聚甘露糖醛酸多糖还原端的甘露糖醛酸C1-位醛基氧化成羧基。

在上述氧化转化过程中，常用的氧化剂有碱性硫酸铜溶液，即菲林试剂，在先专利即采用了该氧化方法，具体为：在碱性条件下，将反应底物聚甘露糖醛酸即上文的M段中间体加入硫酸铜溶液中，在沸水浴中反应15分钟至2小时。该法是以Cu2+离子为氧化剂氧化醛基，反应中产生砖红色的氧化亚铜沉淀，这个反应常用于鉴定还原性糖。

在先专利公开了甘露寡糖二酸具有抗阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和抗糖尿病的作用。阿尔茨海默病与Ⅱ型糖尿病的发病过程与淀粉样蛋白(β-amyloid及amylin)密切相关。淀粉样蛋白聚集以后产生蛋白寡聚体，进一步聚集形成纤维。这些蛋白聚集物有细胞毒性，在细胞内诱导氧化反应损伤线粒体以及引发血管性痴呆反应等级联反应，造成大量的神经元和β细胞损伤，最终导致阿尔茨海默病与Ⅱ型糖尿病的发生。甘露寡糖二酸靶向淀粉样蛋白并拮抗其诱导的级联反应，由此具有预防和治疗阿尔茨海默病与Ⅱ型糖尿病的作用。

在先专利CN106344593A公开了褐藻胶寡糖及其衍生物在治疗血管性痴呆方面的应用，并公开了四糖-十糖混合物在治疗血管性痴呆方面的药效活性情况。

发明内容

本发明涉及一种甘露糖醛二酸寡糖组合物在治疗血管性痴呆中的用途。本发明还涉及一种治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的本发明所述的甘露糖醛二酸寡糖组合物。

本发明中使用的甘露糖醛二酸寡糖组合物具有特定的组成，包含具有式(Ⅲ)的甘露糖醛二酸或其药学上可接受的盐：

其中n为选自1-9的整数，m选自0，1或2，m’选自0或1，

并且其中，

n＝1-5的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合物总重量的60％以上；

n＝1-2的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合物总重量的低于60％。

附图说明

图1是产品A中二糖、三糖和四糖的质谱图。

图2是产品A中五糖、六糖和七糖的质谱图。

图3是产品A中八糖、九糖和十糖的质谱图。

图4表示寡糖组合物、六糖及对比实验样品对双侧颈总动脉结扎致血管性痴呆小鼠避暗实验潜伏期的影响；图中横坐标的编号分别对应的样品为：i:对照组；ii:模型组；iii:产品A；iv:产品B；v:产品C；vi:产品D；vii:对比实验样品；viii:六糖。

图5表示寡糖组合物、六糖及对比实验样品对双侧颈总动脉结扎致血管性痴呆小鼠避暗实验错误次数的影响；其中横坐标附图标记同图4。

图6表示寡糖组合物、六糖及对比实验样品对对双侧颈总动脉结扎致血管性痴呆小鼠水迷宫实验逃避潜伏期的影响；其中横坐标附图标记同图4。

图7表示寡糖组合物、六糖及对比实验样品对双侧颈总动脉结扎致血管性痴呆小鼠穿越平台次数的影响；其中横坐标附图标记同图4。

图8表示寡糖组合物、六糖及对比实验样品对大脑中动脉结扎致血管性痴呆大鼠水迷宫实验逃避潜伏期的影响；其中横坐标附图标记同图4。

具体实施方式

下文将对本发明的各个方面进行具体说明，但本发明并不限于这些具体的实施方式。本领域技术人员可以根据下文公开内容的实质对本发明进行一些修改和调整，这些调整也属于本发明的范围。

本发明涉及一种甘露糖醛二酸寡糖组合物在治疗血管性痴呆中的用途。本发明还涉及一种治疗血管性痴呆的方法，包括给予需要治疗的患者治疗有效量的本发明所述的甘露糖醛二酸寡糖组合物。

