阅读说明：本技术 分析遗传信息的方法 (Method for analyzing genetic information ) 是由 F·M·*** 于 2018-05-14 设计创作，主要内容包括：无需以纯化形式进行分离以及随后纵向株系跟踪的株系分型的系统和方法。该方法包括定位目标中存在的一个或多个遗传区域的步骤。遗传区域含有在目标的两个或多个变体(即株系)间变异的遗传位点。设备检测每个基因位点的独特序列。在取得具有遗传位点的生物材料样本后,该设备为目标中存在的遗传区域生成扩增子。扩增子与互补探针杂交,从而产生用于检测的杂交探针和非杂交探针。检测到的杂交探针分配以标识符。设备将标识符转换为模式。记录该模式并与记录的一个或多个其他模式进行比较,以确定该模式是否与一个或多个其他模式不同。(Systems and methods for strain typing without isolation in a purified form and subsequent longitudinal strain tracking. The method comprises the step of locating one or more genetic regions present in the target. The genetic region contains genetic loci that are mutated between two or more variants (i.e., strains) of interest. The device detects unique sequences at each gene locus. After taking a sample of biological material having a genetic locus, the apparatus generates amplicons for the genetic region present in the target. The amplicons are hybridized to complementary probes, thereby generating hybridized and non-hybridized probes for detection. The detected hybridization probes are assigned identifiers. The device converts the identifier into a pattern. The pattern is recorded and compared to one or more other patterns recorded to determine if the pattern is different from the one or more other patterns.)

分析遗传信息的方法

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求2017年5月15日提交的美国临时申请号62/506,054的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

发明的背景

1.发明的技术领域

本发明一般涉及核酸分析的系统和方法，更具体地，涉及从复合生物样品中分析核酸序列并使用所述分析来监视这些序列出现的系统和方法。

2.相关技术的描述

可以研究混合生物种群以确定有关种群的各种属性。在任何种群中可能存在不同组织层次上的子群。生物系统中最常见的组织结构是线性系统，其也可称为属-种系统。利用核酸分析，可以将线性系统细化以显示个体之间的差异或种群内非常密切相关个体之间的差异。例如，在某些生物体中，可能只在单个核酸序列中的单个核酸碱基存在差异，其可用于区分种群中单个物种的两个亚型。在种群中，遗传序列中一个或多个核酸碱基变化的个体称为亚型或株系。

从混合种群中识别特定的属、种或株系是重要的活动。最通常地，这种研究需要广泛、昂贵和耗时的程序来彼此分离和纯化活生物体，以便进行这种识别或鉴定。在许多情况下，纯化需要太长时间，某些种群不能在这个过程中生存下来，或者活生物体的留存可能对执行分析的技术人员有害。

目前的株系分型方法需要在对生物体进行分子表征之前对生物体进行纯化培养。这种分子表征可使用基于序列(包括多位点或全基因组)的方法、大限制性酶切消化(脉冲场凝胶电泳)技术或基于杂交(自动或手动核糖分型)的方法来进行。纯化菌株和进行分子鉴定的过程既漫长又昂贵。目前的方法对于不同细分市场也是冒险的。例如，如果食品制造商或医院识别到可直接与来自病人的分离物相比的分离物，他们可能招致重大责任。

此外，随着时间的推移，环境(食品生产、农业或卫生保健场所)或独立环境场所中特定菌株的留存，可能表明卫生设施出现故障。这种留存可导致生产的产品受到污染，或导致动物或人类患病。或者，特定序列的(随机或循环)定期出现提供了涉及某些生物体对环境反复入侵的信息。

目前，在不先从样品中分离出生物体的情况下，测试仪器无法从复合样品中提取和处理大量数据(即信息)以提供与这些菌株相关的详细信息。另外，常见的分子诊断方法只能在单次化验中检测到3-5个目标。这少量目标的信息不足以提供足够非常有用的菌株辨别能力。

