转化dna回收率的检测方法及引物
阅读说明：本技术 转化dna回收率的检测方法及引物 (Detection method and primer for recovery rate of converted DNA ) 是由 刘蕊 王辉 于 2019-11-22 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种检测DNA回收率的方法,包括：1)用引物对DNA样品进行qPCR,获得转化的Ct值,其中所述DNA样品经转化以使未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基,所述引物识别所述DNA样品中的无胞嘧啶碱基DNA片段；和2)使用所述Ct值以及用所述引物对未转化的DNA样品进行qPCR所获得的Ct值计算DNA回收率。所述方法还包括：用识别转化后DNA的引物对经转化的DNA样品进行qPCR,获得Ct值,然后评估步骤2)中的DNA回收率。(The invention provides a method for detecting DNA recovery rate, which comprises the following steps: 1) performing qPCR on a DNA sample transformed to convert unmodified cytosine bases to uracil bases with primers that recognize cytosine base-free DNA fragments in the DNA sample, obtaining transformed Ct values; and 2) calculating DNA recovery using the Ct value and the Ct value obtained by qPCR of the untransformed DNA sample with the primers. The method further comprises the following steps: qPCR of the transformed DNA sample with primers recognizing the transformed DNA to obtain Ct value, and then the DNA recovery rate in step 2) was evaluated.)
技术领域
本发明涉及经历胞嘧啶转化的DNA回收率的检测领域。
背景技术
胞嘧啶转化例如亚硫酸氢盐转化，是利用亚硫酸氢盐化合物处理DNA，将其未经修饰(例如甲基化修饰)的胞嘧啶碱基(C)转化为尿嘧啶(U)，进而在后续PCR扩增中转化为胸腺嘧啶(T)，而甲基化修饰的胞嘧啶保持不变的体外化学反应。在利用亚硫酸氢盐化合物化学处理后，通过qPCR或者测序检测，就能知道基因组中哪些位置的胞嘧啶被甲基化修饰。因而亚硫酸氢盐转化是目前甲基化检测的最常用DNA处理方式。
亚硫酸氢盐处理除了完成上述化学变化，同时也对DNA带来大量损伤，导致DNA碎片化和降解。评估不同配比、不同厂家亚硫酸氢盐处理后的DNA回收率是评价处理试剂有效性的重要数据。目前尚无系统检测此类DNA回收率的简易方法，且缺乏不同检测之间的相互印证。
发明内容
本发明利用一对识别无胞嘧啶碱基DNA位点的引物和一对识别转化后DNA位点的引物，检测转化后DNA回收率。检测方法简单易操作，且用两种不同的检测进行相互印证。
本发明提供一种检测DNA回收率的方法，包括：
1)用引物对DNA样品进行qPCR，获得转化的Ct值，其中所述DNA样品经转化以使未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基，所述引物识别所述DNA样品中的无胞嘧啶碱基DNA片段；和
2)使用所述Ct值以及用所述引物对未转化的DNA样品进行qPCR所获得的Ct值计算DNA回收率。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括用所述引物对未转化的DNA样品进行qPCR的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述修饰是甲基化。
在一个或多个实施方案中，所述转化使用酶促方法进行，优选脱氨酶处理。
在一个或多个实施方案中，所述转化使用非酶促方法进行，优选用亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理，更优选使用亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵处理。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括，在转化前通过非酶促或酶促方法对经修饰的胞嘧啶进行保护。所述保护优选通过TET2和/或氧化增强剂进行。