本发明涉及的甘露糖醛二酸寡糖组合物，包含具有式(Ⅲ)的甘露糖醛二酸或其药学上可接受的盐：

其中n为选自1-9的整数，m选自0，1或2，m’选自0或1，

并且其中，

n＝1-5的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合总重量的60％以上；

n＝1-2的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合总重量的低于60％。

本发明涉及的甘露糖醛二酸寡糖组合是不同聚合度的甘露糖醛二酸的混合物，其主要成分是聚合度为2至10的甘露糖醛二酸寡糖。已知在甘露糖醛二酸中，活性最高的糖为4-10糖，特别是6糖。但是，发明人现发现，在活性最高的4-10糖基础上添加一定比例活性较低的2-3糖，同等质量的给药剂量下，生物活性不降低甚至还有提高。不囿于任何理论，推测这可能是由于分子量较小的2-3糖虽然不能单独起效，但跟其他寡糖混合后能起到协同增效的作用。但当2-3糖的比例过高时，组合物的整体活性降低。因此，组合物中2-3糖的比例必须控制在一定的范围之内。

在实际制备过程中，氧化降解反应中会产生大量的2-3糖，通常会因其活性低，为避免影响到产品的药效，而将从产物中分离后去除。而基于发明人的上述发现，可以不需要氧化降解产物中的2-3糖分离除去，而只需控制氧化降解反应的条件，将2-3糖的比例控制在一定的范围之内，获得的组合物活性能达到甚至优于在先申请所公开的组合物，且因不用将2-3糖作为杂质去除，产品得率理论上也显著高于在先申请所公开的产品得率，大大降低生产成本，减少废弃物的排放，在实际生产中更容易实现，更易于实现工业化大生产。

根据一个优选的实施方案，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中m+m’＝1或2的甘露糖醛二酸的重量总和不低于所述组合物总重量的50％以上，优选60％-90％，更优选70％-90％。特别地，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中m+m’＝1的甘露糖醛二酸的重量总和不低于所述组合物总重量的10％，优选30-40％。在另一个优选实施方案中，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中m+m’＝2的甘露糖醛二酸的重量总和不低于所述组合物总重量的10％，优选30-50％。

根据一个优选实施方案，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中n＝1-5的甘露糖醛二酸寡糖的重量总和占所述组合物总重量的80-95％。

根据一个优选实施方案，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中n＝1-2的甘露糖醛二酸寡糖的重量总和所述组合物总重量的10-50％，优选25-50％。

根据一个优选实施方案，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中n＝1-3的甘露糖醛二酸寡糖的重量总和所述组合物总重量的20-70％。

根据一个优选实施方案，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中n＝1-3的甘露糖醛二酸的重量总和与n＝4-7的甘露糖醛二酸寡糖重量总和的比例在1.0-3.5之间，优选在1.0-3.0之间。

根据一个优选实施方案，本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合物中各聚合度甘露糖醛二酸寡糖在所述组合中的重量百分含量为：二糖5-25％，三糖15-30％，四糖15-28％，五糖5-25％，六糖2-20％，七糖2-20％，八糖2-20％，九糖2-20％，十糖2-20％。特别地，组合物中寡糖的重量百分含量为：二糖5-25％，三糖15-30％，四糖15-28％，五糖10-20％，六糖5-15％，七糖3-10％，八糖2-5％，九糖1-5％，十糖1-5％。更优地，组合物中寡糖的重量百分含量为：二糖10-20％，三糖18-30％，四糖15-28％，五糖15-20％，六糖5-10％，七糖3-5％，八糖2-5％，九糖1-3％，十糖1-3％。

本发明的甘露糖醛二酸寡糖组合中，其中所述药学上可接受的盐是钠盐或钾盐。

本专利申请的发明人发现，当上述9个具有新结构的寡糖按照一定的比例进行复配，可以得到高活性的寡糖组合物，其活性比活性最好的六糖还要高；尤其是添加了一定比例二糖和三糖的组合物，其活性高于不含二糖和三糖的组合物。高活性寡糖组合物中的各寡糖比例需要按照如下的比例关系进行组合：

