阅读说明：本技术 一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶及制备方法和应用 (Gene engineering lyase for killing staphylococcus and preparation method and application thereof ) 是由 韩文瑜 顾敬敏 冀亚路 郭志敏 程梦珺 张蕾 张玉凤 夏翡翡 王彬 肖峰 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶及制备方法,对裂解酶LysGH15进行了基因工程改造得到一种新的噬菌体裂解酶LysGH15<Sup>(+)</Sup>,该裂解酶与改造前裂解酶相比显示出更强的杀菌活性和更宽的宿主谱,能够在短时间内杀灭金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等,为预防和治疗由葡萄球菌感染引起的疾病提供一个很有潜力的新药物,具有很好的应用价值。(The invention discloses a gene engineering lyase for killing staphylococcus and a preparation method thereof, wherein the lyase LysGH15 is subjected to gene engineering modification to obtain a novel phage lyase LysGH15 (+) Compared with the lyase before modification, the lyase shows stronger bactericidal activity and wider host spectrum, can kill staphylococcus aureus, staphylococcus epidermidis, staphylococcus haemolyticus, staphylococcus hominis, staphylococcus saprophyticus, staphylococcus conradi, staphylococcus xylosus and the like in short time, and provides a means for preventing and treating diseases caused by staphylococcus infectionA novel drug with high potential and good application value.)

一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶及制备方法和应用

技术领域

本发明公开了一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶及制备方法，是一个经基因工程改造的噬菌体裂解酶LysGH15⁽⁺⁾，该裂解酶与改造前裂解酶相比对葡萄球菌具有更强的杀菌活性和更宽的宿主谱，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡萄球菌可分为凝固酶阴性葡萄球菌和凝固酶阳性葡萄球菌。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于凝固酶阳性葡萄球菌，是一种重要的人畜共患病原菌，可以引起皮肤脓肿、伤口感染、心内膜炎、骨髓炎、肺炎以及中毒性休克综合征等多种局部和全身性感染疾病。凝固酶阴性葡萄球菌则包括表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、腐生葡萄球菌（S. saprophyticus）、人型葡萄球菌（S. hominis）、溶血葡萄球菌（S. haemolyticus）、康氏葡萄球菌（S. cohnii）、瓦式葡萄球菌（S. warneri）、头葡萄球菌（S. capitis）、木糖发酵葡萄球菌（S. xylosis）、模拟葡萄球菌（S. simulans）、松鼠葡萄球菌（S. sciuri）以及家畜葡萄球菌（S. hyicus）。其中，表皮葡萄球菌已成为一种常见且重要的医院病原菌，尤其是在免疫功能低下的患者中，其致病率仅次于金黄色葡萄球菌。而溶血性葡萄球菌和人型葡萄球菌也是葡萄球菌感染常见的机会致病。除了松鼠葡萄球菌和家畜葡萄球菌，其他葡萄球菌均可从人类皮肤分离。近年来，针对不同葡萄球菌引起的疾病主要利用抗生素疗法，但是随着全球性抗生素的广泛使用以及滥用，葡萄球菌产生抗性基因，使得抗生素疗法受到限制，急需寻找一种新的有效抗菌剂及抗菌疗法。

裂解酶是一种噬菌体编码的酶，在噬菌体裂解细菌的过程中发挥着重要的作用。裂解酶的作用靶点为细菌细胞壁中的肽聚糖，能够降解细菌细胞壁内的特异性键。由于革兰氏阴性菌的细胞壁外还有一层外膜结构，因此裂解酶很难在细菌外达到革兰氏阴性菌的细胞壁使细菌发生裂解。但是，革兰氏阳性菌的细胞壁外没有外膜包裹，这就为裂解酶直接在细菌外面直接杀灭细菌提供了可能性。这种酶代表了一类新型抗病原体感染的抗菌剂。利用裂解酶防治细菌感染有很多的优势。首先，裂解酶具有宿主特异性，一般情况下不会影响到人或动物的真核细胞和正常菌群。其次，裂解酶不需要经过噬菌体吸附、核酸注入、复制装配以及释放子代等过程，而是可以直接作用于细胞壁从而杀灭细菌，因此裂解酶具有更高的杀菌效率和更宽的裂解谱。此外，裂解酶是一种蛋白，利用裂解酶作为抗菌制剂更容易被大众接受。另外，与抗生素不同，细菌细胞壁的结构相对保守，对维持形态和生存是必需的，因此，细菌很难对裂解酶产生抗性，这使裂解酶成为防治金黄色葡萄球菌感染的潜在候选药物。

