阅读说明：本技术 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用 (Halogen alcohol dehalogenase mutant and application thereof ) 是由 薛锋 李凤伟 亚香菊 王于齐 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明首先公开了一种卤醇脱卤酶突变体及其应用。本发明采用数据库挖掘技术,挖掘潜在的卤醇脱卤酶基因,并在工程菌中进行诱导表达,得到一种新的卤醇脱卤酶；对酶进行半理性设计改造,以(<I>R</I>,<I>S</I>)-PGE为模式底物,获得2个立体选择性提高的突变体,分别是Q159L和N160L,其对映体选择率分别约从9.85提高到21.80和21.10,其中突变体N160L的选择性和原始酶是相反的；两突变体多种底物的选择性均有一定程度的提高,尤其是突变体N160L对底物对甲基苯基缩水甘油醚的<I>E</I>值提高到了25.77,是原始HHDH<Sub>His</Sub>的13.93倍。(The invention firstly discloses a halogenohydrin dehalogenase mutant and application thereof. The method adopts a database mining technology to mine potential halohydrin dehalogenase genes, and performs induction expression in engineering bacteria to obtain a new halohydrin dehalogenase; semi-rational engineering of enzymesIs designed and modified as follows R , S ) PGE as model substrate, 2 stereoselectively enhanced mutants were obtained, Q159L and N160L, respectively, with an improved enantioselectivity from about 9.85 to 21.80 and 21.10, respectively, where the selectivity of mutant N160L is opposite to that of the original enzyme; the selectivity of various substrates of the two mutants is improved to a certain extent, particularly the mutant N160L to the substrate p-methylphenyl glycidyl ether E The value is increased to 25.77 and is the original HHDH His 13.93 times.)

一种卤醇脱卤酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种卤醇脱卤酶突变体及其应用。

背景技术

卤代醇化合物作为医药化工等领域的重要中间体，在有机合成与医药研发等方面具有广泛的应用，然而自然界中大部分卤化物因其降解能力较差、毒性大和潜在的致癌性等缺点，已成为主要的环境污染物之一，因此人们越来越重视对其的降解处理以期减轻该类有机卤化物对自然环境的污染和对人类潜在的威胁。利用传统的物理化学方法不仅反应条件苛刻，而且很有可能带来二次污染，而利用生物降解方法具有环境无污染、反应条件温和、反应步骤简单、产物易分离等突出优点，已成为目前卤代化合物降解的主要发展趋势。在微生物中发现了一系列能降解这类有毒物质的酶，其中一种关键的酶就是卤醇脱卤酶。

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase，EC 4.5.1.X，简称HHDH)又叫做卤醇-卤化氢裂解酶，它是存在于微生物中降解有机卤代化合物的关键酶之一。卤醇脱卤酶不仅可以催化碳-卤键的断裂，形成环氧化物，同时还可以进行相应的逆反应，并且在非自然亲核试剂的存在下，例如N₃ ^-、CN^-、NO₂ ^-、SCN^-、OCN^-和HCOO^-等，催化环氧化物的开环，形成一系列新的C-C、C-O和C-N键等，这为制备各类光学纯的β-取代醇和环氧化物提供了一个高效经济环保的方法，在药物研发和有机合成等方面具有较高的应用价值。

卤醇脱卤酶的首次发现是在1968年，Castro等通过利用卤化物2,3-二溴-1-丙醇作为唯一碳源，从苜蓿生长的土壤中筛选获得的一株能够降解卤代醇化合物的微生物黄杆菌(Flavobaterium sp.)，自此以后，通过利用有机卤代醇作为唯一碳源对采集来的样品进行筛选，已经筛选得到了多种降解卤代醇的菌株；作为降解卤代醇的重要的酶之一的卤醇脱卤酶基因被陆续挖掘出来，并进行克隆表达及进一步的详细表征。