组合物中n＝1-5的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合总重量的60％以上，优选80-95％。n＝1-2的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合总重量的低于60％，优选10-50％，更优选25-50％。n＝1-3的甘露糖醛二酸寡糖的重量总和所述组合总重量的20-70％。其中n＝1-3的甘露糖醛二酸寡糖的重量总和与n＝4-7的甘露糖醛二酸寡糖重量总和的比例在1.0-3.5之间，优选在1.0-3.0之间。

本发明所述用于治疗血管性痴呆的药物包含甘露糖醛二酸寡糖组合物，其包含具有式(Ⅲ)的甘露糖醛二酸或其药学上可接受的盐，以及一种或多种药学上可接受载体。本发明所述药物可以是片剂、硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊、微囊剂、颗粒剂、糖浆剂、注射剂、颗粒剂、乳剂、悬浮液、溶液和用于口服或非口服给药的缓释制剂的形式。

本发明所述药学上可接受载体是指本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体，本发明的药学上可接受载体包括但不限于：填充剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、助流剂、掩味剂、表面活性剂、防腐剂等。填充剂包括但不限于乳糖、微晶纤维素、淀粉、糖粉、糊精、甘露醇、硫酸钙等。润湿剂与黏合剂包括但不限于羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。崩解剂包括但不限于羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素等。润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇、月桂醇硫酸镁等。粘合剂包括但不限于***胶、藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、液体葡萄糖、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、硅酸铝镁、麦芽糖糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、预明胶化淀粉、藻酸钠、山梨醇、淀粉、糖浆和黄蓍胶。助流剂包括但不限于胶体二氧化硅、粉状纤维素、三硅酸镁、二氧化硅和滑石粉。掩味剂包括但不限于阿斯巴坦、甜菊苷、果糖、葡萄糖、糖浆、蜂蜜、木糖醇、甘露醇、乳糖、山梨醇、麦芽糖醇、甘草甜素。表面活性剂包括但不限于吐温-80、泊洛沙姆。防腐剂包括但不限于尼泊金酯、苯甲酸钠、山梨酸钾等。

本文使用的术语“治疗”一般是指获得需要的药理和/或生理效应。该效应根据完全或部分地预防疾病或其症状，可以是预防性的；和/或根据部分或完全稳定或治愈疾病和/或由于疾病产生的副作用，可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖了对患者疾病的任何治疗，包括：(a)预防易感染疾病或症状但还没诊断出患病的患者所发生的疾病或症状；(b)抑制疾病的症状，即阻止其发展；或(c)缓解疾病的症状，即，导致疾病或症状退化。

甘露糖醛二酸寡糖组合物

本发明所述用于治疗血管性痴呆的甘露糖醛二酸寡糖组合物，其包含具有式(Ⅲ)的甘露糖醛二酸或其药学上可接受的盐：

其中n为选自1-9的整数，m选自0，1或2，m’选自0或1，

并且其中，

n＝1-5的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合总重量的60％以上；

n＝1-2的甘露糖醛二酸的重量总和占所述组合总重量的低于60％。

在一个示例性的实施方案中，本发明所述用于治疗血管性痴呆的甘露糖醛二酸寡糖组合物的制备方法包括如下几个步骤：

(1)甘露糖醛二酸产品的制备：

M段中间体的制备。如前文所述，本发明中采用的原料M段中间体可以通过现有技术中已知的方法制备。例如中国专利申请No.98806637.8以及CN02823707.2所披露的方法。通常的方法可以简单描述为：将海藻酸初步降解后可得到聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸的混合多糖，混合多糖再经酸法沉淀后，可以除去其中的聚古罗糖醛酸，进一步精制可以得到纯度在90％以上的均聚甘露糖醛酸，即M段中间体。

臭氧氧化降解。在室温或者加热条件下使M段中间体溶解于适量的水中，搅拌，持续通入臭氧，反应开始进行。反应pH值可以通过滴加稀盐酸或者稀NaOH溶液调节至3-13之间，优选4-10，更优选6-8。温度优选为0-70℃，更优选10-45℃。反应完成以后，停止通入臭氧，调节pH至中性。

