发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠的游离DNA单链含量测定的方法，本发明方法可以对血清样品中游离DNA单链含量直接进行测定。

具体的，本发明的技术方案如下：

本发明第一个方面公开了一种肽核酸探针，其中，所述肽核酸探针中的核酸部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽核酸探针中的肽部分序列如SEQ ID NO：2所示；优选的，通过聚乙二醇连接所述核酸部分和肽部分得到肽核酸探针。

应当理解，与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列具有90%以上（例如92%、95%和98%等）同源性，且功能相同的序列均在本发明的保护范围之内。

本发明第二个方面公开了上述的肽核酸探针在同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量方法中的应用。

本发明第三个方面公开了一种同位素稀释质谱法定量检测游离DNA单链含量的方法，包括：

S1：将合成的肽核酸探针配成溶液后，将合成的同位素标记多肽配成溶液作为内标；

S2：将生物素化的游离DNA单链与链霉亲和素磁珠反应，形成游离DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物；

S3：加入肽核酸探针捕获所述游离DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物，然后对所述游离DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物进行酶解，将酶解产物固相萃取后复溶，定量检测；

S4：以不同浓度DNA标准品为横坐标，以肽核酸酶解肽段与同位素标记酶解肽段峰面积比为纵坐标建立标准曲线，根据二者峰面积比间接计算样本中DNA含量；

S5：修正DNA浓度得到最终浓度值。

应当理解，本发明中的方法并不限于上述步骤，在S1之前、S1与S2之间、S2与S3之间，S3与S4之间、S4与S5之间、S5之后，本领域技术人员可以根据需要，增加其他额外的步骤，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，所述步骤S1之前还包括步骤S0：将合成的游离DNA单链配成系列浓度标准溶液，用于建立标准曲线。

优选的，在S1中，所述肽核酸探针中的核酸部分序列如SEQ ID NO：1所示，所述肽核酸探针中的肽部分和所述多肽的序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，在S1中，采用¹³C和¹⁵N双标所述多肽中的亮氨酸。

优选的，在S3中，加入序列修饰级胰蛋白酶对所述游离DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物进行酶解，将酶解产物进行固相萃取，并用氮气吹干萃取物，而后将萃取物复溶；将复溶后样品进行HPLC-MS/MS定量检测。

更优选的，将复溶后样品采用岛津Nexera X2高效液相色谱系统和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪进行定量检测。

优选的，在S1和S2之间还包括如下步骤：将游离DNA单链进行生物素化，并评定生物素化效率；优选的，在S5中，计算酶解效率、SPE回收率，并根据生物素化效率、酶解效率及SPE回收率修正DNA浓度。