2014年以来，尽管卤醇脱卤酶的数量在不断增加，但是催化性能优异的酶却较少，近年来文献报道催化性能优异的也仅有来自于Agrobacterium radiobacter AD1的HheC。立体选择性优异新型卤醇脱卤酶的匮乏，严重制约了卤醇脱卤酶立体选择性生物催化在手性环氧化物合成中的开发应用。因此，开发催化活力高、对映选择性好以及稳定性高的卤醇脱卤酶一直是科研工作者近几年的重点研究方向之一。传统的筛选方法是以卤代醇或者环氧化物为唯一碳源从土壤等样品中筛选，但这种方法效率较低。随着生物信息学和基因组测序技术的飞速发展，公共生物数据库中基因和基因组数据迅速增长，在这些庞大的基因数据库中包括着大量的工业酶资源，因此基于已知卤醇脱卤酶基因序列的基因数据库挖掘法正引起人们的日益关注。该法实际上是以已知的卤醇脱卤酶基因序列作为探针去搜索数据库中结构和功能类似的同源酶的编码序列。

卤醇脱卤酶虽然应用广泛，但由于大多数天然酶具有很大的局限性，如对映选择性低等，不能满足工业化生产的需求，以致于很少可以直接应用于工业生产中。因此，应用蛋白质工程手段对天然酶进行分子改造，使其成为较为理想的生物催化剂为我们获得具有优异催化性能的酶基因提供了方法和依据。

发明内容

针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种卤醇脱卤酶突变体及其应用。申请人采用数据库挖掘技术，以已报道的酶基因序列为模板，挖掘潜在的卤醇脱卤酶基因，并在工程菌中进行诱导表达，得到一种新的卤醇脱卤酶；接着对酶进行半理性设计改造，以(R,S)-PGE(苯基缩水甘油醚)为模式底物，通过高效液相色谱检测，获得2个立体选择性提高的突变体。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是：

一种卤醇脱卤酶，包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

一种编码上述卤醇脱卤酶的基因，所述基因含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

一种卤醇脱卤酶突变体，是由氨基酸序列为SEQ ID NO：1的卤醇脱卤酶的第159位谷氨酰胺突变成亮氨酸(表示为Q159L)或160位天冬酰胺突变成亮氨酸(表示为N160L)。

优选的，所述卤醇脱卤酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示，其中，Q159L的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；N160L的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还保护编码上述卤醇脱卤酶突变体的基因。

优选的，所述卤醇脱卤酶突变体的基因，所述基因含有如SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6的核苷酸序列。

其中，Q159L的核苷酸序列为SEQ ID NO：5；N160L的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还保护上述基因的载体。

本发明还保护表达上述卤醇脱卤酶突变体的细胞。

优选的，所述细胞为真菌细胞或细菌细胞。

一种基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，表达上述卤醇脱卤酶突变体。

一种提高卤醇脱卤酶立体选择性的方法，对酶进行半理性设计改造，利用同源建模和分子对接技术，对底物结合口袋附近的2个氨基酸残基(Gln159、Asn160)进行定点饱和突变和组合突变。

优选的，通过将包含SEQ ID NO：1序列的卤醇脱卤酶第159位谷氨酰胺突变成亮氨酸或160位天冬酰胺突变成亮氨酸，即得。

本发明还保护通过上述方法得到的卤醇脱卤酶突变体。

本发明还提供上述卤醇脱卤酶突变体的应用。

本发明还提供卤醇脱卤酶突变体在催化拆分环氧化物方面的应用。

优选的，所述环氧化物为对甲基苯基缩水甘油醚。

本发明还提供了卤醇脱卤酶突变体在催化卤代醇底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇7的单酶串联反应中的应用。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)采用数据库挖掘技术，以已报道的酶基因序列为模板，挖掘潜在的卤醇脱卤酶基因，并在工程菌中进行诱导表达，得到一种新的卤醇脱卤酶；

(2)对酶进行半理性设计改造，以(R,S)-PGE为模式底物，通过高效液相色谱检测，获得2个立体选择性提高的突变体，分别是Q159L和N160L，其对映体选择率分别约从9.85提高到21.80和21.10，其中突变体N160L的选择性和原始酶是相反的；通过对突变体N160L与Q159L的环氧化物底物谱进行研究，两突变体除了对底物邻乙基苯基缩水甘油醚和苯基环氧乙烷选择性没有提高以外，对于其它底物的选择性均有一定程度的提高，尤其是突变体N160L对底物对甲基苯基缩水甘油醚的E值提高到了25.77，是原始HHDH_His的13.93倍。