因此需要一种系统和方法，用于处理来自环境的复合(即混合)生物样品并在无需特定识别分离物的情况下检测具体目标菌株存在。

发明内容

本发明特别涉及从复合生物样品中分析核酸序列并使用所述分析来监视这些序列出现的系统和方法。在一个实施例中，用于分析遗传信息的方法包含以下步骤：(i)定位目标中存在的一个或多个遗传区域，其中遗传区域含有在两个或多个目标变体间变异的遗传位点；(ii)提供配置成检测每个遗传位点的独特序列的设备；(iii)取得具有遗传位点的生物材料样品；(iv)生成目标中存在的一个或多个遗传区域的扩增子；(v)将扩增子杂交到遗传位点的一个或多个探针，其中一个或多个探针将杂交到遗传位点的变体，而一个或多个探针将不会杂交到遗传位点的变体；(vi)通过设备检测杂交到扩增子的每个探针；(vii)向每个杂交探针分配标识符，该标识符与分配给非杂交探针的标识符不同；(viii)通过设备将每个探针分配到的标识符转换为杂交探针的标识符模式并记录；(ix)将记录的模式与一个或多个其他记录的模式比较；和(x)确定记录的模式是否与一个或多个其他记录的模式不同。

在另一个实施例中，用于在复合生物材料中对目标生物体进行菌株分型的方法包含以下步骤：(i)通过设备，从复合生物材料中扩增含有可变遗传位点的核酸序列以生成扩增子；(ii)将扩增子杂交到遗传位点的一个或多个探针，在第一杂交阵列和第一微珠中的至少一个上，其中一个或多个探针将杂交到遗传位点的变体，而一个或多个探针将不会杂交到遗传位点的变体；(iii)检测在第一杂交阵列和第一微珠中的至少一个上的一个或多个杂交探针和一个或多个非杂交探针；(iv)向在第一杂交阵列和第一微珠中的至少一个上的每个杂交探针和非杂交探针分配标识符；(v)生成在第一杂交阵列和第一微珠中的至少一个上的一个或多个标识符的第一模式；(vi)将第一杂交阵列和第一微珠中的至少一个的第一模式与第二杂交阵列和第二微珠中的至少一个的第二模式比较；以及(vii)确定第一模式是否与第二模式不同。

附图说明

在说明书结尾处的权利要求书中，本发明一个或多个方面作为实例具体指出并明确要求保护。由以下描述结合附图可以明显看出本发明的上述和其他目的、特征和优点，其中：

图1是现有技术系统工作站使用的消耗性设备的示例性实施例的俯视图；

图2是从复合生物样品中分析核酸序列并使用该分析来监视这些序列出现的方法的示例性实施例的流程图；

图3是核酸序列与引物之间比对的示例性实施例的图示，核酸序列可用于选择用于制备杂交阵列或微珠的目标，引物为生成在阵列或微珠上与特定核酸序列结合的扩增子所需；

图4是利用微珠进行株系表征的细化方案的示例性实施例的图示；

图5A是使用杂交阵列进行株系表征的简化三位点细化方案的示例性实施例的图示；

图5B是另一使用杂交阵列进行株系表征的简化三位点细化方案的示例性实施例的图示；

图6A是9×3杂交阵列的示例性实施例的俯视图，其中所有可用变异遗传位点探针斑点与扩增子杂交，以及三个探针点用于相机定位以记录斑点的模式；

图6B是生物材料的9×3杂交阵列的示例性实施例的俯视图，其中显示仅7个变异遗传位点探针点与扩增子杂交，以及三个探针点可用于相机定位以记录斑点的模式，以及表示将斑点位置转换为二进制代码的表，所述二进制代码表示扩增子与其在阵列上已知位置的互补探针杂交的杂交事件的模式；

图7是一对杂交阵列的示例性实施例的俯视图，其具有与图6A和图6B中相同的探针位置布置和相机定位，这对杂交阵列由两种单独的生物材料产生，在两个阵列上显示出相同的扩增子杂交模式；