膜分离纯化。将上述所得的反应产物配成约10％浓度的溶液，通过分子截留膜分离，去除单糖以下的降解产物，收集未透过液。所采用的分子截留膜MWCO规格为1000Da-3000Da，优选2000Da。收集液经旋转蒸发仪浓缩、真空干燥即得寡聚甘露糖醛二酸混合物。经分析发现这些产品均是以二糖-十糖的寡糖且其含量是在一定比例范围的组合物。

实施例1-3示例性地示出该方法。

(2)单一聚合度寡糖的制备

将步骤(1)所得的寡糖混合物溶解，配成约10％左右的浓度，经P6凝胶色谱柱分离，紫外检测，收集各流出组分，合并相同聚合度的组分。收集到2-10糖的9个组分，分别经G10凝胶柱层析脱盐，旋转蒸发仪浓缩，真空干燥即得。一个具体的纯化制备过程见实施例4。这些柱层析、脱盐和干燥等操作是本领域技术人员所已知的。

将单一聚合度的寡糖分别用抗血管性痴呆动物模型评价药理活性，发现六糖的活性最好。

(3)寡糖组合物的活性比较

将本发明的寡糖组合物与经纯化的六糖比较药理活性，结果表明本发明的寡糖组合物以及对比试验样品均要明显比单一聚合度寡糖中活性最好的六糖还要好，而包含了二、三糖的组合物的活性略低于六糖。不囿于任何理论，认为寡糖经复配后能发挥协同增效的作用，当组合物中二-六糖的比例高于60％以上，且二、三糖的比例不高于60％时，组合物的活性最高；但二、三糖的比例超过60％时，组合物的活性也会降低。

动物模型及药效活性评价步骤

1、抗血管性痴呆的药效评价动物模型—双侧颈总动脉结扎(BCCAo)致血管性痴呆小鼠模型

双侧颈总动脉结扎(BCCAo)模型是经全脑缺血再灌注建立的本领域常用的血管性痴呆模型。

1.1动物分组与给药

取雄性C57BL/6小鼠，体重22±2g，随机分组：假手术组、30分钟双侧颈总动脉结扎(Bilateral Common Carotid Artery occlusion，BCCAo)模型组(简称30min BCCAo组)、给药组，每组10只。动物分组后，假手术组和30min BCCAo组小鼠灌胃蒸馏水，每天灌胃1次，连续灌胃5天后，进行BCCAo手术。给药组小鼠分别灌胃给予相应药物，每天灌胃给药1次，连续给药5天后，进行BCCAo手术。所述BCCAo手术是先以戊巴比妥钠麻醉各组小鼠；将模型组、给药组中小鼠双侧颈总动脉分离并结扎30分钟，然后去除结扎并缝合颈部伤口；将假手术组中小鼠双侧颈总动脉分离后不结扎，直接缝合颈部切口。BCCAo后24小时，各组小鼠按所述术前给药方案分别继续灌胃给予相应药物或蒸馏水，再各自连续给药23天。BCCAo后第7天进行避暗实验的测试，第13天开始Morris水迷宫测试，评价甘露糖醛二酸组合物对于小鼠学习记忆能力的改善作用。行为学测试结束后，处死小鼠，脑组织固定，通过HE染色等方法，评价小鼠经BCCAo后海马区神经细胞损伤情况及甘露糖醛二酸组合物对于受损神经元的保护作用。

1.2避暗实验测试

避暗实验用于检测小鼠空间辨别的学习记忆能力，空间定位的记忆障碍只有在海马或海马周围区域受到损伤的情况下才会出现。避暗实验箱是利用小鼠具有趋暗避明的习性设计的装置，一半是暗室，一半是明室，中间有一小洞相连，暗室底部铺有通电的铜栅，动物进入暗室即受到电击而逃回明室。将动物训练24小时后，再进行测试，从动物放入明室至首次进入暗室的时间即为避暗实验潜伏期。避暗实验潜伏期越长，逃避错误次数越少，表明动物记忆力越好。

