单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用
阅读说明：本技术 单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用 (Application of single cell sequencing as marker in preparation of diagnosis of primary sicca syndrome ) 是由 万磊 刘健 黄传兵 谌曦 范海霞 葛瑶 刘天阳 刘磊 李明 赵磊 孙广瀚 朱子 于 2021-08-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用,单细胞测序通过流式活化细胞分离外周血单个核细胞得到,原发性干燥综合征中主要由NK细胞组成,其次为T细胞和B细胞。本发明的单细胞测序技术在单个细胞水平上对基因组、转录组、蛋白质组及表观基因组进行测序,能够从组织样本中获得不同细胞间的异质性信息,具备准确、高效、安全可靠的优点,从而在细胞层面筛选出干燥综合征的差异表达标志物,弥补干燥综合征诊断的不足；本发明的单细胞测序简便,不需特别准备、不需特定时间,随时随地均可采集标本。另外,其还有创伤性极小和敏感性高的优点。(The invention provides an application of single cell sequencing as a marker in preparation and diagnosis of primary sicca syndrome, wherein the single cell sequencing is obtained by separating peripheral blood mononuclear cells through flow activated cells, the primary sicca syndrome mainly comprises NK cells, and T cells and B cells are used in the secondary sicca syndrome. The single cell sequencing technology provided by the invention can sequence the genome, the transcriptome, the proteome and the epigenome on a single cell level, can obtain heterogeneity information among different cells from a tissue sample, and has the advantages of accuracy, high efficiency, safety and reliability, so that differential expression markers of sjogren's syndrome are screened out at a cell level, and the defect of diagnosis of sjogren's syndrome is made up; the single cell sequencing of the present invention is simple, needs no special preparation and no specific time, and can collect sample at all times and places. In addition, it has the advantages of minimal invasiveness and high sensitivity.)
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用。
背景技术
原发性干燥综合征(pSS)起病多隐匿，大多数患者很难说出明确起病时间，临床表现多样，可涉及全身多个系统，病情轻重差异较大，治疗手段有限。pSS临床广泛而复杂，是一个易被误诊、漏诊的病种，其诊断标准的制定在五十多年发展、演化的过程中先后出现了13个分类标准，但至今临床应用上仍存在各种不满意。pSS缺乏单一而客观的诊断指标，传统诊断常需要依据多项指标根据分类标准进行综合分析，包括主观症状以及唾液腺、眼部、血清学和组织病理学等客观检查。