在一个或多个实施方案中，所述引物包含第一引物和第二引物，第一引物不含C且第二引物不含G。所述引物在qPCR中形成的扩增产物为50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp，优选50-150bp，更优选80-100bp。
在一个或多个实施方案中，第一引物的长度为5-50、10-40、15-30或20-25个核苷酸。
在一个或多个实施方案中，第一引物不含胞嘧啶C。
在一个或多个实施方案中，第一引物含有20-60％、30-50％或35-45％的A，优选40％的A。在一个或多个实施方案中，第一引物含有10-50％、20-40％或25-35％的T，优选28％的T。在一个或多个实施方案中，第一引物含有20-40％、25-35％或30-33％的G，优选32％的G。在一个或多个实施方案中，第一引物含有30-50％的A、20-40％的T和25-35％的G。优选地，第一引物含有40％的A、28％的T和32％的G。在一个或多个实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成。
在一个或多个实施方案中，第二引物的长度可为5-50、10-40或15-30或15-20个核苷酸。
在一个或多个实施方案中，第二引物不含鸟嘌呤G。
在一个或多个实施方案中，第二引物含有1-20％、2-15％或5-10％的A，优选6％的A。在一个或多个实施方案中，第二引物含有10-40％、20-35％或25-30％的T，优选29％的T。在一个或多个实施方案中，第二引物含有55-80％、61-75％或63-70％的C，优选65％的C。在一个或多个实施方案中，第二引物含有2-15％的A、20-35％的T和61-75％的C。优选地，第二引物含有6％的A、29％的T和65％的C。在一个或多个实施方案中，第二引物包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成。
在一个或多个实施方案中，如下计算DNA回收率：
ΔCt＝Ct(转化后)-Ct(未转化)
回收率＝2^-ΔCt。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：用识别转化后DNA的引物对经转化的DNA样品进行qPCR，获得Ct值，然后评估步骤2)中的DNA回收率。
在一个或多个实施方案中，识别转化后DNA的引物是ACTB引物，该引物识别转化后的DNA序列。若两种试剂中回收率高的试剂的ACTB检测结果显示较低的Ct值，则可确定该回收率高的试剂优于另一试剂。
在一个或多个实施方案中，ACTB引物包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成；和/或，ACTB引物包含SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成。
附图说明
图1、胞嘧啶转化后DNA回收率的检测方法示意图。
图2、不同转化试剂盒的DNA回收情况结果综合对比。
具体实施方式
本发明利用一对识别无胞嘧啶碱基DNA位点的引物(CFF,cytosine freefragment)和一对识别转化后DNA位点的引物(位于保守基因ACTB)，检测转化后DNA回收率。本发明的方法适用于任何片段化、非片段化、单链、双链DNA经胞嘧啶转化后的DNA回收检测。
本发明提供一种检测DNA回收率的方法，包括：
1)提供DNA样品和引物，所述引物识别所述DNA样品中的无胞嘧啶碱基DNA片段；
2)用第一引物和第二引物对DNA样品进行qPCR，获得Ct值；
3)处理所述DNA样品，使未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基，任选纯化DNA；
4)用第一引物和第二引物对步骤3)处理的DNA样品进行qPCR，获得转化的Ct值；
5)利用处理前后的Ct值计算DNA回收率。
本文所述“样品”可为任意类型的含DNA的样品。在一个或多个实施方案中，所述样品是经片段化的基因组DNA。
本文所述“DNA”或“DNA分子”即脱氧核糖核酸。DNA基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个脱氧核糖核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基组成。DNA的碱基(bp)主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。在双链DNA的双螺旋结构中，A与T经氢键配对，G与C经氢键配对。DNA形式包括cDNA、基因组DNA、片段化DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp。