1.3Morris水迷宫行为测定

Morris水迷宫(Morris water maze,MWM)实验是一种强迫实验动物游泳，学***台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学***台组成，水池上空通过一个数字摄相机与计算机相连接。实验前预先在水池中注入清水，水深15cm，水面高出平台表面0.5cm，加入牛奶使池水变为不透明，实验过程保持平台位置不变。Morris水迷宫行为包括如下两项测试指标。

(1)定位航行实验(place navigation)，用于测量小鼠对水迷宫学***台的路线图及所需时间，即记录其Morris水迷宫实验逃避潜伏期和游泳速度。所述Morris水迷宫实验逃避潜伏期是指从小鼠入水至找到站台的时间。Morris水迷宫实验逃避潜伏期越短，表明动物记忆力越好。

(2)空间搜索实验(spatial probe test)，用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后，间隔1天，撤去平台，将小鼠从同一个入水点放入水中，测其穿越原平台的次数。数据采集和处理由图像自动监视和处理系统完成。

2、抗血管性痴呆的药效评价动物模型—大脑中动脉结扎(MCAO)致血管性痴呆大鼠模型

大脑中动脉结扎(MCAO)模型是经局灶性脑缺血建立的本领域常用的血管性痴呆模型。

2.1动物分组与给药

取雄性Wistar大鼠，随机分组：空白对照组、假手术组、模型组(简称MCAO组)、给药组，每组10只。空白组、假手术组、MCAO组动物口服给予蒸馏水，褐藻胶寡糖组均口服给予所述相应剂量的褐藻胶寡糖。各组连续给药7天后，除空白组大鼠外，其余组中大鼠经水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，左侧卧位固定于鼠板上，于手术显微镜下沿外耳道与眼眦连线中点切开皮肤，暴露出颧弓，用小牵张器将磷状骨和下颌骨间距撑开，于颅骨底开一2mm×2mm的骨窗，撕开硬脑膜，暴露出大脑中动脉，用高频电刀电凝阻断一侧大脑中动脉造成局部脑缺血(假手术组动物仅暴露大脑中动脉，不进行电凝阻断)，逐层缝合切口。术中术后室温严格控制在24～25℃。术后各组继续依照各自术前给药方案给药或给予蒸馏水，术后第11天各组均进行Morris水迷宫实验。

在该实验中，各组大鼠每天训练1次，连续训练5天，即定位航行实验，记录动物找到平台所用时间(即Morris水迷宫实验逃避潜伏期)。约120秒未找到站台者，引导其按直线方向游向平台并在平台上站立30秒，诱导其学***台，将大鼠从入水点放入水中，记录第一次到达原平台时间以及穿越原平台的次数，即空间搜索实验。评价动物的学***台的时间。Morris水迷宫实验逃避潜伏期越短，表明动物记忆力越好。

本发明的优点在以下非限制性的实施例中进一步进行说明。但实施例中采用的具体材料及其用量，以及其他实验条件并不应理解为对本发明的限制。除非特别指明，本发明中份数、比例、百分比等均以质量计。

实施例

实施例1：

步骤1)：甘露糖醛二酸寡糖混合物的制备

如在先专利所披露的方法制备M段中间体，具体操作简述如下：将5Kg海藻酸钠配成约10％的溶液，加稀盐酸调pH至3.0左右，升温至80℃，搅拌，反应10hr，停止加热，冷却至室温后，加NaOH调pH值至9.0，再加稀盐酸回调pH至2.85，离心机5000rpm离心10min，收集上清，加HCl调pH至1.0，离心，收集沉淀，旋转蒸发仪浓缩，真空干燥得M段中间体1500g。称取500g M-段中间体，加蒸馏水溶解后，配成5L体积的溶液，NaOH调pH至6.5，水浴加热，控制反应温度到75℃。调节氧气钢瓶出口的气流量和臭氧发生器的功率，使得臭氧质量浓度流量达到8g/hr，通入反应液中。反应4hr后停止通入臭氧，加适量水调整溶液浓度至10％左右，以截留分子量为2000Da的超滤膜过滤，收集未透过液，旋转蒸发仪浓缩，真空干燥，得350g甘露糖醛二酸产品A。