附图说明

图1卤醇脱卤酶HHDH_His及其突变体分离纯化SDS-PAGE分析，其中，泳道M：蛋白质分子量标记；泳道1：纯化的HHDH_His；泳道2：纯化的突变体N160L；泳道3：纯化的突变体Q159L。

图2卤醇脱卤酶HHDH_His及其突变体N160L拆分(R,S)-PGE的液相图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

术语定义

1.对映体过量值(ee)定义为对映体混合物中一个异构体A比另一个异构体B多出来的量占总量的百分比，缩写为ee，公式为(A-B)/(A+B)*100％，对映体过量值用于表示一种手型化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。

2. 20种氨基酸缩写如下表1。

表1 20种氨基酸缩写

本申请采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。如N160L，表示位置160的氨基酸由天冬酰胺替换成亮氨酸，位置的编号对应于卤醇脱卤酶的氨基酸序列。

3.实施例涉及到的菌株和质粒

表2实施例涉及菌株和质粒

4.实施例涉及到的培养基的配制

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L；LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0g/L，琼脂15.0-20.0g/L。在121℃高压灭菌20min备用。

实施例1卤醇脱卤酶的基因挖掘

通过利用已报道的卤醇脱卤酶HheB和HheC序列作为基因探针，在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)中进行同源序列搜索，挖掘潜在的卤醇脱卤酶基因，经过同源序列比对，获得新酶的基因，在大肠杆菌中根据密码子偏好性设计合成新酶基因，并在两端引入Nco I和Xho I酶切位点，由苏州泓迅生物科技有限公司合成新酶基因，在N端添加组氨酸标签后，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，申请人将该卤醇脱卤酶命名为HHDH_His。经检测发现，在加了组氨酸标签以后，卤醇脱卤酶酶活性和选择性影响不大，所以我们选择在N末端加了His-Tag标签的卤醇脱卤酶HHDH_His作为对象，对其分子改造。

实施例2.同源建模

以来源于Agrobaterium radiobater AD1的HheC和来源于Corynebacteriumsp.N-1074的HheB的晶体结构为模板，采用Modeller 9.18对HHDH_His三维立体结构进行同源建模，再利用CHARMM27对模型进行优化，利用评估程序ProCheck进行模型评估，以评估所得模型的可靠性，建模结果利用软件PyMOL 1.2rl进行分析。最终得到了高质量的HHDH_His结构模型。HHDH_His的模型评估结果表明：89.8％位于最适区域，8.2％位于其它允许区域，2.0％位于一般允许区域，没有残基位于不允许区域，说明该模型可靠。通过序列比对及结构分析比对发现，HHDH_His的催化三联体结构为Ser116-Tyr129-Arg133。

实施例3.分子对接

利用分子对接软件Autodock 4.0将卤醇脱卤酶HHDH_His与外消旋PGE活性中心进行分子对接；选择距离底物分子

附近的位点进行定点饱和突变，最终选择的突变位点为Gln159，Asn160，Phe161，Tyr167，Phe168和Pro169，定点突变所采用的引物如表3所示。

表3突变所用的PCR引物

N代表A,T,G or C

对选择的6个位点进行定点饱和突变，每个位点挑选克隆进行活性筛选，首先通过高通量筛选剔除无活性的假阳性菌株，再通过液相检测筛选立体选择性提高的突变菌株。通过对HHDH_His10饱和突变文库的筛选，在Phe161，Tyr167和Phe168位点没有筛选到对映选择性提高的阳性突变体，且大部分活力明显降低，仅有个别突变体活性提高，而在对Gln159、Asn160和Pro169位点饱和突变文库进行筛选时，发现有对映选择性提高的阳性突变体，经测序分别为Q159L、N160L和P169Q。突变体N160L与原始HHDH_His10具有相反的对映选择性，且选择性有明显提高，对映选择性(E)从9.85提高到约21.10，突变体Q159L的选择性也有明显提高(E＝21.80)，突变体P169Q也略有提高，约是原始酶的1.10倍。