主观症状的衡量及评定具有显著的个体及地区差异，特异性较差；唾液流率的个体差异较大，没有统一的采集方法；Schirmer试验、眼部染色评分、泪膜破裂试验，可评价泪腺的分泌功能，但其参数在各个标准中有较大差异，不同程度pSS患者干眼表现差别较大，一部分pSS患者眼部尚未出现明显受累，因此这些方法缺乏特异性，且结果误差较大；自身抗体尽管具有重要的诊断价值，但约有三分之一患者抗体阴性，当前用于实验室诊断的自身抗体-抗SSA、抗SSB、抗M3、抗心磷脂抗体和α-纤维蛋白抗体普遍存在着特异性或者敏感性较低的缺陷；组织病理学检查一般采用唇腺活检，但由于其为有创性操作，患者难以接受，临床使用率较低且不利于预后评估，因此在病理诊断过程中面临着难以广泛实施的困境。特异性自身抗体检查阴性并不能排除pSS的诊断，唇腺活检因其有创性操作为患者身心带来极大痛苦，在临床的应用并不广泛，唾液腺和眼部检查，个体差异大、特异性欠佳。
多学科合作和多种分类条目的检查对pSS的诊断提出了挑战，导致该病诊断与治疗相对滞后。因此，新型诊断方式亟待被发掘，探索提高pSS诊断准确性的方法迫在眉睫。单细胞测序(single cell sequencing,SCS)技术，在pSS早期诊断、发展和预后评估中都具有极大的潜力。目前尚未有将单细胞测序法应用于干燥综合征的诊断。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用。
优选地，单细胞测序通过流式活化细胞分离外周血单个核细胞得到。
优选地，外周血单个核细胞包括B细胞、NK细胞、T细胞、单核细胞和血小板细胞。
优选地，原发性干燥综合征主要由NK细胞组成。
优选地，原发性干燥综合征还包括T细胞和B细胞。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明的单细胞测序技术在单个细胞水平上对基因组、转录组、蛋白质组及表观基因组进行测序，能够从组织样本中获得不同细胞间的异质性信息，具备准确、高效、安全可靠的优点，从而在细胞层面筛选出干燥综合征的差异表达标志物，弥补干燥综合征诊断的不足。
第二、本发明的单细胞测序简便，不需特别准备、不需特定时间，随时随地均可采集标本。
第三、本发明的单细胞测序技术创伤性极小，普通静脉抽血，此项检测仅抽血3mL左右即可，且为无创新检测，不同于干燥综合征唇腺活检技术(因其有创性操作为患者身心带来极大痛苦)，患者痛苦性减少。
第四、本发明敏感性高，能早期检测出干燥综合征患者，很多标志物出现浓度异常往往早于自身抗体异常，甚至早于典型口干、眼干症状异常之前。
附图说明
图1为本发明的对照者(CN)和原发干燥综合征者(pSS)的UMAP聚类可视化示意图。
图2为本发明的CN和pSS中测序PBMC的细胞类型图。
图3为本发明的CN和pSS中PBMC的细胞表达示意图。
图4为本发明的CN和pSS中T细胞亚群的示意图。
图5为本发明的T细胞亚群中不同细胞的表达过程图。
图6为本发明的不同T细胞亚型在pSS过程中的含量图。
具体实施方式
本发明提供了一种单细胞测序作为标志物在制备诊断原发性干燥综合征中的应用。
从对照组(CN)和活动性原发性干燥综合征(pSS)中分离外周血单个核细胞(PBMC)，利用10x基因组学平台进行单细胞RNA测序(scRNA-seq)。使用Seurat包基于基因表达谱对细胞进行无监督聚类，并传递给UMAP进行聚类可视化(如图1)。
具体地，
1、单细胞RNA序列工作流程
PBMC是从全血中分离出来的。基于BD-Rhapsody系统全转录组分析alpha协议进行单细胞全转录组分析，将捕获的单细胞转录组微珠构建成包含细胞标签和UMI信息的cDNA文库。简单地说，首先从捕获的单细胞转录体中提取双链cDNA，经过反转录、第二链合成、末端准备、连接接合器和全转录体扩增等步骤。用BD-Rhapsody-cDNA试剂盒(BD-Biosciences，633773)和BD-Rhapsody-Targeted-mRNA&AbSeq扩增试剂盒(BD-Biosciences，633774)进行随机引物扩增，得到最终的cDNA文库。在NovaSeq仪器(Illumina)上以PE150模式对文库进行测序(读取150bp的对端)。
2、单细胞数据预处理、基因表达定量和细胞类型测定
原始读取通过BD-Rhapsody全转录组分析管道(Early access)进行处理，包括按读取质量过滤、注释读取、注释分子、确定假定细胞和生成单细胞表达矩阵。简言之，在读取质量过滤步骤中，首先去除测序质量低(过长、过短、测序分数低或单核苷酸频率高)的读取对。对筛选出的R1读序列进行分析，以鉴定细胞标签序列(CL)、分子识别序列(UMI)和poly-dT尾序列，同时在读注释步骤中使用STAR(verison 2.5.2b)[1]将筛选出的R2读序列映射到ensembl hg19。利用递归替代误差校正(RSEC)和基于分布的误差校正(DBEC)算法对分子注释步骤中由于放大偏差而产生的伪影分子进行进一步的校正。在假定细胞测定步骤中，利用二阶导数分析将假定细胞与背景噪声区分开来。最后，将假定的细胞信息与RSEC/DBEC调节分子结合，生成单细胞表达矩阵。管道输出提供经RSEC和DBEC算法校正的原始基因表达矩阵。在所有的矩阵中，用DBEC算法校正的每个细胞的UMI计数用于聚类分析。