步骤2)：甘露糖醛二酸产品A中各聚合度寡糖的比例和结构分析

精密称取100mg上述干燥的甘露糖醛二酸产品A，加水溶解配制成10mg/mL的浓度，过0.22um滤膜，做为供试样品溶液。采用Superdex peptide(GE公司)分子排阻色谱联用多角度激光散射(MALS，怀雅特公司)测定组合物中不同聚合度寡糖的比例。实验方法如下：

色谱柱：Superdex peptide 10/300Gl

流动相：0.1mol/L NaCl

进样量：10uL

流速：0.3mL/min

测试结果：二糖-十糖分别以dp2-dp10表示，分别为dp2为19％，dp3为25％，dp4为22％，dp5为13％，dp6为9％，dp7为6％，dp8为3％，dp9为2％，dp10为1％。

步骤3)：LC-MS分析甘露糖醛二酸产品A中各聚合度寡糖的结构

实验条件：

色谱柱：Superdex peptide 10/300Gl

流动相：20％甲醇+80％80mmol/L NH₄Ac

流速：0.1mL/min

柱温：25℃±0.8℃。

质谱条件：Agilent 6540QTOF；离子源：ESI碰撞电压120V；负离子模式。采集信号(m/z)宽度为100-1000。

各聚合度寡糖的质谱图见附图1-3所示。对质谱图中各信号峰进行归属，验证了产品A中所有寡糖的分子结构，即通式(Ⅲ)所示的结构。信号归属及该信号所对应的结构见下表1。

由上述质谱结构解析发现，产品A中糖链还原末端的甘露糖醛酸氧化为糖二酸结构(结构见通式Ⅲ)，该糖二酸可以是含6个碳(m+m’＝3)的甘露糖二酸结构，含量约为10％～30％，也可以是甘露糖二酸的脱羧产物，即5个碳(m+m’＝2)的糖二酸(30～50％)和4个碳(m+m’＝1)的糖二酸(30％～40％)。

实施例2：

称取100g实施例1中的M-段中间体，加蒸馏水溶解后，配成0.8L体积的溶液，NaOH调pH至4.0，室温25℃反应。调节氧气钢瓶出口的气流量和臭氧发生器的功率，使得臭氧质量浓度流量达到1g/hr，通入反应液中。反应10hr后停止通入臭氧，加适量水调整溶液浓度至15％左右，以截留分子量为1000Da的超滤膜过滤，收集未透过液，旋转蒸发仪浓缩，真空干燥，得80g甘露糖醛二酸产品B。

采用Superdex peptide(GE公司)分子排阻色谱联用多角度激光散射(MALS，怀雅特公司)测定B中各聚合度寡糖组分的比例。测定方法同实施例1中相关部分。测试结果：二糖-十糖分别以dp2-dp10表示，分别为dp2为20％，dp3为25％，dp4为19％，dp5为12％，dp6为9％，dp7为5％，dp8为5％，dp9为3％，dp10为2％。

实施例3：

称取100g实施例1中的M-段中间体，加蒸馏水溶解后，配成1.5L体积的溶液，NaOH调pH至9.0，水浴45℃反应。调节氧气钢瓶出口的气流量和臭氧发生器的功率，使得臭氧质量浓度流量达到3g/hr，通入反应液中。反应2hr后停止通入臭氧，加适量水调整溶液浓度至5％左右，以截留分子量为3000Da的超滤膜过滤，收集未透过液，旋转蒸发仪浓缩，真空干燥，得60g甘露糖醛二酸产品C。

采用Superdex peptide(GE公司)分子排阻色谱联用多角度激光散射(MALS，怀雅特公司)测定C中各聚合度寡糖组分的比例。测定方法同实施例1中相关部分。测试结果：二糖-十糖分别以dp2-dp10表示，分别为8％，dp3为20％，dp4为28％，dp5为19％，dp6为13％，dp7为6％，dp8为3％，dp9为2％，dp10为1％。