实施例4.卤醇脱卤酶及其突变体的诱导表达

分别对HHDH_His及其突变体N160L和Q159L进行诱导表达。将重组卤醇脱卤酶工程菌在37℃，200r/min条件下培养10h，以1％的接种量将带有重组表达质粒的大肠杆菌加入到50mL LB液体培养基中，加入终浓度50mg/L的卡那霉素，仍在37℃，200r/min条件下培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入IPTG诱导剂使其终浓度为0.15mM，诱导其蛋白表达。在28℃，200r/min条件下诱导培养10h左右，5000×g离心5min，收集细胞，用pH 8.0的磷酸盐缓冲液(200mM)将菌体重悬，超声破碎细胞。

实施例5.卤醇脱卤酶及其突变体的纯化

分别对HHDH_His及其突变体N160L和Q159L进行分离纯化。卤醇脱卤酶突变体的表达纯化过程与HHDH_His纯化过程相同。

采用Ni-NTA柱纯化目标蛋白，所有的纯化步骤均在4℃进行，具体纯化方法如下：以湿菌体：磷酸盐缓冲液(20mM，pH 8.0)＝(1g：10mL)的比例混匀重悬湿菌体。通过超声破碎仪进行超声破碎15min，12000rpm离心15min收集上清液，0.22μm滤膜过滤备用。分别用5个柱体积的超纯水和10个柱体积的平衡缓冲液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，500mM NaCl，20mM咪唑，pH 8.0)清洗Ni-NTA柱，流速为1mL/min。利用10倍柱体积的平衡缓冲液洗脱洗去未吸附的酶蛋白，洗脱缓冲液梯度洗脱(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，500mM NaCl，100mM/200mM/250mM/500mM咪唑，pH 8.0)，收集目标蛋白。收集的酶液在磷酸盐缓冲液(20mM，pH 8.0)中冰浴透析过夜，以SDS-PAGE检测蛋白纯度。最后以Bradford法进行定量检测蛋白浓度，以牛血清蛋白BSA作为对照。

通过利用Ni-NTA柱纯化得到电泳纯的卤醇脱卤酶纯酶，如图1所示。由SDS-PAGE结果可以看出，突变体N160L和Q159L的表达量、分子大小和HHDH_His基本一致，这表明对HHDH_His位点的突变并不影响蛋白表达。

实施例6酶活测定及对应选择性分析

对纯化后的卤醇脱卤酶HHDH_His及其突变体的酶活进行验证，并对其对映选择性进行了检测，如表4所示，突变体N160L和Q159L的酶活约为原始酶的56.75％和47.45％。虽然突变体的酶活都有所降低，但是选择性都有明显的提高，突变体活性的增高则导致了对映选择性的降低。突变体N160L改变了酶的对映选择性，与原始HHDH_His具有相反的对映选择性(如图2)，且对映选择性有所提高，N160L突变酶催化(R,S)-PGE的对映选择性(E)从9.85提高到21.60；Q159L突变体催化拆分(R,S)-PGE的选择性提高到了22.18。

表4 HHDH_His及其突变体催化拆分(R,S)-PGE的酶活及其对映选择性

实施例7.卤醇脱卤酶及其突变体的底物特异性

分别以不同的环氧化物为底物，在400μL反应体系中测定该酶的底物特异性。反应体系包括：400μL含有50mM NaN₃的Tris-SO₄缓冲液(100mM，pH 7.5)，20mM的环氧化物底物以及纯酶，28℃条件下振荡反应后，加入乙酸乙酯萃取。所得有机相分别用无水硫酸钠干燥后进行高效液相色谱分析或气相色谱分析。

表5 HHDH_His和突变体催化拆分环氧化物效果比较

^a:无对映选择性

如表5所示，在反应pH 7.5，亲核试剂N₃ ^-存在的条件下，与原始HHDH_His相比，突变体N160L和Q159L对苯基缩水甘油醚类底物总体来说是具有选择性提高的趋势，突变体N160L与原始HHDH_His和突变体Q159L对底物有相反的选择性。当邻、间、对位分别被甲基取代后，突变Q159L的选择性少许提高，而N160L催化拆分对甲基取代底物的选择性有明显的提高，对映体选择性是原始酶的13.92倍。两个突变体对于邻硝基取代及苄基缩水甘油醚底物的拆分选择性均有所提高，而对邻乙基取代却没有选择性，对于苯基环氧乙烷也均没有拆分选择性。

