阅读说明：本技术 一种乙脑疫苗可溶性微针贴及其制备方法 (Japanese encephalitis vaccine soluble microneedle patch and preparation method thereof ) 是由 张庶民 马凤森 周荔葆 廖辉 陈中秋 刘苗苗 吴铮 辛小韵 于 2018-07-04 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种乙脑疫苗可溶性微针贴,包括针体和背衬,所述的针体由乙脑疫苗、基质材料、佐剂组成,其中,佐剂为MDP与GM-CSF的混合,所述的佐剂与乙脑疫苗的含量比为(1：1)～(1：3)。本发明制备的乙脑疫苗可溶性微针,免疫效果好,针体机械强度高,有望取代乙脑疫苗注射剂,实现无痛微创给药。(The invention provides a Japanese encephalitis vaccine soluble microneedle patch which comprises a needle body and a back lining, wherein the needle body consists of a Japanese encephalitis vaccine, a matrix material and an adjuvant, the adjuvant is a mixture of MDP and GM-CSF, and the content ratio of the adjuvant to the Japanese encephalitis vaccine is (1:1) - (1: 3). The Japanese encephalitis vaccine soluble microneedle prepared by the invention has good immune effect and high mechanical strength of the needle body, is expected to replace Japanese encephalitis vaccine injection, and realizes painless minimally invasive administration.)

一种乙脑疫苗可溶性微针贴及其制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗的微针给药技术领域，提供了一种乙脑疫苗可溶性微针贴及其制备方法。

背景技术

流行性乙型脑炎是由乙脑病毒引起的一种侵害中枢神经系统的急性传染病，常造成患者死亡或留下神经系统后遗症，乙脑疫苗是预防流行性乙型脑炎的有效措施。目前的乙脑疫苗一般都是通过针头注射给药，患者顺应性差，因此亟待一种新型的疫苗给药途径。另外，蛋白质类药物通过口服则容易被胃肠道的蛋白酶或肝脏的首过效应分解导致活性下降，从而影响其生物利用度。透皮给药系统(TDDS)是近年来热门的药物递送新技术，它可以避免上述提到的针头注射导致患者顺应性差以及口服受消化道以及肝脏首过效应等难题，而且皮肤作为人体最大的免疫器官而备受青睐。然而由于皮肤角质层障碍的存在，使得水溶性小分子以及大分子药物的透皮递送成为了难题。

目前已有多种物理促渗技术用于促进药物的经皮递送，比如微针、离子导入、电热致孔、超声波促渗和磁场导入等。相较之前，其他物理促渗技术可能难以控制给药位置及剂量，而微针可以通过改变其长度来控制其给药部位，并且对于可溶性微针而言，可以通过控制浇注微针针尖的药物含量而对给药剂量达到精确的控制，在这两个方面微针给药占据得天独厚的优势，因此微针领域的研究逐年升温。微针(microneedles)是具有多个微型针头的阵列组合，它可以刺入皮肤的角质层进入表皮层而不触及真皮层的神经末梢，达到无痛微创给药，并且给药效果突破了传统经皮给药制剂。可溶性微针相比其他类型的微针，具有载药量大，刺入皮内可以自行降解不会造成有害残留并且可以通过筛选不同的基质材料配比达到缓控释等优点成为目前微针类型中研究最多的一种。

目前的国内外专利和文献中还没有将乙脑疫苗载入可溶性微针的实例。类似地有专利公开号IN2008CN02444A将乙脑疫苗载入涂层微针进行给药，众所周知，涂层微针与可溶性微针在制备工艺以及载药方式上有很大的差异，故难以借鉴(Indermun S,Luttge R,Choonara Y E, et al.Current advances in the fabrication of microneedles fortransdermal delivery[J].Journal of Controlled Release,2014,185(185):130-138.)。