目前，已报道的葡萄球菌裂解酶很多，但是同时具有强裂解活性和跨种属宽宿主谱的裂解酶却很少。本实验室先前已经表达了金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15并对其进行了体外和体内的活性测定研究，结果表明该裂解酶对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌以及人型葡萄球菌都具有高效的裂解活性和宽宿主谱，但对其他葡萄球菌不具有裂解活性。

发明内容

本发明公开一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶，对裂解酶LysGH15进行了基因工程改造得到一种新的噬菌体裂解酶LysGH15⁽⁺⁾，该裂解酶与改造前裂解酶相比显示出更强的杀菌活性和更宽的宿主谱，能够在短时间内杀灭金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等，为预防和治疗由葡萄球菌感染引起的疾病提供一个很有潜力的新药物，具有很好的应用价值。

本发明公开的一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶LysGH15⁽⁺⁾，其氨基酸序列见：SEQ ID NO.1；其核苷酸序列见：SEQ ID NO.2。

本发明包括基因工程裂解酶LysGH15⁽⁺⁾编码基因的表达载体及表达载体的重组菌株的构建。

本发明公开的一种基因工程裂解酶LysGH15⁽⁺⁾的制备方法，方法步骤如下：

1、将裂解酶LysGH15⁽⁺⁾的核苷酸序列克隆到表达载体中，得到重组质粒；

2、将步骤1得到的重组质粒转入菌株，得到重组菌株；

3、利用重组菌株诱导表达该裂解酶；

4、进一步纯化步骤3得到的本发明裂解酶。

本发明基因工程裂解酶LysGH15⁽⁺⁾能裂解金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等葡萄球菌。

本发明基因工程裂解酶LysGH15⁽⁺⁾在制备用于预防和治疗由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等葡萄球菌引起的动物和人感染性疾病药物中的用途。

一种预防和治疗由金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等葡萄球菌引起的感染性疾病的组合物，其包含本发明基因工程裂解酶LysGH15⁽⁺⁾作为有效成分。

本发明对裂解酶LysGH15进行了基因工程改造，对改造后的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾进行表达并进一步测定其裂解活性和宿主谱。结果表明，与改造前裂解酶相比，改造后裂解酶活性更强，宿主谱更宽，除了能裂解更多的金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌以及人型葡萄球菌之外，还能裂解腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等。

本发明中裂解酶LysGH15⁽⁺⁾和改造前的裂解酶核苷酸和氨基酸序列都不相同，属于不同的裂解酶。

本发明的积极效果在于：

提供了一个新的噬菌体裂解酶，可以单独或与其他物质复配使用，具有强裂解活性和较宽的裂解谱，能够有效杀灭金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人型葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等多种葡萄球菌，为预防和治疗葡萄球菌感染引起的疾病提供一种新的药物。

附图说明

图1. 裂解酶LysGH15⁽⁺⁾的表达与纯化；

图2. 裂解酶LysGH15⁽⁺⁾形成的抑菌空斑；

图3. 裂解酶LysGH15⁽⁺⁾最佳作用pH值测定；

图4. 裂解酶LysGH15⁽⁺⁾最佳温度测定；

图5. 裂解酶LysGH15⁽⁺⁾体外杀菌活性测定。

具体实施方式

以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1

裂解酶的表达与纯化

扩增裂解酶LysGH15⁽⁺⁾的引物为：上游5'-CCGCTCGAGATGGCTAAGACT CAAGCAGAA-3'，下游5'-CGGGATCCCTATTTGAATACTCCCCAGGCAA-3'。将扩增的LysGH15⁽⁺⁾基因通过特异性酶切位点XhoI和BamHI连接到pET15b载体上，构建表达载体pET15b-LysGH15⁽⁺⁾。将构建好的载体转入到大肠杆菌BL21感受态中，在500 mL新鲜LB培养基中进行扩增，同时加入1/1000的硫酸卡那霉素，待菌液OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入1/1000的IPTG（终浓度1 mM）进行诱导，诱导温度为16℃，诱导时间16 h。

利用Ni-NTA对蛋白进行亲和层析纯化：将诱导后的菌液进行集菌（4℃，10000 ×g，20min），并用适量Tris-Cl缓冲液（pH=7.5）进行重悬，取80 µL全菌样品，其余冰浴超声破碎后离心（8000 ×g，30min），留取上清液，取80 µL上清样品。将其余上清样品过Ni柱，使蛋白与Ni进行结合，随后先分别利用含有20 mM和50 mM咪唑的Tris-Cl缓冲液洗脱杂蛋白，最后用含500 mM咪唑的Tris-Cl缓冲液洗脱目的蛋白。收集洗脱液后经超滤得到纯化的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾。使用BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾进行浓度测定。将全菌，上清及纯化后蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析。