图8是一对杂交阵列的示例性实施例的俯视图，其具有与图6A和图6B中相同的探针位置布置和相机定位，这对杂交阵列由两种额外单独的生物材料产生，在两个阵列上显示出不同的扩增子杂交模式；

图9是食品***机构和流行病学家使用的目前对李斯特菌菌株分型代表性方法的时间线，相比于无需在纯化培养中分离的李斯特菌菌株分型方法的示例性实施例的时间线，还包括比较所生成模式的简化报告，其用于比较模式结果重复性或独特性；

图10是对六个李斯特菌菌株进行菌株分型方法的示例性实施例的图，其包括详细说明9×3示例性阵列上探针位置和探针类型的筛选键，以及另一种模式编码程序；

图11是6个不同的李斯特菌菌株生成的杂交阵列的俯视图，菌株先从纯化培养分析，然后掺入复合环境富集培养；和

图12是12个不同李斯特菌菌株生成的杂交阵列的俯视图，每个菌株从掺入负环境富集培养分析。

具体实施方式

参考以下附图中所示的非限制性实例，更全面地说明本发明的各个方面及其某些特征、优点和细节。省略对已知结构的描述，以免不必要地模糊本发明的细节。然而，应当理解，在说明本发明各个方面的同时，详细描述和特定的非限制性实例仅以举例说明的方式给出，而不是以限制性的方式。从本发明公开的内容看，在本发明基本发明概念的精神和/或范围内的各种替换、修改、添加和/或排列对于本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明是从复合生物样品中分析核酸序列模式出现并使用所述分析来监视由这些序列分析所生成模式的重复或变化。所述系统可以包含传统的工作站(包括耗材，例如图1所示的Rheonix Optimum^TM工作站中使用的墨盒(cartridge))，以及含有其试剂的试剂盒(未显示)。本发明实施例的示例性结构和功能方面类似于或包括美国专利号8,383,039中描述和说明的工作站及其耗材的元件。这些相似性应由本领域普通技术人员结合对本发明和附图的审查以及公开的专利来理解，在本文不再详细讨论。图1所示的消耗性设备(现有技术，例如墨盒)的俯视图与工作站接口，其是示例性实施例执行化验之处。该设备含有液体储层17，液体储层17含有与形成于液体储层17的底部的截断通道16连接的储层。液体储层17中的某些储层含有低密度核酸探针阵列47，用于扩增子与阵列探针的杂交。RheonixOptimum^TM工作站与墨盒偶联(如图1所示)，以自动方式执行本文所述方法的步骤。该系统和方法也可以使用其他方式代替杂交阵列来进行，例如每个含有独特标识符的微珠并将每个微珠偶联到它们自己的寡核苷酸探针，以便通过分析每个微珠和产生与在此生成模式相应的模式来完成杂交事件的分析。

现转至图2，其显示了用于分析复合生物样品的核酸序列并使用所述分析来监视由这些序列分析生成模式的重复或变化的方法100的流程图。在第一步102，对监视的目标生物体进行识别。这种目标生物体应具有至少两个遗传区域，其为目标生物所特有并且在目标生物体株系之间有所变化。为了直接从含有大量非目标菌群背景的样品中进行该方法，选择目标生物体所特有的遗传区域是至关重要的，因为即使在非目标基因物质过剩的背景下，这种独特的区域使得化验仅扩增目标生物体的遗传区域。