同时我们还测定了突变体N160L催化卤代醇底物1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的单酶串联反应，结果表明，突变体在含有亲核试剂N₃ ^-的Tris-SO₄(pH 7.5,100mM)缓冲液中，该反应最终合成(S)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的ee值和收率分别达到>99％和32.48％，相比较于原始HHDH_His(>99％，25.16％)，ee值和收率均有提高。

HHDH_His在催化(R,S)-PGE开环反应中，环氧化物的氧原子同时和Ser116和Tyr129上的氢原子形成两个氢键，亲核试剂N₃ ^-进攻环氧化物的β-碳原子，Tyr129将来自水分子的一个质子提供给底物的氧原子，促使环氧化物开环，形成β-取代醇。同源建模结果显示，突变体N160L的Ser116和Tyr129两个关键氨基酸分别与(R)-PGE和(S)-PGE对接后，与(R)-PGE形成的两个氢键键长明显比(S)-PGE的键长较长，N₃ ^-会首先进攻距离较近的构型，突变体N160L优先催化拆分(S)-PGE，而原始HHDH_His则正好相反，所以突变体N160L与HHDH_His表现出相反的选择性。同时我们发现，原始HHDH_His和突变体N160L分别与(R)-PGE和(S)-PGE分子对接后的结果显示，Ser116和Tyr129与底物(R)-PGE形成的氢键键长分别从

和

变为和

Ser116和Tyr129与(S)-PGE之间的氢键键长分别从

和

变为

和总体来看原始HHDH_His氢键键长要短一些，相互作用力则更强，这可能是突变体N160L的催化活性略低于HHDH_His的原因。

实施例8.突变体N160L催化拆分(R,S)-PGE

以突变体N160L为催化剂，以(R,S)-PGE为底物，在亲核试剂NaN₃的存在下，催化合成(R)-PGE。反应体系如下：在2mL EP管中加入400μL的Tris-SO₄缓冲液(pH 7.5,100-200mM)，(R,S)-PGE(20-200mM)底物，菌体浓度，亲核试剂NaN₃(50-200mM)，于28℃，200rpm恒温摇床进行反应，间隔取样，加入乙酸乙酯萃取，取出有机相经无水硫酸钠干燥后，采用HPLC检测获得的(R)-PGE收率和ee值。

表6突变体N160L催化(R,S)-PGE合成(R)-PGE

以突变体N160L纯酶为催化剂，考察其催化(R,S)-PGE(20-200mM)的拆分效果，结果如表6所示，在底物浓度低于150mM的条件下，突变体催化外消旋PGE合成(R)-PGE的ee值均可以达到>99％；随着底物浓度的不断增加，反应时间逐渐延长，获得的(R)-PGE的最终收率不断下降，在底物浓度达到150mM时，收率从30.92％下降到14.28％，而在底物(R,S)-PGE浓度达到200mM时，ee值最终达到95.83％。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

序列表

<110> 盐城工学院

<120> 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Gln Leu Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Ile Thr Gln Ala Glu

1 5 10 15

Gln Phe Met Gly Pro Glu Leu Cys Ala Val Phe Ala Ala His Gly Ala

20 25 30

Thr Val Ile Ala Asp Asn Arg Glu Leu Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gln

35 40 45

Arg Ile Val Ser Asp Ala Gly Arg Ile Asp Ala Leu Val Ala Asn Leu

50 55 60

Ser Ile Ala Ala Pro Ala Thr Pro Ala Glu Gln Val Gly Asp Asp Glu

65 70 75 80

Trp Ala Ala Val Phe Ala Ala Leu Val Thr Pro Met Pro Gln Leu Val

85 90 95

Arg Ala Ala Leu Val Gln Met Ile Glu Arg Arg Ser Gly Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Met Gly Ser Ala Ser Ala Leu Arg Gly Met Lys Arg Ala Ser Thr