结果如图1所示，1、2、3孔分别代表裂解酶LysGH15⁽⁺⁾全菌、上清以及纯化后样品，纯化后的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾纯度很高。

SDS-PAGE胶配方如下：

SDS-PAGE分离胶（12%）：

SDS-PAGE浓缩胶：

实施例2

裂解酶LysGH15⁽⁺⁾固体平板抑菌能力测定

超净台内将对数生长期的金黄色葡萄球菌USA300均匀涂布于TSB固体培养基平板上，晾干后将10 µL纯化后的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾滴于平板上并作标记。另外，将10 µL的Tris-Cl缓冲液滴于平板上作为对照。将平板放置37℃恒温箱中过夜培养，次日观察抑菌环的形成情况。

结果如图2所示，在标记处出现透亮空斑，表明裂解酶LysGH15⁽⁺⁾对金黄色葡萄球菌USA300具有较强的裂解活性。

实施例3

裂解酶LysGH15⁽⁺⁾最佳作用pH值测定

将等量的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾蛋白buffer调成不同pH值，即将50 mM醋酸钠缓冲液pH值调至4.0-6.0，将Tris-Cl缓冲液调至7.0-9.0。然后将不同pH值条件下的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾与等量的金黄色葡萄球菌USA300（OD₆₀₀=0.6左右）进行充分混合，放置37℃水浴锅中孵育，30min后将各反应液进行涂板，测定各反应液菌落数，重复三次。菌落数下降的越多表明在该pH条件下裂解酶LysGH15⁽⁺⁾的裂解活性越强，将表现为裂解酶裂解活性最强的缓冲液pH值定为最佳作用pH值。

结果如图3所示，表明裂解酶LysGH15⁽⁺⁾最佳pH值为7。

实施例4

裂解酶LysGH15⁽⁺⁾最佳温度测定

将金黄色葡萄球菌USA300培养至对数生长期，用Tris-Cl缓冲液洗涤三次后重悬，并将OD₆₀₀值调至0.6左右。在最佳pH值缓冲液的条件下将等量的LysGH15⁽⁺⁾与处理好的USA300菌液充分混匀，随后放置于不同温度的水浴锅中孵育30 min，测定不同温度条件下各反应液的菌落数，重复三次。裂解酶活性最高的温度定为最佳作用温度。

结果如图4所示，表明裂解酶LysGH15⁽⁺⁾在37℃时活性最强。

实施例5

裂解酶LysGH15⁽⁺⁾体外杀菌活性测定

将金黄色葡萄球菌USA300培养至对数生长期，用Tris-Cl缓冲液洗涤三次后重悬，并将OD₆₀₀值调至0.6左右。裂解酶LysGH15⁽⁺⁾处理组加入终浓度为20 µg/mL的LysGH15⁽⁺⁾。阳性对照组加入终浓度为20 µg/mL的裂解酶LysGH15。阴性对照组加入等体积的Tris-Cl缓冲液。三组同时放入37℃水浴锅中孵育，每隔10 min取样，倍比稀释进行菌落计数，实验进行60min，重复三次。

结果如图5所示，阴性对照组60 min后菌落数基本保持不变，裂解酶LysGH15和LysGH15⁽⁺⁾处理组菌落数显著减少，裂解酶LysGH15⁽⁺⁾处理组比LysGH15在各时间段菌落数减少更多，表明裂解酶LysGH15⁽⁺⁾比LysGH15活性更强。

实施例6

裂解酶LysGH15⁽⁺⁾裂解谱测定

将50株金黄色葡萄球菌（24株MRSA，26株MSSA），30株表皮葡萄球菌，25株溶血葡萄球菌，10株人葡萄球菌，8株腐生葡萄球菌，9株康氏葡萄球菌，6株木糖发酵葡萄球菌，10株大肠杆菌，10株链球菌，10株沙门氏菌，10株枯草芽孢杆菌，10株粘质沙雷菌以及10株肺炎克雷伯菌分别培养至对数期（OD₆₀₀=0.6），离心后用无菌Tris-Cl缓冲液洗涤三次，并将菌落数调至1ⅹ10⁸ CFU/mL左右，加入终浓度为20 µg/mL裂解酶LysGH15⁽⁺⁾，对照组加入等体积的Tris-Cl缓冲液，放置37℃水浴锅孵育，60 min后进行菌落计数，重复三次。

结果如表1所示，基因改造后的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾除了对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人型葡萄球菌表现出比LysGH15更宽的裂解谱和更高效的抗菌活性，同时对腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等也表现出现了有效的杀灭活性。