在下一步骤104中，对目标生物体的识别遗传区域内的遗传位点进行识别。在图3示出的实施例中，在所示遗传区域内，在6个目标生物体株系的变异位置1和变异位置2处显示有两个遗传位点变体(即，6个株系之间核酸序列上的变异位置1和变异位置2的碱基对不同)。如图3所示，为杂交事件每个潜在的结果分配标识符，例如二进制数字。如图3所示，6个变体中每个的第一位置的碱基对可以是AA、GC或GT。在示例中，碱基对AA分配以二进制数字“1”，而任何其他称为“非AA”碱基对分配以二进制数字“0”。类似地，6个变体中每个的第二位置的碱基对可以是GT或AA。在示例中，碱基对GT分配以二进制数字“1”，而任何其他称为“非GT”碱基对分配以二进制数字“0”。因此，两个位点通过二进制系统表现出变异，对于每个核酸序列总共有四种可能的二进制代码组合(“0,0”或“0,1”或“1,0”或“1,1”)。在图3所示的实施例中，有六个目标株系生成四种可能的二进制代码组合中的三种。例如，第一个株系兼有在第一位置的AA碱基对和在第二位置的GT碱基对；因此，第一个株系的二进制代码为“1,1”。另一方面，第六个株系在第一个位置为GT碱基对，在第二个位置为AA碱基对；因此，第六个株系的二进制代码为“0,0”。实施例进一步显示，在6个株系中产生3个模式。有两个“1,1”模式，一个“0,1”模式，三个“0,0”模式和零个“1,0”模式。重要的是，产生的模式并不能将株系1和2彼此区分，但它们确实将株系1和2与其他4个株系区分开。虽然株系4、5和6也没有彼此区分，但它们与株系1、2和3区分开。实际上，表现出这种变异选择的n个位点将提供多达2ⁿ(其中n＝位置数)个潜在模式。例如，本实例2个位点产生4种模式，3个位点产生8种模式，4个位点产生16种模式，5个位点产生32种模式，6个位点将提供64种潜在的杂交模式，为其准备探针的多个位点也是如此类推。具体变异位点和探针的选择必须确保探针能将变体分类为足够小的分组(每个分组代表一个模式)。在一个实施例中，足够小的分组最多将35％的目标生物体分类为任何一个组。然而，分组也必须足够大以使每个变体(即株系)不会分类到它自己的组中。换言之，基因位点和探针的选择必须使单个模式至多代表目标生物体的35％，而不是目标生物体的任何一个具体株系。

如步骤106所示，选择变异位置后，生成核酸引物以执行扩增反应以产生含有变异位置的序列的扩增子。在下一步骤108中产生核酸探针，并且按照图3所示的方式设计为与某些扩增子杂交而不与其他扩增子杂交，以生成每个位置的二进制结果。检测目标核酸序列需要使用具有与目标序列或其扩增子充分互补的核苷酸碱基序列的核酸探针。在选择性化验条件下，探针将与目标序列或其扩增子杂交，以允许操作者当目标序列存在于样品中时检测其存在。设计有效的探针以防止与任何会干扰检测目标序列存在的核酸序列的非特异性杂交。探针和/或扩增子可以包括可检测的标签，其中所述标签是，例如放射性标签、荧光染料、生物素、酶、电化学或化学发光化合物。在一些实施例中，杂交可以针对固定在微珠上的探针，在这种情况下，微珠也可以具有特定标签以识别微珠本身，或者使用对微珠和寡核苷酸标签结合的识别。在本文所述方法的实施例中，通过工作站的相机使用反向点杂交(RDB)检测目标序列的存在或不存在。工作站上的相机捕捉合成杂交阵列的图像，并在运行灰度图像处理程序的软件控制下，选择暗到足以表示成功杂交事件或不足以暗到表示成功杂交事件的杂交点。使用化验开发过程中生成的数据预设灰度值。然后成功的杂交赋予以标识符，该标识符可以是“1”或其他一些用于阵列上的位置的唯一标识符。不成功的杂交赋予以标识符，该标识符可以是“0”。