本文所述“尿嘧啶”或“U”是RNA的组成部分。“RNA”或“RNA分子”即核糖核酸。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。每个核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)。在RNA的碱基配对中，U取代了DNA中的T的位置，即A与U经氢键配对，G与C经氢键配对。
DNA或RNA的碱基之间可发生转化。本文所述“胞嘧啶转化”或“CT转化”是利用非酶促或酶促方法处理DNA，将未修饰的胞嘧啶碱基(C)转化为尿嘧啶碱基(U)的过程。本领域周知进行胞嘧啶转化的非酶促或酶促方法。示例性地，非酶促方法包括亚硫酸氢盐或重硫酸盐处理，例如亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵等。示例性地，酶促方法包括脱氨酶处理。经转化的DNA任选经纯化。适用于本文的DNA纯化方法本领域周知。
提及胞嘧啶时，“修饰”表示胞嘧啶碱基上的化学基团的引入或除去。在胞嘧啶转化过程中，经修饰的胞嘧啶碱基比未修饰的胞嘧啶碱基稳定，不易受或不受转化过程的影响而变为U。在一个或多个实施方案中，修饰是指甲基化。本文所述“甲基化”或“DNA甲基化”是指在基因组DNA的CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价结合一个甲基基团，成为5-甲基胞嘧啶(5mC)。
任选地，本文所述胞嘧啶转化前可通过非酶促或酶促方法对经修饰的胞嘧啶进行保护，从而使其免受下游的转化作用或脱氨基作用。适用于保护经修饰的胞嘧啶的非酶促或酶促方法本领域周知。例如，TET2(ten-eleven translocation 2)和/或氧化增强剂可保护经修饰的胞嘧啶。TET2可通过级联反应将5mC和5hmC氧化成5caC。氧化增强剂可通过糖基化将5hmC转化成5ghmC。适用于进行所述糖基化的氧化增强剂本领域周知。
本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应(PCR)、qPCR、测序和探针合成等。
本发明使用成对的识别无胞嘧啶碱基DNA片段的引物，包含第一引物和第二引物。在一个或多个实施方案中，第一引物不含C且第二引物不含G。所述引物识别的无胞嘧啶碱基DNA片段所形成的扩增产物可以为任意长度，例如50-500bp，100-400bp，150-300bp或200-250bp，优选的产物扩增长度为50～150bp。
本文中，第一引物不含胞嘧啶C和/或第二引物不含鸟嘌呤G。第一引物的长度可为5-50、10-40、15-30或20-25个核苷酸。第二引物的长度可为5-50、10-40或15-30或15-20个核苷酸。
通常，引物序列的GC含量一般为40-60％，过高或过低都不利于引发反应。而且，上下游引物的GC含量不能相差太大。但发明人发现，这些原则均不适用于本文所述的引物。本发明的引物可以平衡对CT转化处理后的DNA的扩增特异性和扩增效率，实现更精确的DNA转化率检测。
本发明中，第一引物中可以含有不同量的A、T或G。第一引物含有20-60％、30-50％、35-45％的A，优选40％的A。本发明中，第一引物含有10-50％、20-40％、25-35％的T，优选28％的T。本发明中，第一引物含有20-40％、25-35％、30-33％的G，优选32％的G。示例性地，第一引物含有30-50％的A、20-40％的T和25-35％的G。优选地，第一引物含有40％的A、28％的T和32％的G。在一个或多个实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO:1或与SEQ IDNO:1有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成。
本发明中，第二引物中可以含有不同量的A、T和C。第二引物含有1-20％、2-15％、5-10％的A，优选6％的A。本发明中，第二引物含有10-40％、20-35％、25-30％的T，优选29％的T。本发明中，第二引物含有55-80％、61-75％、63-70％的C，优选65％的C。示例性地，第二引物含有2-15％的A、20-35％的T和61-75％的C。优选地，第二引物含有6％的A、29％的T和65％的C。在一个或多个实施方案中，第二引物包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成。
本文所述第一和第二引物分别与所扩增DNA区域正义链相同和反向互补，在CT转化处理后，双链DNA的两条链变得不再反向互补，因此在PCR的第一个循环中，只有第二引物识别模板，并形成可被第一引物识别的互补链。从第二循环开始，两条引物分别识别新形成双链的两条链，进行指数扩增。产物扩增长度可为50～150bp、60-140、70-130、80-120bp。优选地，产物扩增长度为80-100bp。