本发明第四个方面公开了上述的方法在基因领域中的应用。

本发明要解决的技术问题是提供一种安全可靠的游离DNA单链含量测定的方法，本发明方法可以对血清样品中游离DNA单链含量直接进行测定。

在本发明的一具体实施例中，上述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，包括如下步骤：

（1）将合成的游离DNA单链配成系列浓度标准溶液，用于建立标准曲线；

（2）将合成的肽核酸探针配成溶液，用以捕获游离DNA单链；

（3）将合成的同位素标记多肽（序列同肽核酸探针中肽段）配成溶液作为内标；

（4）将游离DNA单链进行生物素化，并评定生物素化效率；

（5）将上述生物素化的游离DNA单链与链霉亲和素磁珠反应，形成游离DNA单链-生物素-链霉亲和素磁珠复合物；

（6）加入肽核酸探针捕获游离DNA单链-生物素-链霉亲和素磁珠复合物，磁性分离去除未结合探针；

（7）加入序列修饰级胰蛋白酶对上述复合物进行酶解，将酶解产物进行固相萃取，并用氮气吹干萃取物，而后将萃取物复溶；

（8）将复溶后样品进行HPLC-MS/MS定量检测；

（9）以不同浓度DNA标准品为横坐标，以肽核酸酶解肽段与同位素标记酶解肽段峰面积比为纵坐标建立标准曲线，根据二者峰面积比间接计算样本中DNA含量；

（10）计算酶解效率、SPE回收率，并根据生物素化效率、酶解效率及SPE回收率修正DNA浓度。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（1）具体包括如下步骤：游离DNA单链合成量为2OD值，在其中准确加入380μL DEPC水，配制成浓度为20μmol/L的游离DNA单链溶液至2.0mL离心管中。取100μL，并在其中加入900μL DEPC水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至2.0mL离心管中，每管分装100μL，并将分装好的游离DNA单链溶液置于-70℃冰箱保存。使用前，用DEPC水将贮存液稀释成系列浓度用于建立标准曲线。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（2）具体包括如下步骤：肽核酸探针序列为5’-GTGTAATTGGTCTCCGGAAACTTTAAC-3’-PEG2-GDRALFVGEPNR，其中5’-gtgtaattggtctccggaaactttaac-3’（SEQ ID NO：1）为探针核酸部分，与游离DNA序列5’-cacattaaccagaggcctttgaaattg-3’ （SEQ ID NO：3）互补配对；GDRALFVGEPNR（SEQ ID NO：2）为探针肽部分，其特征是非人类任何蛋白胰酶水解后的特异性肽段，包含胰酶水解位点精氨酸R；PEG2（聚乙二醇）连接核酸与肽。肽核酸探针合成量为20nmol，准确加入1mL超纯水，配制成浓度为20nmol/mL（即20μmol/L）的肽核酸探针溶液，每管分装100μL，然后在各管中加入900μL超纯水稀释至浓度为2μmol/L作为贮存液并分装至2.0mL离心管中，每管分装100μL，并将分装好的肽核酸探针溶液置于-70℃冰箱保存。使用前，用超纯水将2μmol/L肽核酸探针贮存液释至0.05μmol/L（即50nmol/L）作为工作液。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（3）具体包括如下步骤：将合成的1mg同位素标记的多肽GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR（¹³C和¹⁵N双标亮氨酸L）首先用300μL乙腈超声溶解，然后加入700μL超纯水配制成浓度约为1mg/mL的同位素标记多肽贮存液并分装至2.0mL离心管中，每管分装100μL；取其中1管加入900μL超纯水稀释至约为0.1mg/mL并分装至并2.0mL离心管中，每管分装100μL；取其中1管加入900μL超纯水稀释至约为0.01mg/mL并分装至并2.0mL离心管中，每管分装100μL；取其中1管加入900μL超纯水稀释至约为0.001mg/mL（即1mg/L）并分装至并2.0mL离心管中，每管分装100μL作为贮存液置于-70℃冰箱保存。使用前，在100μL 1mg/L肽段贮存液中加入2900μL超纯水使其稀释30倍，得到内标肽段工作液浓度约为24.93nmol/L（内标肽段分子量1337.5g/moL）。

所述步骤（4）具体包括如下步骤：使用Biotin 3’ DNA Labeling Kit 试剂盒对游离DNA单链进行生物素化，①解冻试剂盒中所有组分，除末端脱氧核苷酸转移酶（TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT），解冻后置于冰上；②配置TdT稀释液：使用1× TdT反应缓冲液稀释TdT储存液至工作浓度1.5 U/µL（2µL 5× TdT反应缓冲液+7µL超纯水+1μL15 U/µL TdT储存液），现配现用；③进行标记反应，并将反应体系轻轻混匀，禁止涡旋。见表1：

表1 准备DNA连接反应

④将反应体系在37°C孵育30min；⑤加2.5μL 0.2M EDTA终止反应；⑥在每个反应管中加50μL 氯仿：异戊醇（体积比24:1）提取TdT，快速涡旋，然后在微量离心管中高速离心1-2 mins分离各相，将上层水相移出并保存，待使用。

DNA生物素化效率：1）配置RNA酶free的1TE缓冲液：用DEPC水稀释20TE缓冲液， 具体步骤：10mL 的20TE缓冲液+190mL 的DEPC水，用1TE缓冲液平衡正电荷尼龙膜至少 10min；

2）用TE缓冲液20倍稀释Biotin Control Oligo （1μM）和 Unlabeled ControlOligo （1μM）贮存液成50nM 工作液 (如2μL Control Oligo + 38μL TE, pH 8.0)；

3）在微量离心管中，准备系列浓度核酸标准液，见表2：

表2 准备系列DNA标准品

4）标准品准备：在96孔板中A1-A5位置加50μL上述DNA单链标准液；

5）样品准备：在微量离心管中，用TE缓冲液10倍稀释表1中生物素化DNA单链（如6μL生物素化DNA单链+54μL TE, pH 8.0），在96孔板中A6-A8位置加50μL生物素化DNA单链样品（一式三份）；

6）取25μL（A1-A8孔）倍比稀释至B1-B8孔，稀释液为TE缓冲液，依次类推，直至E1-E8孔，每个标准品和样品各5孔；

7）将平衡过的膜放在一张干净、干燥的纸巾上。将多余的缓冲液吸干，但是要避免让膜干掉；

8）吸取2μL样品和标准品到正电荷尼龙膜上，并使其吸收；

9）UV交联膜：把膜放在312nm的UV灯下交联10-15min，即把膜放入超净台中照紫外灯；

10）在37-50°C水浴箱将Blocking Buffer（封闭缓冲液）和4Wash Buffer（洗涤缓 冲液）缓慢复温至所有颗粒溶解。上述缓冲液可在室温和50°C之间正常使用，Substrate Equilibration Buffer（底物平衡缓冲液）可在4°C和室温之间正常使用；