在下一步骤110，对生物材料来源进行化验。这种生物材料可以处于原生状态，这样其中所含的生物体不会彼此分离。在一个实施例中，生物材料来自纯化培养。在另一个实施例中，生物材料来自复合富集培养。在进行基于核酸的化验时，样品的制备是释放和稳定可能存在于样品中的核酸的首要和最关键的步骤。样品制备还可以有助于消除核酸酶活性，并去除或灭活核酸扩增或核酸检测的潜在抑制剂。系统工作站以自动化的方式执行所有样品制备步骤，而只需要一名技术人员执行(即用户执行)移液步骤。利用测试试剂盒和工作站，用户可以通过进行细胞裂解和核酸纯化(即DNA分离)来制备样品。在模式分型的另一实施例中，无需在纯化培养中完全分离和纯化目标生物体，样品制备包括在工作站上或离线执行的初步免疫磁化分离(immunomagnetic separation，IMS)以去除交叉反应品种。例如，对于特定目标生物(例如沙门氏菌)可能需要初步IMS。

在下一步骤112中，核酸(例如DNA)分离后，工作站无需用户的任何额外输入，将纯化核酸转移到特定核酸序列发生扩增的反应池中。从生物材料中扩增出特定遗传序列以获得生物材料的核酸序列。具体地，核酸扩增是核酸扩增子(即拷贝)的酶促合成，其包含与被扩增的核酸序列同源的序列。本领域应用的核酸扩增程序的实例包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、连接酶链反应(LCR)、核酸序列扩增(NASBA)、转录相关扩增(TAA)、冷PCR和非酶扩增技术(NEAT)，以及其他。

当样品中目标序列的含量很低时，核酸扩增尤其有益。通过扩增目标序列并检测合成的扩增子，可以大大提高化验的灵敏度，因为在化验开始时所需目标序列越少，越能更好地确保检测到属于目标生物体或病毒的样品中的核酸。在本文所述方法的实施例中，对具有株系间多态性的目标生物体的特定序列进行扩增。换言之，扩增目标生物体特异的序列，但也含有足够的差异使得检测和株系表征成为可能。也就是说，所选择的序列特异于目标生物体(不存在于其他属或种中)，但并非存在于目标属或种100％的株系中。选择和扩增足够的这些序列，从而能够区分目标生物体的株系。

现参见图4，其显示了基于微珠的形式。在所述实施例的基于微珠的形式中，可以将探针的每个变体添加到不同的荧光标记微珠中。微珠用于检测结合事件，通过照射微珠并使用检测微珠荧光特性和核酸探针连接荧光团特性的检测器对其进行分析，以确定存在哪些扩增子变体。在这种情况下，荧光微珠1将为其微珠和探针荧光团提供信号(阳性结果)，而荧光微珠2将仅为微珠提供信号，而不是为其探针荧光团提供信号(阴性结果)，因为不存在互补的扩增子。许多微珠/探针的结合类型可以高度复用以形成如本文所述基于模式类型的方案。

最终，利用具有足够复用能力的系统对上述生物材料产生的扩增子杂交进行分析，从而可以分析至少6个杂交探针(即至少64种模式)以确定由生物材料产生的扩增子的特异杂交的存在或不存在。如上述实例所示，可使用比色法、荧光法、射线检测法、电泳法、质谱法或任何其他此类识别分析方法得知扩增子与预定探针序列杂交的存在，这些方法可确定每个探针序列的杂交的不存在/存在。

例如，在本文所述方法的实施例的下一步骤114中，扩增子被其互补探针捕获(即杂交)。在探针捕获后，在随后步骤116，对杂交探针(和非杂交探针)进行检测。在一个实施例中，工作站上的相机通过对由于酶活结合到阵列上的扩增子而沉积的报告分子的变暗成像来检测结合DNA。如果没有制造扩增子产品(即，非杂交探针)，则给定斑点没有变暗。在另一实施例中，可使用合适的系统检测和分析带有杂交探针的微珠。在下一步骤118，系统基于如上所述成像软件的灰度阈值为每个探针位置分配标识符。在下一步骤120，将标识符转换为标识符的模式，并记录和存储该模式。