佐剂是一种非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。免疫佐剂的作用机制可分为：①抗原在注射位点持续释放(抗原存储库效应)。②上调多种细胞因子和趋化因子。③募集免疫细胞至注射位点。④增强抗原的摄取和提呈。⑤激活抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)，促进其成熟提呈抗原转运至引流***。⑥激活炎性小体等。不同的佐剂或佐剂之间的复合使用对疫苗的免疫增强作用不同，因此针对不同的疫苗，需要筛选合适的佐剂使它能够达到相应的免疫效果(许金俊,陶建平,彭金彪,等.不同佐剂和免疫途径对柔嫩艾美耳球虫SO7抗原免疫保护效果的影响[J].中国预防兽医学报,2007,29(9):697-703.；陶里,段金梅,舒晓明,等.三七皂苷R1对铝佐剂甲型肝炎疫苗的免疫增强作用[J].中国生物制品学杂志,2008,21(3): 197-200.)。

可溶性微针除了具有上述提到的优点外，也存在着一定的局限性，比如相对其他类型的微针机械强度可能不足。根据参考文献(Park J H,Allen M G,Prausnitz MR.Polymer microneedles for controlled-release drug delivery[J].Pharmaceuticalresearch,2006,23(5): 1008-1019.)可知，随着药物在微针处方中占比的提升，所制得的可溶性微针的机械强度随之下降。因此，筛选合适的微针药载比对于改善可溶性微针的机械强度具有一定的意义。

综上所述，针对乙脑疫苗，如何开发出一种处方适宜、免疫效果好、机械强度优良的可溶性微针，是本领域技术人员急需解决的技术难题。

发明内容

本发明目的在于提供了一种乙脑疫苗可溶性微针贴及其制备方法，解决了上述现有技术存在的瓶颈。

本发明采用的技术方案具体如下：

一种乙脑疫苗可溶性微针贴，包括针体和背衬，所述的针体由乙脑疫苗、基质材料、佐剂组成，其中，佐剂为胞壁酰二肽(MDP)与人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的混合，所述的佐剂与乙脑疫苗的含量比为(1：1)～(1：3)。

优选的，所述的基质材料为透明质酸(HA)。

优选的，所述的佐剂中GM-CSF与MDP的含量比为(3：1)～(1：3)。

更优选的，所述的佐剂中GM-CSF与MDP的含量比为1：2。

优选的，所述的佐剂与乙脑疫苗的含量比为1：2。

优选的，所述的基质材料占针体质量的百分比为30％～50％。

优选的，所述的针体中各组分的含量如下：乙脑疫苗为40wt％，GM-CSF为6.7wt％，MDP为13.3wt％，HA为40wt％。

一种如前所述的乙脑疫苗可溶性微针贴的制备方法，包括如下步骤：

(1)微针的阴模制备

采用倒模法制备乙脑疫苗可溶性微针所需的聚二甲氧基硅氧烷阴模具；

(2)第一次离心入模

将处方量的各组分混合、溶解成均一的针体液，取适量针体液涂覆于经倒模法制成的阴模上，放入96孔板离心机中，离心使针体液进入阴模的孔洞；然后，取出阴模，刮除孔洞外的溶液；

(3)第二次离心入模

将背衬溶解成均一的背衬液，取适量背衬液涂覆于步骤(1)所得的阴模上，放入96孔板离心机，离心使背衬液进入阴模的孔洞；再将其放入烘箱，于37℃下干燥后取出，脱模，即得。

本发明提供的乙脑疫苗可溶性微针贴片及其制备方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：

①本发明选择特定含量比的复合免疫佐剂与乙脑疫苗结合，使得乙脑疫苗可溶性微针的免疫增强效果最佳。

②本发明筛选合适的基质材料质量占比，使得乙脑疫苗可溶性微针机械性能适中，提高微针的给药成功率。

③本发明制备的可溶性微针为分层微针，可以使得微针给药剂量更容易控制，且不会造成药物浪费。

总之，本发明制备的乙脑疫苗可溶性微针，免疫效果好，针体机械强度高，有望取代乙脑疫苗注射剂，实现无痛微创给药。

附图说明

图1为制备微针阴模具的流程示意图；

图2为制备本发明乙脑疫苗微针的流程示意图；

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好的理解本发明方案，下面将结合本发明中的附图，对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入到了本发明的保护范围。