本文术语“变体”或“突变体”是指与参照序列相比，通过一个或多个核苷酸的***、缺失或取代使核酸序列发生变化同时保留其与其他核酸杂交能力的多核苷酸。本文任一实施方案所述的突变体包括与参照序列(如本文所述的SEQ ID NO:1或2)具有至少70％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留参照序列的生物学活性的核苷酸序列。可采用例如NCBI的BLASTn计算两条比对的序列之间的序列相同性。突变体还包括在参照序列的和核苷酸序列中具有一个或多个突变(***、缺失或取代)、同时仍保留参照序列生物学活性的核苷酸序列。所述多个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代可以是嘌呤核苷酸与嘧啶核苷酸之间的取代，也可以是嘌呤核苷酸之间或嘧啶核苷酸之间的取代。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的核苷酸进行保守性取代时，通常不会改变多核苷酸的稳定性和功能。保守性取代例如嘌呤核苷酸之间的(A与G)的互换，嘧啶核苷酸之间的(T或U与C)的互换。因此，在本发明多核苷酸中用来自同一残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
在步骤2)和4)中，本发明方法还包括对经转化处理或未处理的DNA进行定量聚合酶链反应(qPCR)。qPCR又称实时聚合酶链反应(real-time PCR)，在PCR期间实时监测靶核酸分子的扩增。qPCR可以定量地或半定量地确定样品中模板核酸的含量。在qPCR中检测PCR产物的两种常用方法是***任何双链核酸的非特异性荧光染料和由荧光报告基因标记的寡核苷酸组成的序列特异性核酸探针。qPCR过程通常包括一系列重复25-50次的温度变化。这些循环通常由三个阶段组成：第一阶段约95℃，允许分离核酸的双链；第二阶段约50-70℃，允许引物与核酸模板结合；第三阶段约68-72℃，促进DNA聚合酶进行的聚合。在一些实施方式中，第三阶段可省略。各循环使用的温度和时间取决于多种参数，例如用于合成DNA的酶、反应中二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度以及引物的结合温度。本领域已知确定qPCR各循环温度和时间的方法。在第一单链核酸序列和第二单链核酸序列是RNA时，本发明还涉及使用RT-qPCR，即将RNA连接产物反转录为cDNA，再通过qPCR定量。qPCR检测可使用任何商业化(KAPA
可通过本领域周知的方法利用处理前后的结果计算获得DNA的相对回收率。示例性地，利用下式计算DNA的相对回收率，即转化后的Ct值减去转化前的Ct值，按照指数增长扩增，其2的负次方为相对回收率：
ΔCt＝Ct(转化后)-Ct(未转化)
相对回收率＝2^-ΔCt
本发明方法还包括用识别转化后DNA位点的引物对经转化处理的DNA样品进行qPCR，获得转化后DNA的Ct值，然后对比步骤5)中的DNA回收率进行综合评估。在一个或多个实施方案中，识别转化后DNA位点的引物是ACTB检测引物。ACTB引物仅识别转化后的DNA序列，但并不依赖DNA的甲基化情况。因此在ACTB的检测中，并不检测转化前DNA。理论上，转化后DNA回收率越高，ACTB的模板分子数越多，Ct值就越小。CFF检测能够计算转化试剂的相对回收率数值，ACTB能够比较不同转化试剂回收率的相对高低，当这两者检测结果吻合时，可以确定转化试剂回收率的相互比较结果。例如，若两种试剂中CFF检测结果回收率高的试剂的ACTB检测结果显示较低的Ct值，则可确定该回收率高的试剂优于另一试剂。在一个或多个实施方案中，ACTB检测引物包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成；和/或，ACTB检测引物包含SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4有至少70％序列相同性的突变体，或由其组成。
本发明还提供本文所述的引物，包含本文所述的第一引物和/或第二引物。
本发明还提供一种检测经处理的DNA回收率的试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的引物，所述处理使DNA中未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基。所述试剂盒还包含利用处理前后通过qPCR获得的Ct值计算DNA回收率的说明书。
本发明还提供本文所述引物用于通过qPCR来检测经处理的DNA回收率的用途，所述引物包含本文所述的第一引物和第二引物，所述处理使DNA中未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基，其特征在于，利用处理前后通过qPCR获得的DNA Ct值计算DNA回收率。