现转至图5A和5B，其显示了用于株系表征的简化三位点细化方案的示例性实施例的图示。在所述实施例中，有三个位点(或比图3所示多1个碱基对的位置，提供多达8种可能的探针杂交模式)用于区分目标生物体的株系。如上所述，当探针与扩增子杂交时，分配二进制数字“1”。类似地，当没有杂交时，分配二进制数字“0”。例如，如图5A所示，二进制代码模式是“1,0,1”，因为化验在第一探针位置和第三探针位置显示两个暗点，而在第二探针位置没有斑点(因此没有探针杂交)。在另一个实例中，如图5B所示，二进制代码模式是“0,0,1”，因为化验在第三探针位置显示一个暗点，而在第一和第二探针位置没有斑点(因此没有探针杂交)。

现参见6A和6B，其显示了9×3杂交阵列的示例性实施例的俯视图。图6A的杂交阵列显示所有可用于与扩增子杂交的探针，并且包含暗点间的参考点的排列(以圆形格子模式示出)。参考点用于工作站相机的定位以修正图像采集，并帮助验证化验是否正确执行。所使用的相机是安装在工作站中的常规相机，与美国专利号8,383,039中描述和说明的相机类似。这些相似性应由本领域普通技术人员结合对本发明和附图的审查以及公开的专利来理解，在本文不再详细讨论。杂交膜上的阵列以3列和9行的形式排列，使得相对于相机参考点，特定点始终在相同的位置。相机捕捉到的图像由在工作站上运行(或在与工作站连接的设备上运行)的软件程序进行处理并设计用于表征每个特定点的灰度。提供予软件具体的灰度值，高于该灰度值时，软件分配标识符(如“1”)表示杂交成功；低于该灰度值时，软件分配不同的标识符(如“0”)表示杂交失败。图6A中所有斑点都已杂交并将分配标识符“1”。

现转至图6B，其显示了源自生物材料样品的代表性杂交膜。在该方法的步骤120，分配给成功或不成功杂交的探针位置的标识符被转换为生物材料的标识符的模式(即代码)，并记录和存储该模式。图6B说明了这种模式，其显示与图6A所示相同的相机定位；然而，存在较少的表示杂交(或结合)事件的暗色阳性点。探针以与图6A使用的相同的行列形式排列。结合事件(即暗点)分配以二进制数字“1”，而非结合事件(即无点)分配以二进制数字“0”。分配的“1”和“0”在读取每行和阵列时生成二进制代码。生成的二进制代码代表特定样品中的所有杂交和非杂交事件。在图6B所示的实施例中，第一行具有二进制代码“1,0,1”，其中“1”代表对照点。第二行的二进制代码有二进制代码“0,1,1”，其中“1”表示第二列和第三列中的阳性暗点。因此，可以从左到右和从上到下读取生物材料的模式(即代码)。图6A-6B显示了具有24个可用探针的阵列，因为它是3列9行的阵列，提供27个探头，减去3个用于定位的探头。因此，在图6A-6B的阵列提供多达2²⁴或16777216个可能的模式。

现参见图7和8，其显示了由生物材料产生的杂交阵列的示例性实施例的俯视图。在该方法以下的步骤122，比较一个或多个杂交阵列的模式(即代码)。图7显示了由两种单独的生物材料产生的一对杂交阵列。每种样品生成的二进制代码(即模式)显示在每种样品相应的杂交阵列下。图7中每种生物材料的模式都是阵列中的阳性斑点，代表杂交事件。两种单独的生物材料间相同的二进制代码表明样品含有同一组变体。样品可以是同一株系或来自报告相同模式的两个不同株系(例如，参见图3的株系1和2)。从两种或多种样品持续产生的特定模式可能表明一个或多个株系在不变的种群中。在食品生产环境采样程序中，使用本发明开发的模式识别化验结果可用于通知对卫生标准操作程序(SSOP)进行修改以降低持续潜在的成品污染生物体的风险。这些生物体既可以是导致疫情暴发的病原菌，也可以是导致食品腐败相关的经济损失的质量生物体。