115 120 125

Tyr Ser Ala Ala Arg Gly Ala Gln Leu Ala Tyr Val Gln Ala Val Gly

130 135 140

Val Glu Met Ala Ala His Asn Ile Gln Ile Asn Ala Ile Ala Gln Asn

145 150 155 160

Phe Val Asp Asn Pro Thr Tyr Phe Pro Ala Glu Val Gln Ala Asn Pro

165 170 175

Arg Phe Gln Glu Arg Leu Lys Arg Glu Val Pro Leu Gly Arg Leu Val

180 185 190

Ala Ala Arg Glu Asp Ala Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Cys Ser Glu Ser

195 200 205

Ala Asn Cys Phe Val Gly Gln Val Phe Pro Val Cys Gly Gly Trp Val

210 215 220

Gln Arg

225

<210> 2

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Pro Gln Leu Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Ile Thr Gln Ala Glu

1 5 10 15

Gln Phe Met Gly Pro Glu Leu Cys Ala Val Phe Ala Ala His Gly Ala

20 25 30

Thr Val Ile Ala Asp Asn Arg Glu Leu Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gln

35 40 45

Arg Ile Val Ser Asp Ala Gly Arg Ile Asp Ala Leu Val Ala Asn Leu

50 55 60

Ser Ile Ala Ala Pro Ala Thr Pro Ala Glu Gln Val Gly Asp Asp Glu

65 70 75 80

Trp Ala Ala Val Phe Ala Ala Leu Val Thr Pro Met Pro Gln Leu Val

85 90 95

Arg Ala Ala Leu Val Gln Met Ile Glu Arg Arg Ser Gly Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Met Gly Ser Ala Ser Ala Leu Arg Gly Met Lys Arg Ala Ser Thr

115 120 125

Tyr Ser Ala Ala Arg Gly Ala Gln Leu Ala Tyr Val Gln Ala Val Gly

130 135 140

Val Glu Met Ala Ala His Asn Ile Gln Ile Asn Ala Ile Ala Leu Asn

145 150 155 160

Phe Val Asp Asn Pro Thr Tyr Phe Pro Ala Glu Val Gln Ala Asn Pro

165 170 175

Arg Phe Gln Glu Arg Leu Lys Arg Glu Val Pro Leu Gly Arg Leu Val

180 185 190

Ala Ala Arg Glu Asp Ala Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Cys Ser Glu Ser

195 200 205

Ala Asn Cys Phe Val Gly Gln Val Phe Pro Val Cys Gly Gly Trp Val

210 215 220

Gln Arg

225

<210> 3

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Pro Gln Leu Leu Ala Gly Lys Arg Val Leu Ile Thr Gln Ala Glu

1 5 10 15

Gln Phe Met Gly Pro Glu Leu Cys Ala Val Phe Ala Ala His Gly Ala

20 25 30

Thr Val Ile Ala Asp Asn Arg Glu Leu Gly Glu Ala Gly Ala Pro Gln

35 40 45

Arg Ile Val Ser Asp Ala Gly Arg Ile Asp Ala Leu Val Ala Asn Leu

50 55 60

Ser Ile Ala Ala Pro Ala Thr Pro Ala Glu Gln Val Gly Asp Asp Glu

65 70 75 80

Trp Ala Ala Val Phe Ala Ala Leu Val Thr Pro Met Pro Gln Leu Val

85 90 95

Arg Ala Ala Leu Val Gln Met Ile Glu Arg Arg Ser Gly Lys Ile Leu

100 105 110

Leu Met Gly Ser Ala Ser Ala Leu Arg Gly Met Lys Arg Ala Ser Thr

115 120 125

Tyr Ser Ala Ala Arg Gly Ala Gln Leu Ala Tyr Val Gln Ala Val Gly

130 135 140

Val Glu Met Ala Ala His Asn Ile Gln Ile Asn Ala Ile Ala Gln Leu

145 150 155 160

Phe Val Asp Asn Pro Thr Tyr Phe Pro Ala Glu Val Gln Ala Asn Pro

165 170 175

Arg Phe Gln Glu Arg Leu Lys Arg Glu Val Pro Leu Gly Arg Leu Val

180 185 190

Ala Ala Arg Glu Asp Ala Glu Phe Ala Ala Tyr Leu Cys Ser Glu Ser

195 200 205

Ala Asn Cys Phe Val Gly Gln Val Phe Pro Val Cys Gly Gly Trp Val

210 215 220

Gln Arg

225

<210> 4

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgccgcaac tgctggcagg taaacgcgtt ctgattaccc aggccgaaca attcatgggt 60