本发明还提供本文所述引物用于制造qPCR检测经处理的DNA回收率的试剂盒的用途，所述试剂盒本文所述的第一引物和第二引物，所述处理使DNA中未经修饰的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶碱基。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例
实施例1-DNA的转化
本实施例利用Z试剂盒和T试剂盒转化DNA。片段化的参考基因组NA12878DNA作为检测DNA，每一个试剂盒重复4次检测。
1)按照各试剂盒说明书方式配置CT转化试剂。
2)将片段化NA12878浓度调整为1ng/μL，取20μL加入130μL CT转化试剂，每个试剂盒重复4次检测。保留约20μL未转化DNA作为对照。
3)按照各试剂盒说明书运行CT转化温控程序。Z试剂盒为98℃8分钟，54℃1小时，4℃保存。T试剂盒为98℃10分钟，64℃2小时30分钟，4℃保存。
4)按照试剂盒说明书进行转化后DNA吸附柱纯化，包括DNA结合、脱磺化反应、清洗和洗脱。最终用20μL洗脱液洗脱吸附柱DNA，得到转化后的DNA。
实施例2-CFF qPCR检测
本实施例利用CFF引物对转化后的DNA进行qPCR，获得Ct值。
1)将CFF正向和反向引物分别稀释至4μM，各取相同体积进行混合形成引物混合物，如下配置qPCR反应混合物：Kapa SYBR Fast qPCR MIX 5μL、CFF引物混合物1μL和对照或转化后DNA 4μL。
CFF正向引物：TAAGAGTAATAATGGATGGATGATG
CFF反向引物：CCTCCCATCTCCCTTCC
2)涡旋振荡，短暂离心。
3)将PCR管放入荧光定量PCR仪(BioRad CFX connect Real-Time PCR DetectionSystem)中，运行如下程序：
预变性：95℃5分钟；
信号收集40循环：95℃30秒；54℃60秒(荧光信号收集)。
结果如表1和图2所示。统计CFF引物检测Ct值，与未转化DNA差距越小说明DNA回收率越高。相对回收率如下计算：
ΔCt＝Ct(转化后)-Ct(未转化)
相对回收率＝2^-ΔCt
表1，用CFF引物检测转化后DNA
实施例3-ACTB qPCR检测
本实施例利用ACTB引物对转化后的DNA进行qPCR，获得Ct值。
1)将ACTB正向和反向引物分别稀释至10μM，各取相同体积进行混合形成引物混合物，将ACTB探针稀释至4μM。
2)如下配置qPCR反应：NEB Luna PCR master mix 10μL、ACTB引物混合物2μL、ACTB探针1μL和转化后DNA 7μL。
ACTB正向引物：GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT
ACTB反向引物：CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA
ACTB探针：
/5TAMRA/ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA/3IABkRQ/
3)将PCR管放入荧光定量PCR仪(ABI 7500Real-Time PCR System)中，运行如下程序：
预变性：95℃5分钟；
信号收集40循环：95℃15秒；58℃60秒(荧光信号收集)。
结果如表2和图2所示。统计ACTB检测的Ct值，对于不同试剂盒其分布应与CFF引物检测结果分布相似。
表2，用ACTB引物检测转化后DNA
Ct(Z试剂盒)
Ct(T试剂盒)
重复1
30.53
30.56
重复2
30.06
30.87
重复3
30.35
30.62
重复4
30.40
30.79
表2和图2的结果表明：
CFF检测能够计算转化试剂的相对回收率数值，ACTB能够比较不同转化试剂回收率的相对高低，当这两者检测结果吻合时，才最终确定转化试剂回收率的相互比较结果。
序列表
<110> 上海鹍远健康科技有限公司
<120> 转化DNA回收率的检测方法及引物
<130> 194685
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
taagagtaat aatggatgga tgatg 25
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cctcccatct cccttcc 17
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<212> DNA
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<400> 3
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25