表1 裂解酶裂解谱分析

结论：本发明经基因工程改造后的裂解酶LysGH15⁽⁺⁾对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等多种葡萄球菌具有强杀菌活性和宽杀菌谱。鉴于此，该裂解酶可用于有效预防和治疗由葡萄球菌感染引起的疾病。该裂解酶大小为54 kD；裂解酶在TSB琼脂培养基上可以感染葡萄球菌从而形成透亮的空斑；pH值为6-7时活性最高，最佳作用温度为37℃，能够裂解金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、腐生葡萄球菌、康氏葡萄球菌以及木糖发酵葡萄球菌等多种葡萄球菌菌株。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种杀灭葡萄球菌的基因工程裂解酶及制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 基因工程裂解酶(基因工程裂解酶)

<400> 1

atggctaaga ctcaagcaga aataaataaa cgtttagacg cttatgcaaa aggtacagta 60

gacagtcctt atagaattaa aaaagctaca agctatgacc catcgtttgg tgtaatggaa 120

gcaggagcaa ttgacgcaga tggttactat catgcacagt gccaagactt aattactgat 180

tatgtattat ggttaacaga taataaagtt agaacttggg gtaatgctaa agaccaaatc 240

aaacaaagtt atggtactgg atttaaaata catgaaaata aaccttctac agtacctaaa 300

aaaggatgga ttgctgtatt tacatccggt agttatcagc aatggggtca cataggtatt 360

gtatatgatg gaggtaatac ttctacattt actattttag agcaaaactg gaacggttac 420

gctaataaaa aacctacaaa acgtgtagat aattattacg gattaactca ttttattgag 480

atacctgtaa aagcaggaac tactgttaaa aaagaaacag ctaagaaaag tgcaagtaaa 540

acacctgcac ctaaaaagaa agcaacacta aaagtttcta agaaccatat taactataca 600

atggataaac gtggtaagaa acctgaagga atggtaatac acaacgatgc aggtcgttct 660

tcagggcaac aatacgagaa ttcattagct aacgcaggtt atgctagata tgctaatggt 720

attgctcatt actatggctc tgaaggttat gtatgggaag caatagatgc taagaatcaa 780

attgcttggc acacaggaga tggaacagga gcaaactcag gtaactttag atttgcaggt 840

attgaagtct gtcaatcaat gagtgctagt gatgctcaat tccttaaaaa cgaacaagca 900

gtattccaat ttactgcaga gaaatttaaa gaatggggtc ttactcctaa tcgtaaaact 960

gtaagattgc acatggaatt tgttccaaca gcttgtcctc atcgttctat ggttcttcat 1020

acaggattta atccagtaac acaaggaaga ccatctcaag caataatgaa taaactaaaa 1080

gattatttca ttaaacaaat taaaaactac atggataaag gaacttcaag ttctacagta 1140

gttaaagacg gtaaaacaag tagcgcaagt acaccggcaa ctagaccagt aacaggctct 1200

tggaaaaaga accagtacgg aacttggtac aaaccggaaa atgcaacatt tgttaatggt 1260

aaccaaccta tagtaactag aataggttct ccattcttaa atgctccagt aggaggtaac 1320

ttaccggcag gagctacaat tgtatatgac gaagtttgta tccaagcagg tcacatttgg 1380

ataggttaca atgcttacaa tggtaacaga gtatattgcc ctgttagaac ttgtcaagga 1440

gttccaccta atcatatacc tggggttgcc tggggagtat tcaaatag 1488

<210> 2

<211> 495

<212> PRT

<213> 基因工程裂解酶(基因工程裂解酶)

<400> 2

Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala

1 5 10 15

Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly

35 40 45

Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp

50 55 60

Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile

65 70 75 80

Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser

85 90 95

Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr

100 105 110

Gln Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser

115 120 125

Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys

130 135 140

Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu

145 150 155 160

Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys

165 170 175

Ser Ala Ser Lys Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val

180 185 190

Ser Lys Asn His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro

195 200 205

Glu Gly Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln

210 215 220

Tyr Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly

225 230 235 240

Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile Asp

245 250 255

Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly Ala Asn

260 265 270

Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln Ser Met Ser

275 280 285

Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala Val Phe Gln Phe

290 295 300

Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr Pro Asn Arg Lys Thr

305 310 315 320

Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr Ala Cys Pro His Arg Ser

325 330 335

Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser

340 345 350

Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys

355 360 365

Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly

370 375 380

Lys Thr Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser

385 390 395 400

Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr

405 410 415

Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe

420 425 430

Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val

435 440 445

Tyr Asp Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn

450 455 460

Ala Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly

465 470 475 480

Val Pro Pro Asn His Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys

485 490 495