实施例1乙脑疫苗微针的阴模制备

如图1，本发明采用倒模法制备乙脑疫苗微针的阴模，步骤如下：

将金属阳模微针放置于长方体的容器中，针尖朝上。将聚二甲氧基硅氧烷(PDMS)与固化剂按质量比为10:1进行配置后浇注入长方体的容器中；将容器置于真空干燥箱内，分别设置参数真空度为0.07MPa，时间为5min，以除去混合溶液中的气泡；再将该容器放入烘箱，设置温度参数为50℃，于5～8h后取出，脱模即得PDMS微针阴模具。

实施例2乙脑疫苗微针的制备

如图2，本发明采用二次离心入模法制备乙脑疫苗微针，步骤如下：

1)将处方中的各种成分按比例混合后，用适量溶剂(去离子水)溶解成均匀的混合液(即针体液)，取适量针体液装入离心管，置于离心沉淀器，离心使得针体液中的气泡去除，静置备用。

2)取步骤1)离心后所得的针体液，浇注于本发明实施1制备的PDMS模具上，再将PDMS模具置于台式低速离心机，于转速3000rpm下离心5min，使得针体液注入模具的孔洞中；离心完毕后，取出模具，刮除模具表面的溶液仅保留孔洞中的溶液；

3)将不含药背衬层复合材料用溶剂(去离子水)溶解成均匀的液体(即背衬液)，取适量背衬液装入离心管，置于离心沉淀器，离心使得背衬液中的气泡去除，静置备用。

4)取步骤3)离心后所得的背衬液，浇注于步骤2)所得的PDMS模具上，再将PDMS 模具置于台式低速离心机，于转速3000rpm下离心3min，使得背衬液注入模具的孔洞；离心后，取出模具，放入烘箱，于37℃下干燥8h后取出，脱模，即得成品乙脑疫苗微针贴片。

实施例3不同免疫佐剂的使用对乙脑疫苗可溶性微针免疫效果的影响

假设免疫佐剂在针体总质量中的占比为一定值，仅改变免疫佐剂的组分，考察如表1所示的不同组合的免疫佐剂对微针免疫效果的影响，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。

表1不同免疫佐剂对乙脑疫苗可溶性微针免疫效果的影响

对表1中的11个微针处方，参照本发明的实施例1和实施例2的方法制成可溶性微针后，按如下方法检测可溶性微针的免疫效果：

将18片可溶性微针利用给药器分别刺入经过脱毛后的18只大鼠背部皮肤，待微针完全溶解后取出，间隔一个星期时间后按同样方法对上述大鼠进行二次免疫。二次加强免疫后七天从大鼠的静脉取血清，用ELISA(酶联免疫吸附测定)试剂盒对血清中的乙脑疫苗特异性 IgG水平进行定量。

测试结果，见表2。

表2不同免疫佐剂的组合对乙脑疫苗可溶性微针免疫效果的影响

由表2可知，加了免疫佐剂与不加免疫佐剂相比，免疫效果完全不同，而且不同佐剂对乙脑疫苗可溶性微针的免疫增强作用不同，当用单一佐剂进行给药时，MDP的免疫增强作用最好，其次是MPL、GM-CSF和氢氧化铝凝胶；复合佐剂的使用比单一佐剂的免疫增强作用更好，其中6号处方的微针所对应的血清抗体水平最高，表明当MDP和GM-CSF佐剂联合使用时对乙脑疫苗的免疫增效最为明显，因此，本发明中免疫佐剂选择MDP和GM-CSF的混合。

实施例4复合免疫佐剂的含量对乙脑疫苗可溶性微针免疫效果的影响

在实施例3的基础上，假定复合免疫佐剂在针体总质量中的占比为一定值，且复合免疫佐剂的组分固定，仅改变免疫佐剂中各组分的含量变化，考察如表3所示的不同比例的复合免疫佐剂对微针免疫效果的影响。