将来自两个盒的原始基因表达矩阵分别读入R(版本3.6.0)，并使用Seurat R包(版本3.0.1)[2]。将其转换为Seurat对象。两批间用seurat R包进行CCA整合。两组样本共获得21373个细胞有待进一步分析。然后将基因表达矩阵标准化为总细胞UMI计数。选择前2000个特征作为高变异基因进行聚类分析。在根据UMI计数对数据进行缩放之后，基于在上一步中确定的高度可变的基因执行PCA以降低维数。在此基础上，根据pcheat图、Jackstraw图和pcelbow图选取前50个主分量，利用tSNE算法进一步降维。使用RunTSNE函数用默认设置标识集群。然后用规范的聚类标记对每个聚类进行注释。利用GSVA R包[3]中以MSigDB hallmark基因集用于GSEA分析[4]。单细胞制备、文库构建和测序由上海傲集生物科技有限公司完成。
结果：
1.scRNA序列揭示PMBC中新的细胞类型标记
首先从CN和pSS的两个细胞池中分离并测序PBMC悬浮液。对11792个PBMC进行测序，剔除可代表双链体、空液滴、低质量细胞和血小板的非靶细胞后，进一步分析了6929个PBMC，其中1433个来自健康对照人的细胞和5496个来自pSS的细胞。使用Seurat软件包的无监督聚类在两组中鉴定了21个不同的细胞簇和5种类型的细胞，5种类型的细胞分别为B细胞、NK细胞(Myeloid)、T细胞、单核细胞、血小板细胞(Platelet)(图2)。B细胞(约占所有细胞的12.1％)、NK细胞(占所有细胞的17.8％)主要表达CD79A，T细胞(约占所有细胞的21.5％)主要表达CD3E，单核细胞(约占所有细胞的48.3％)主要表达CD14，血小板细胞主要表达PF4。(图3)。scRNA序列表明，从CN分离的PBMC主要由T细胞(约51.2％)组成，其次是髓细胞(约31.8％)和B细胞(约17.0％)。相反，与CN相比，pSS中髓样细胞(-53.0％)的频率较高，T细胞(-36.4％)和B细胞(-10.9％)的频率较低。
2.scRNA-seq鉴定T细胞亚群，揭示pSS中T细胞亚群分布的特点
scRNA-seq分析在所有两个供体组中检测到2715个T细胞。在pSS PBMCs上，T细胞可调控185个基因，包括113个上调基因和72个下调基因。前4位下调基因为金属硫蛋白，包括MT2A、MT1X、MT1E和MT1F，前4位上调基因为SKIL、BTN3A2、GZMH和SSBP3。
2715个T细胞可分为14个亚群(图4)。14个亚群中有13个表达高水平的CD3(包括CD3D、CD3E和CD3G)。4个不同的CD4+T细胞亚群：0、1、2和11。确定了8个不同的CD8+T细胞亚群：4、5、6、7、9、12、13和14。如图5所示，T0表达高水平CD4+T细胞标记物和功能性标记物，如TCF7，其调节T细胞的运输和迁移。簇8和簇11高表达KLRD1、NKG7等，它们表达NK细胞。
为了进一步观察不同T细胞亚型在pSS过程中的作用，对T细胞进一步亚组分析，并确定了5种T细胞亚型(图6)。5种T细胞亚型鉴定为CD4+幼稚T细胞、CD8+幼稚T细胞、CD8+效应T细胞、NK细胞、增殖性T细胞。与pSS组和对照组T细胞亚型分布比较，pSS组幼稚CD8+T细胞含量显著降低，效应T细胞含量显著升高，炎征状态可引起CD8+T细胞功能激活。
参考文献：
[1].Dobin A,Davis CA,Schlesinger F,Drenkow J,Gingeras TR:STAR:ultrafast universal RNA-seq aligner.Bioinformatics 2013,29(1):15-21.
[2].Butler A,Hoffman P,Smibert P,Papalexi E,Satija R:Integratingsingle-cell transcriptomic data across different conditions,technologies,andspecies.Nature Biotechnology 2018,36(5)：411-420.
[3].S,Castelo R Fau-Guinney J,Guinney J:GSVA:gene setvariation analysis for microarray and RNA-seq data.BMC Bioinformatics,2013,14:7(1471-2105-14-7.).
[4].Liberzon A,Birger C,Thorvaldsdóttir H,Ghandi M,Mesirov J,TamayoP:The Molecular Signatures Database(MSigDB)hallmark gene set collection.CellSyst 2015,1(6):417-425.
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。