ccggaactgt gcgctgtttt tgcagcacat ggcgcaaccg ttattgcaga taatcgcgaa 120

ctgggcgaag caggcgcacc gcaacgtatt gtttctgacg caggtcgtat tgacgcgctg 180

gttgctaatc tgagtattgc agcaccggca accccggcag aacaagttgg cgacgacgag 240

tgggcagcag tttttgcagc tctggttacc ccgatgccgc aactggttcg cgctgctctg 300

gttcagatga ttgaacgtcg cagcggcaaa attctgctga tgggttctgc ttctgctctg 360

cgtggtatga aacgcgcaag cacctattct gcagcacgtg gcgcacaact ggcatacgtt 420

caagctgttg gcgttgaaat ggccgcacat aacatccaga tcaacgcgat tgcgcagaac 480

ttcgttgata acccgaccta ttttccggcg gaagttcagg caaatccgcg tttccaggaa 540

cgtctgaaac gcgaagttcc gctgggtcgt ctggttgcag cacgcgaaga cgcagaattt 600

gccgcttatc tgtgtagcga aagcgcaaat tgcttcgttg gccaggtttt tccggtttgt 660

ggcggttggg ttcaacgtta a 681

<210> 5

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgccgcaac tgctggcagg taaacgcgtt ctgattaccc aggccgaaca attcatgggt 60

ccggaactgt gcgctgtttt tgcagcacat ggcgcaaccg ttattgcaga taatcgcgaa 120

ctgggcgaag caggcgcacc gcaacgtatt gtttctgacg caggtcgtat tgacgcgctg 180

gttgctaatc tgagtattgc agcaccggca accccggcag aacaagttgg cgacgacgag 240

tgggcagcag tttttgcagc tctggttacc ccgatgccgc aactggttcg cgctgctctg 300

gttcagatga ttgaacgtcg cagcggcaaa attctgctga tgggttctgc ttctgctctg 360

cgtggtatga aacgcgcaag cacctattct gcagcacgtg gcgcacaact ggcatacgtt 420

caagctgttg gcgttgaaat ggccgcacat aacatccaga tcaacgcgat tgcgctaaac 480

ttcgttgata acccgaccta ttttccggcg gaagttcagg caaatccgcg tttccaggaa 540

cgtctgaaac gcgaagttcc gctgggtcgt ctggttgcag cacgcgaaga cgcagaattt 600

gccgcttatc tgtgtagcga aagcgcaaat tgcttcgttg gccaggtttt tccggtttgt 660

ggcggttggg ttcaacgtta a 681

<210> 6

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgccgcaac tgctggcagg taaacgcgtt ctgattaccc aggccgaaca attcatgggt 60

ccggaactgt gcgctgtttt tgcagcacat ggcgcaaccg ttattgcaga taatcgcgaa 120

ctgggcgaag caggcgcacc gcaacgtatt gtttctgacg caggtcgtat tgacgcgctg 180

gttgctaatc tgagtattgc agcaccggca accccggcag aacaagttgg cgacgacgag 240

tgggcagcag tttttgcagc tctggttacc ccgatgccgc aactggttcg cgctgctctg 300

gttcagatga ttgaacgtcg cagcggcaaa attctgctga tgggttctgc ttctgctctg 360

cgtggtatga aacgcgcaag cacctattct gcagcacgtg gcgcacaact ggcatacgtt 420

caagctgttg gcgttgaaat ggccgcacat aacatccaga tcaacgcgat tgcgcagcta 480

ttcgttgata acccgaccta ttttccggcg gaagttcagg caaatccgcg tttccaggaa 540

cgtctgaaac gcgaagttcc gctgggtcgt ctggttgcag cacgcgaaga cgcagaattt 600

gccgcttatc tgtgtagcga aagcgcaaat tgcttcgttg gccaggtttt tccggtttgt 660

ggcggttggg ttcaacgtta a 681