同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。对表3中各可溶性微针处方的免疫效果检测，测试步骤参照本发明的实施例3。

表3不同含量的复合免疫佐剂对微针免疫效果的影响

测试结果，见表4。

表4不同含量的复合佐剂对微针免疫效果的影响

结合表3和表4可知，

1)复合佐剂中随着MDP含量的上升，免疫增强效果愈加明显，但是当GM-CSF：MDP达到1:3时(即处方5)，免疫增强效果反而减弱。

2)当GM-CSF：MDP＝1:2时，免疫增强效果最佳，故作为最优处方。

实施例5复合佐剂与疫苗不同比例对微针免疫效果的影响

在实施例4的基础上，假设复合佐剂中GM-CSF与MDP的比例为一定值(1:2)，基质材料的占比固定，仅改变复合佐剂与疫苗的比例，考察如表5所示的不同比例的复合免疫佐剂和疫苗对微针免疫效果的影响。

同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。对表5中各可溶性微针处方的免疫效果检测，测试步骤参照本发明的实施例3。

表5不同比例的复合免疫佐剂与疫苗量对微针免疫效果的影响

No	复合免疫佐剂+乙脑疫苗	基质材料HA(wt％)
			1	复合免疫佐剂：乙脑疫苗＝1:3	40
2	复合免疫佐剂：乙脑疫苗＝1:2	40
			3	复合免疫佐剂：乙脑疫苗＝1:1	40

测试结果，见表6。

表6不同比例的复合免疫佐剂与疫苗量对微针免疫效果的影响

如表6所示，随着乙脑疫苗与复合免疫佐剂的比例由(1:1)上升至(2:1)的过程中，即乙脑疫苗的占比增加，免疫增强效果更加显著；当比例上升至(3:1)时，即使疫苗占比继续提高，但伴随着复合免疫佐剂的减少，导致免疫增强效果减弱。因此，当乙脑疫苗与复合免疫佐剂的占比为2:1时(即处方2)，免疫增强效果最佳，故作为最优处方。

实施例6不同基质材料占比对微针性能的影响

根据文献(Park J H,Allen M G,Prausnitz M R.Polymer microneedles forcontrolled-release drug delivery[J].Pharm Res,2006,23(5):1008-19.)可知，随着微针中载药量的提高，将会导致微针的机械性能下降。因此除了对免疫效果进行评价外，结合微针的机械性能来确定微针基质材料的合适占比，假定复合佐剂与疫苗的质量占比为一定值，仅改变基质材料的含量，考察处方如表7所示。

可溶性微针的机械性能测试：将微针利用给药器以5N的力刺入离体大鼠皮肤后，采用亚甲基蓝对皮肤所刺的区域进行染色，计算蓝点的数量与微针针数的比例，平行6组。

同理，本实施例涉及的微针与阴模，其制备方法参照本发明的实施例1和实施例2。对表7中各可溶性微针处方的免疫效果检测，测试步骤参照本发明的实施例3。

表7不同基质材料占比对微针的机械性能以及免疫效果的影响

测试结果如表7所示，随着基质材料的占比上升，微针的机械强度随之上升，可以刺入皮肤给药的针数上升，但是微针的载药量随之下降。当基质材料HA的占比为40％时(即处方2)，机械强度中等，免疫效果好，故作为最优处方。

综上所述，乙脑疫苗可溶性微针的最优处方为：40wt％乙脑疫苗，6.7wt％GM-CSF，13.3wt％MDP，40wt％HA。

实施例7乙脑疫苗可溶性微针皮肤穿刺实验

按上述实施例1和2的方法以及前面实施例所筛选的最优处方(40wt％乙脑疫苗，6.7wt％GM-CSF，13.3wt％MDP，40wt％HA)制得可溶性微针后，利用给药器以5N的力按入离体小鼠皮肤10s后放入10％甲醛溶液固定后留待组织学切片。观察切片结果可知，微针刺破了角质层进入了表皮层，表明本发明制得的可溶性微针能有效穿刺皮肤。