实施例4：

单一聚合度的甘露糖醛二酸寡糖的制备，方法如下：

1、样品准备：由实施例1中制备得到的甘露糖醛二酸产品A中取出300g，加水溶解，配置成1000mL的浓溶液，放置在4℃冰箱备用。每次使用时取出50mL加水稀释1倍后，用0.22um超滤膜抽滤。

2、色谱分离条件：色谱仪为AKTA pure 150(购置于GE公司)，配UV检测器和自动收集器。分离色谱柱：1.2kg BioGel P6(购于伯乐公司)用去离子水混合，真空脱气以后，手动填装到玻璃柱(10cm内径)中，纯水冲洗10倍柱体积以后，色谱柱床稳定，高度为1.0m。然后改用0.02M的NaCl溶液为流动相，平衡10倍柱体积以后，开始上样。

3、上样和分离：泵的流速设置为1mL/min，将100mL的样品溶液通过色谱仪自带的泵抽到色谱柱顶端后，切换到流动相，以5mL/min的流速洗脱，待死水体积部分流出以后，开始自动收集，每管收集50mL。

4、重复上样，20次重复制备以后，合并相同组分，旋转蒸发仪浓缩，冷冻干燥，得到二糖至十糖共9个单一聚合度的寡糖。

实施例5

组合物与六糖之间的药理活性评价，考察组合物中不同聚合度寡糖之间的协同增效作用及寡糖比例范围。

样品准备：

(1)组合物产品D：实施例4中制备得到的单一聚合度的甘露糖醛二酸寡糖，按照聚合度的大小从二糖到十糖准确称量，各糖取出的重量如下：二糖3.0g，三糖3.0g，四糖1.5g，五糖1.5g，六糖0.4g，七糖0.2g，八糖0.2g，九糖0.1g，十糖0.1g，混匀得10g组合物产品D。

(2)对比实验样品制备

参照在先专利CN106344592A实施例1和2披露的方法制备含四糖-十糖的混合物

称取1g多聚甘露糖醛酸钠盐(重均分子量8235Da，上海绿谷制药有限公司提供)，加入适量蒸馏水配成1％(重量百分比)的多聚甘露糖醛酸钠水溶液。用盐酸将所述1％的多聚甘露糖醛酸钠水溶液的pH值调节为4，然后将该水溶液置于高压釜中。在110℃温度下加热反应4小时。从高压釜中取出该反应后的溶液并使其冷却。冷却后，用NaOH溶液调节该反应后溶液的pH值得到中性液体。在搅拌条件下，将所述中性液体缓慢加入到该液体体积4倍体积量的乙醇中，进行醇沉并静置过夜。过滤分离醇沉所得固体物质，并在过滤分离时用无水乙醇洗涤过滤分离所得固体物质，最终得到白色滤饼。将该滤饼置于60℃烘箱中干燥，得褐藻胶寡糖粗品。

取5g褐藻胶寡糖粗品配成5％(重量百分比)的水溶液。通过向50ml的10％(重量百分比)氢氧化钠溶液中加入25ml的5％(重量百分比)的硫酸铜溶液并立即混匀制备得到新鲜氧化剂氢氧化铜。将该新鲜氧化剂氢氧化铜立即加入到40ml上述5％(重量百分比)的褐藻胶寡糖溶液中，同时通过沸水浴进行加热，直至不再有砖红色沉淀产生。将该反应体系进行离心处理以去除沉淀从而得到上清液。取少许上清液再次加入所述氧化剂，检查是否还有砖红色沉淀产生。若还有砖红色沉淀产生，则将上述离心所得全部上清液与另外部分的所述氧化剂继续进行反应，直至检验不再有砖红色沉淀产生为止。将最后得到的反应体系离心分离获得上清液。向上清液中加入4倍体积量的95％乙醇进行醇沉，并静置过夜。过滤分离醇沉所得固体物质，并用无水乙醇洗涤该固体物质。将所得固体物质置于60℃烘箱中烘干，得到式(II)所示褐藻胶寡糖粗品。