11）封闭膜：将膜放入一个干净的容器中，并将容器放在摇床上，在容器中加入16mL Blocking Buffer（封闭液）轻柔摇摆孵育15min；

12）准备conjugate/blocking buffer（共轭/封闭缓冲液）溶液：加50µLStabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate（稳定的链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物）到16mL Blocking Buffer中（1:300稀释）；

13）将之前封闭膜的blocking buffer（封闭液）轻轻倒出，加入16mL步骤3中配置的conjugate/blocking buffer溶液，轻柔摇摆孵育15min；

14）准备1wash solution：加40mL 4Wash Buffer到120mL超纯水中；

15）将膜转移到一个新的容器中，用20mL 1wash solution简单冲洗；

16）将膜放入干净容器中，用20mL 1wash solution清洗膜5min，共4次，清洗方式 是在摇床轻柔摇摆；

17）将膜转移到一个新的容器中，加30mL 的 Substrate Equilibration Buffer，轻柔摇摆孵育5min；

18）准备Chemiluminescent Substrate（化学发光底物） 工作液：加 6mLLuminol/Enhancer Solution（鲁米诺/增强剂溶液）到 6mL Stable Peroxide Solution（稳定的过氧化物溶液）中。注意：暴露到阳光或任何强光中都能损害该工作液。短期暴露于实验室灯光下对该工作液无损害；

19）从膜从 Substrate Equilibration Buffer中拿起，将边缘放置在一张纸巾上去除多余的缓冲液。将膜放在一个干净的容器中或置于平滑表面的塑料保鲜膜上；

20）将Chemiluminescent Substrate（化学发光底物） 工作液倒在膜上使完全覆盖膜，静止孵育5min；

21）将膜从Chemiluminescent Substrate 工作液中取出，并将边缘放置在纸巾上2-5秒去除多余的缓冲液，注意不能使膜变干；

22）用保鲜膜将膜包裹起来，注意避免气泡和皱褶。 将膜放入BIO-RAD ChemiDoc^TMXRS+ Imaging System中检测信号强度。以上述表2中五个标准生物素化效率（100%、75%、50%、25%和0%）为横坐标，以各标准品对应的饱和信号强度为纵坐标建立标准曲线，然后将样品饱和生物素化信号强度代入上述方程得样品生物素化效率。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（5） 具体包括如下步骤：①将磁珠瓶置于漩涡振荡器上20s，振荡重悬磁珠；②用移液器移取20μ L（10mg/mL，相当于0.2mg）磁珠到2.0mL新离心管中，将离心管置于磁性分离器上，静置1min （此操作后续简称磁性分离），用移液器吸去上清液，从磁性分离器上取下离心管；③加1mL Buffer I（10mM Tris-HCl（pH 7.5），1mM EDTA，1M NaCl，0.01%～0.1% Tween-20）到离心管 中，盖上离心管盖，充分振荡重悬磁珠，然后磁性分离，移去上清液；④重复步骤3一次；⑤加 入500μL用Buffer I稀释的生物素化核酸（使磁珠浓度为0.4mg/mL），充分振荡重悬磁珠，将 离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合30min；⑥磁性分离，将上清液移至新的离心管； 按步骤3的方法洗涤磁珠3次，得DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（6）具体包括如下步骤：在上述游离DNA单链-生物素-链霉亲和素磁珠复合物中分别加入1mL杂交缓冲液（10 mM Tris，100 mM KCl，1 mM MgCl₂，pH 7.4）和20μL肽核酸探针溶液（0.05μmol/L），置于杂交仪中65℃杂交16h，以形成肽核酸探针-DNA-生物素-链霉亲和素磁珠复合物。然后用PBS清洗复合物并磁性分离，去除上清，反复多次，尽量将未结合的肽核酸探针去除，获得纯净肽核酸探针-DNA单链-生物素-链霉亲和素磁珠复合物。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，其中，所述步骤（7）具体包括如下步骤：①用950μL超纯水重悬上述肽核酸探针-DNA单链-生物素-链霉亲和素磁珠复合物；②加入50μL同位素标记多肽工作液（24.93nmol/L）；③加入10μL胰酶（0.04μg/μL），置于37℃酶解4h。由于胰酶可特异性水解精氨酸R与其它氨基酸羟基所形成的肽键，因此胰酶可将上述复合物水解成5’-GTGTAATTGGTCTCCGGAAACTTTAAC-3’-PEG2-GDR和ALFVGEPNR，将同位素标记多肽水解成GDR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；④将酶解产物用Sep-pakC18 cartridges (60mg, 3mL)固相萃取柱进行纯化富集ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR。Sep-pak C18 cartridges固相萃取柱首先用3mL甲醇和3mL超纯水分别活化和平衡柱子，然后加入酶解产物，再用2mL超纯水清洗柱子，最后用1mL含0.2% 甲酸的甲醇溶液萃取ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR；⑤将上述萃取物用氮气吹干；⑥吹干后加入400μL 0.1%甲酸水溶液复溶ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR多肽混合物。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，所述步骤（8）具体包括如下步骤：采用岛津Nexera X2高效液相色谱系统和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪，使用Symmetry Shield^TM RP18（2.1×150mm, 3.5μm）色谱柱在40℃条件下进行色谱分离。流动相为：A：含0.1%甲酸的水溶液；B：含0.1%甲酸的甲醇溶液；流速为0.2 mL/min；进样量10μL；按照如下的梯度进行洗脱：B 5%（0-0.1min）→B 35% (0.1-3min)→B 80% (3-3.1min)→B 80% (3.1-5min)→B 5% (5-5.1min)→B 5% (5.1-8min)。选用正离子多反应监测（MRM）模式，监测ALFVGEPNR和A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR两条多肽的信号强度。质谱系统的离子源为电喷雾电离源（ESI），喷雾电压5500 V；雾化压力（Nebulizer pressure）55 psi；雾化温度550℃；雾化气流10 L/min；Q1和Q3质量选择器均设定在单位质量分辨率；用于定量分析的离子分别为 m/z 501.0→571.4/501.0→670.5（ALFVGEPNR）和 m/z 505.5→572.2/505.5→671.4（A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR）；碰撞能量CE均为23eV；去簇电压DP为100V。所有数据均通过AB Sciex MultiQuant工作站软件（3.0.2版）采集和处理。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，所述步骤（9）具体包括如下步骤：①建立标准曲线，用DEPC水将浓度为2μmol/L的游离DNA单链贮存液稀释成以下系列浓度：200nmol/L、100nmol/L、50nmol/L、10nmol/L和1nmol/L，然后按步骤（4）～（8）具体步骤进行操作，采用岛津Nexera X2高效液相色谱和AB Sciex 5500三重四级杆液质联用仪对萃取多肽产物ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR的峰面积进行测定，以游离DNA单链浓度为横坐标（x）、上述两条多肽峰面积比（y）为纵坐标建立标准曲线，曲线方程为y=0.002x+0.4173（R ²=0.956）；②定量游离DNA单链时，将萃取出的肽核酸ALFVGEPNR和同位素标记多肽A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR峰面积比代入上述曲线方程，即可计算得样品中游离DNA单链含量。