现转至图8，这是另一对单独的生物材料(也与图7中所示的那些不同)。图8中示出的单独的生物材料的二进制代码(即模式)不相同。在阵列上表明杂交事件的阳性暗点位置的不同证明了模式的差异。两种单独的生物材料间产生的不同模式，表明在单独的样品中存在不同组的变体以及一个或多个株系或种群的短暂性。因此，该方法的下一步，步骤124，确定了模式是否匹配或不同，从而将生物材料表征为持续性或短暂性。换言之，通过比较模式，可以确定一种或多种生物材料中是否存在一种或多种目标生物体的株系或种群(例如李斯特菌)。

如图6A-8所示，确定(步骤124)所分析的每种生物材料的模式后，最后步骤126包括生成有用的报告，该报告可以存储在适当的计算系统、数据库或任何其他适当的存储介质中，以便稍后与另一生物材料的分析进行比较。过去储存的模式库与新获得的模式库之间的比较提供了识别生物材料样品之间的相似性和差异的方法。这种比较对于许多领域的病原体的检测具有重要意义。例如，如果在纵向采集的食品制造设施环境、初级生产或食品样本中发现重复模式(例如，如图7所示的重复模式)，则目标生物体很可能是持续性种群。另一方面，如果从纵向采集的样本中发现存在不同的或短暂的模式(如图8所示)，则目标生物体很可能是不同的种群，并且来自不同的群落。

现转至图9，其显示了目前李斯特菌菌株分型方法的时间线，相比于在复合富集培养中的株系分型李斯特菌而无需在纯化培养中分离的方法的示例性实施例流程图。总言之，目前李斯特菌菌株分型方法从富集样品步骤开始，需要大约1-2天。接下来，需要几个小时进行分子诊断筛选试验。然后进行培养分离，大约需要3-4天。最后，在1-7天的过程中对培养物进行分子菌株分型。因此，目前李斯特菌菌株分型方法的总时间线为约5-13天。

仍参见图9，将目前李斯特菌菌株分型的方法与本发明的示例性实施例进行比较。无需在纯化培养进行分离，从复合富集培养中对李斯特菌菌株进行分型的方法大大缩短了完成菌株分型所需的时间。与目前方法相似，示例性实施例需要富集样品，大约需要1-2天。在此后的1-4小时内进行分子诊断筛选试验。然而，本发明优于目前菌株分型方法之处在最后步骤。根据图9所示的示例性实施例，可在至多5小时内从富集培养中直接进行菌株分型。因此，使用本发明将目前分离培养和从中分子菌株分型方法所需的4-11天压缩至5小时。最终，相比于目前的需要5-13天的方法，从复合富集培养中进行菌株分型而无需分离培养的方法的示例性实施例需要约2-3天。图9还显示了一份三样本简化报告，其表示样本1(S1)和样本2(S2)是新的唯一模式，而样本3(S3)是先前生成模式。

现参见图10，其显示了用于对六个李斯特菌菌株进行菌株分型的方法的示例性实施例的图示。图中显示了两个不同种的总共六个不同菌株的李斯特菌。血清型行表示传统菌株分型方法的结果。如菌株行所示，本发明可以区分两个不同菌株，这两种菌株用血清型方法时认为是相同的(模式7)。使用本发明的系统和方法的杂交化验在血清型结果的下行中示出。

如图10所示，来自本发明的系统和方法的杂交化验结果显示四个模式(6、7、10和19)。两个模式(7和19)对于分离菌株是相同的模式。使用所示“筛选键”来转换模式。筛选键显示了相机定位点(或参考点“RS”)、两个化验对照点(MM1和MM2)、两个品种识别点(Lm-ctr和L-spp-ctr)并为杂交阵列上的其它潜在点位置分配数值。通过将杂交阵列与筛选键进行比较(通常由相机和图像处理软件执行)，将阵列转换为数字代码。例如，对于菌株4，阵列被转换为模式代码6、12、18、20，然后进一步转换为模式数字10。本示例所示的20点阵列可产生多达2²⁰个或1048576个可能的模式。