取上述褐藻胶寡糖粗品1g，配成10％(重量百分比)的水溶液，用95％乙醇溶液再次进行醇沉，过滤分离再次醇沉所得沉淀物并任选地用无水乙醇洗涤。分离该沉淀物并干燥，得到固体物质。将该固体物质配成5％(重量百分比)的水溶液，用3μm孔径膜过滤该水溶液并收集滤液。将该滤液在分子排阻色谱Bio-Gel-P6凝胶柱(1.6×180cm，购自Bio-Rad公司)上进行洗脱分离，作为流动相的洗脱液为0.2mol·L-1NH₄HCO₃。依次使用多个5毫升试管从该柱色谱收集洗脱液，然后用硫酸-咔唑法检测所述各集液管中洗脱液的糖含量。根据该检测结果分别收集含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液。将含有不同分子量褐藻胶寡糖组分的洗脱液各自分别减压浓缩并冷冻干燥，弃去组分1，得到分别具有不同分子量的式(II)所示褐藻胶寡糖组分2-12(n分别具有0-10的值)收集并合并n＝2-8的式(II)所示褐藻胶寡糖洗脱液并干燥，然后得到n＝2-8的式(II)所示褐藻胶寡糖混合物(四-十糖混合物)，作为对比实验样品。

采用Superdex peptide(GE公司)分子排阻色谱联用多角度激光散射(MALS，怀雅特公司)测定对比实验样品中各聚合度寡糖组分的比例。测定方法同实施例1中相关部分。测试结果：四糖-十糖分别以dp4-dp10表示，分别为dp4为10％，dp5为12％，dp6为13％，dp7为14％，dp8为15％，dp9为19％，dp10为17％。

实施例1、2、3中分别制备得到的产品A、B、C、本实施例中的产品D以及对比实验样品的寡糖比例如下表2所示。

表2甘露糖醛二酸寡糖组合物产品及对比试验样品中的寡糖百分比

以上A、B、C、D四个样品各取10g，按照“抗血管性痴呆的药效评价动物模型”所描述的方法，比较这些组合物与六糖(6T)及对比实验样品的药理活性。

1、双侧颈总动脉结扎(BCCAo)致血管性痴呆小鼠模型

1.1避暗实验测试结果

实验中，模型组与假手术对照组相比较，前者避暗实验潜伏期明显缩短，错误次数明显增加，说明模型组小鼠记忆能力明显下降，该评价模型造模成功。与模型组相比，各个给药组避暗实验潜伏期明显增加，错误次数明显减少，见附图4和5。

1.2Morris水迷宫测试结果

实验中，模型组与假手术组相比，小鼠的Morris水迷宫实验逃避潜伏期明显延长，说明BCCAo致小鼠血管性痴呆模型建立成功。与模型组相比，各个给药组逃避潜伏期明显缩短，见附图6。

水迷宫定位航行实验4天后，撤去平台进行空间探索实验，观测动物穿越平台次数。模型组与假手术组相比，小鼠穿越原平台的次数明显减少，说明BCCAo小鼠记忆能力明显下降，而各给药组小鼠穿越原平台的次数增加，见附图7。

2、大脑中动脉结扎(MCAO)致血管性痴呆大鼠的作用

实验中，模型组与假手术组相比，大鼠的Morris水迷宫实验逃避潜伏期明显延长，说明MCAO致大鼠血管性痴呆模型建立成功。与模型组相比，各个给药组逃避潜伏期明显缩短。

定位航行实验结束后，间隔1天，进行空间探索实验，观测动物2分钟内穿越平台次数。模型组与假手术组相比，大鼠穿越原平台的次数明显减少，说明MCAO组大鼠记忆能力明显下降，而各给药组小鼠穿越原平台的次数增加，见附图8。

实验结果表明，产品A、B、C的药效活性均好于对比实验样品，且好于之前预期的活性最高的单一聚合度的六糖，但产品D的活性弱于六糖。不囿于任何理论，推测组合物中各寡糖之间的比例对于产品的活性有显著影响，添加一定比例的二糖、三糖有协同增效作用，但当二糖、三糖的比例过高时则会降低组合物的活性。