本发明所述同位素稀释质谱法测定游离DNA单链含量的方法，所述步骤（10）具体 包括如下步骤：①评估SPE回收率，取400μL同位素标记肽（24.93nmol/L）作为对照组；另取 400μL同位素标记肽（24.93nmol/L）经Sep-pak C18 cartridges进行固相萃取，过程同步骤 （8），然后加入400μL 0.1% 甲酸水溶液复溶（实验组），分别将对照组和实验组样品进行 HPLC-MS/MS检测。用于定量分析的离子对为 m/z 669.1→572.2/669.1→671.4（GDRA [¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR）；碰撞能量CE均为44eV；去簇电压DP为100V。所有数据均通过AB Sciex MultiQuant工作站软件（3.0.2版）采集和处理。通过比较二者峰面积比计算SPE回收率，即 SPE回收率(%)=（SPE后内标肽峰面积/未经SPE内标肽峰面积）×100%；②评估酶解效率，取 内标肽段工作液（24.93nmol/L）1mL，加入10μL胰酶（0.04μg/μL）置于37℃酶解4h，然后按上 述步骤进行SPE、吹干和复溶，然后进行HPLC-MS/MS检测，用于定量分析的离子对分别为 m/ z 669.1→572.2/669.1→671.4（GDRA[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR，原始肽段）和m/z 505.5→572.2/ 505.5→671.4（A[¹³C₆ ¹⁵N]LFVGEPNR，酶解肽段）。酶解效率(%)=[酶解肽段峰面积/（酶解肽段 峰面积+原始肽段峰面积）]/SPE回收率×100%；根据生物素化效率、SPE回收率和酶解效 率修正DNA浓度。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

与现有技术相比，本发明方法的优点如下：

本发明方法基于同位素稀释质谱技术对样品中游离DNA单链直接进行定量，且对生物素化效率、SPE回收率和酶解效率均定量，使DNA定量结果准确可靠；在测定过程中无需对DNA单链进行扩增，避免了扩增效率的影响；并且岛津Nexera X2高效液相色谱系统和ABSciex 5500三重四级杆液质联用仪可容纳大约100个样本同时检测，分析速度和分析通量显著优于普通方法。