系统的用户接收测试的每种生物材料产生的数字代码(即模式)或其报告。根据这些模式，用户可以确定生物材料是否具有相同的李斯特菌群或不同的李斯特菌群。如果用户在测试来自相同或不同位置的多个生物材料时继续观察到相同的模式，则用户知道重复模式代表相同的李斯特菌群。仅通过数字代码，用户就有足够的认识对其卫生标准作业程序(SOP)进行快速科学修改，以助于生产安全的成品。

因为仅接收模式减少了用户在使用其他亚型方法时承担的责任，所以对用户有利。特别是美国食品和药物管理局(FDA)要求报告特定的李斯特菌菌株。然后FDA会公布存在所报告的李斯特菌，在报告菌株所在地停止生产和其他活动，并代表用户要求采取各种合规措施。因此，数字代码为用户提供了足够的信息，以便无需知道具体菌株就能知道是否存在常驻菌群或短暂菌群，从而限制了用户接触强化的FDA法规。

现转至图11，其示出了杂交阵列的俯视图，该杂交阵列产生于将纯化培养的李斯特菌菌株与复合环境富集的李斯特菌菌株之间的化验性能进行比较。图11所示的两组杂交阵列对于所示每个纯化培养或复合富集的特定菌株具有相同的模式。至于复合富集，将李斯特菌人工引入预富集李斯特菌的负环境富集中。具体地说，将纯化培养样品中相同的李斯特菌复制物接种到预富集并且对目标生物体存在呈阴性的环境样品中。使用本发明的系统和方法分析掺入的环境富集。结果，杂交阵列在不同生物体混合的环境中检测到李斯特菌并进行菌株分型。图11证明了，当测试纯化培养中所用的分离物和当从环境中提取生物材料进行时，本发明的系统和方法产生了相同的模式。因此，图11证实不再需要当前方法目前和常规所执行的培养分离和分子菌株分型，显著减少了对生物材料菌株分型的所需时间。

现转至图12，其显示了从12个掺入预富集李斯特菌负环境富集的李斯特菌菌株产生的杂交阵列的俯视图。这些阵列证实本文的方法可以将12个菌株分类为10个单独的模式。注意到图11中使用的菌株在增加了六个额外菌株的图12中再次重复使用。这些阵列表明，确定从特定可变位点组中遗传区域的谨慎选择提供了一种稳健的方法，该方法基于使用本文方法分析位点产生的模式，将居住在种群中的李斯特菌群体分类为可操作信息。由于存在于富集样品中的李斯特菌在进行分子分型前不需要在纯化培养中分离，因此该结果可用于比目前可用方法更快地就卫生程序作出决定。这种方法还将大大降低执行分子分型作为环境监测计划部分的成本，从而使更广泛的食品生产商能够采用先进的分子菌株表征。

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)，术语“一(a)”和“一(an)”以及“所述(the)”和类似术语的使用应解释为包括单数和复数两种情况，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，术语“包含(comprising)”、“具有(having)”、“包括(including)”和“含有(containning)”应解释为开放式的术语(即，意指“包括，但不限于”)。术语“连接”应解释为部分或全部包含在、附属于或结合在一起，即使存在干预因素。

除非本文中另有说明，否则本文数值范围的叙述只是旨在充当在各自提及范围之内每个离散值的速记方法，且每个离散值如同前述方式各自合并到说明书中。

除非本文另有说明或与上下文有明确矛盾，本文所述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。本文中任何和所有示例的使用，或示例性语言(例如“诸如(such as)”)，仅仅是旨在更好地说明本发明的实施例，而不是本发明的的范围限制，除非另有说明。

说明书中的任何语言都不应该解释为表示任何不要求保护的要素，而是实现本发明所必要的。

本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种修改和变型。本发明并不旨在将本发明限定于所公开的一种或多种特定形式，但相反，其旨在涵盖如所附权利要求所定义的属于本发明精神和范围内的所有修改、替代结构和等效物。因此，本发明旨在涵盖本发明的修改和变型，条件是他们在所附权利要求及其同等权利要求的范围内。