一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法
阅读说明：本技术 一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法 (Evaluation method for nucleic acid extraction efficiency of new coronavirus (2019-nCoV) ) 是由 隋志伟 刘思渊 黄文锋 于 2021-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明建立了一种评价新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的方法,提取前采用流式分析技术结合免疫荧光探针技术精确定量检测2019-nCoV病毒颗粒数,提取后使用数字PCR(dPCR)精确定量检测2019-nCoV病毒核酸拷贝数,该核酸拷贝数与提取前测得的颗粒数的比值即为核酸提取效率。本方法可以识别并定量检测2019-nCoV颗粒,可以准确评价2019-nCoV核酸提取效率,且评价方式直接有效,评价结果可溯源。(The invention establishes a method for evaluating nucleic acid extraction efficiency of a new coronavirus (2019-nCoV), wherein before extraction, a flow analysis technology is adopted to be combined with an immunofluorescence probe technology to accurately and quantitatively detect the number of particles of the new coronavirus (2019-nCoV), after extraction, a digital PCR (dPCR) is used to accurately and quantitatively detect the copy number of nucleic acid of the new coronavirus (2019-nCoV), and the ratio of the copy number of the nucleic acid to the number of particles measured before extraction is the nucleic acid extraction efficiency. The method can identify and quantitatively detect the 2019-nCoV particles, can accurately evaluate the 2019-nCoV nucleic acid extraction efficiency, has a direct and effective evaluation mode, and has a traceable evaluation result.)
技术领域
：本发明属于公共卫生领域，涉及新型冠状病毒的检测方法，特别涉及一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法。
背景技术
：实时荧光RT-PCR检测因具备灵敏度高、特异性强的特点，是目前检测新冠病毒核酸的主要方法。但随着检测工作的大量开展，人们发现荧光RT-PCR检测的阳性检出率仅仅为30％～50％。其中，最重要的原因是不同的核酸检测试剂核酸提取方法的效率不同。因此，需要对不同试剂盒的核酸提取方法的提取效率进行评价。
核酸提取效率，是指提取后与提取前的核酸拷贝数的比值。然而，2019-nCoV核酸在提取前是完全被包裹在病毒颗粒内部的，无法直接测定拷贝数。
目前常见的核酸提取效率评价方法，是采用不同提取方法对同一份样品进行提取并分别测量提取后的核酸拷贝数，来比较不同方法的提取效率的高低。但是这个方法只能得到一个相对的结果，无法真正计算方法的提取效率。
还有研究使用2019-nCoV核酸标准品取代病毒颗粒进行评价，即使用待评价的方法对核酸标准品进行一次提取操作，并通过测量提取过程中的核酸损失量来间接计算提取效率。然而该方法忽视了实际提取操作中，病毒裂解效率对提取效率的影响，使得评价结果不准确。
因此，只有准确测量2019-nCoV颗粒的数量，方可对核酸提取方法的提取效率进行准确有效的评价！
然而，目前尚无任何可以精确定量检测2019-nCoV颗粒的方法。国内外主流检测技术，包括核酸检测、抗体检测、抗原检测，都是单纯检测核酸或者单纯检测表面蛋白，无法证明样品中含有病毒颗粒，并且上述方法也无法精确检测病毒颗粒的数量。
综上所述，为了准确有效地评价新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率，有必要开发一种能够精确定量检测2019-nCoV颗粒的方法，用于核酸提取前的病毒颗粒浓度测量。
发明内容
：本发明的目的是提供一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法，该方法首先必须能够实现2019-nCoV颗粒的精确定量检测。
因此，要达到上述发明目的，必须解决如下三个技术壁垒。
技术关键1：解决如何准确识别2019-nCoV颗粒的难点，建立新冠病毒的荧光标记方法。
需要克服的困难：
目前国内外主流检测技术，包括核酸检测、抗体检测、抗原检测，都是单纯检测核酸或者单纯检测表面蛋白，无法证明样品中含有病毒颗粒。
需要同时识别病毒表面特异性蛋白以及内部核酸，方可证明样品中含有病毒颗粒。虽然细菌的荧光标记方法已经很成熟，而病毒的荧光标记方法，尤其是新冠病毒，还存在许多待解决的问题：例如新冠病毒的核酸为RNA，而细菌的核酸是DNA。能用于细菌染色的荧光染料一般无法用于病毒染色。
解决的手段：
第一，研制出适合的2019-nCoV的特异性抗体。
选择2019-nCoV的S蛋白和N蛋白作为靶标，研制了2019-nCoV的S蛋白抗体和N蛋白抗体。将S蛋白抗体偶联红色荧光探针，将N蛋白抗体偶联橙色荧光探针。同时使用2种抗体对2019-nCoV进行特异性荧光标记，并使用流式分析仪对2019-nCoV的荧光进行分析。
本发明确定适用于本发明目的2019-nCoV的S蛋白的技术指标是：a)所述抗体可以在流动相内与2019-nCoV发生反应；b)所述抗体经过红色荧光探针交联后，能够对2019-nCoV进行荧光标记，且红色荧光可以被流式分析仪检测到；c)所述抗体与2019-nCoV的S蛋白的亲和力KD应小于1×10-10。
达到上述要求的抗体均可用于本发明方法。
本发明确定适用于本发明目的2019-nCoV的N蛋白的技术指标是：a)所述抗体可以在流动相内与2019-nCoV发生反应；b)所述抗体经过橙色荧光探针交联后，能够对2019-nCoV进行荧光标记，且橙色荧光可以被流式分析仪检测到；c)所述抗体与2019-nCoV的N蛋白的亲和力KD应小于1×10-10。
达到上述要求的抗体均可用于本发明方法。
第二，研制出能识别2019-nCoV基因组的绿色荧光探针
本发明从多个核酸探针(实施例1)，筛选出效果好的，能识别2019-nCoV基因组的，适用于流式分析仪的绿色荧光探针，命名为Grn-3(实施例3、4)，现保存于中国计量科学研究院。
技术关键2：如何实现2019-nCoV颗粒的定量检测，选择合适的检测装置
需要克服的困难：
2019-nCoV是一种冠状病毒，属于微生物范畴。流式分析技术是一种多参数的微生物分析技术，可以同时分析微生物的数量、大小及生物特性，已成功地用于细菌的检测。然而，目前还少见流式分析技术检测病毒，因为检测病毒会比检测细菌困难许多。
因为病毒和细菌最大的不同就是尺寸大小的不同。细菌大小通常1μm左右(0.5μm至3μm)，而病毒仅100nm左右，比细菌小太多。流式分析仪的灵敏度通常很难达到检测要求，检测100nm大小的新冠病毒时，很多100nm左右的背景颗粒无法被散射光区分。
解决的手段：
首先，对市面上几乎所有品牌的流式分析仪进行了筛选和验证，筛选出了适用于微小颗粒分析的纳米级流式分析仪，并对流式分析仪的关键技术参数进行确定。
本发明确定适用于本发明目的流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度<10MESF，散射光灵敏度<30nm，荧光分辨率RSD<3％，散射光分辨率<3％。
其次，将流式分析技术结合免疫荧光探针技术，开发出定量检测病毒颗粒的方法。其步骤是：1)区分样品中的2019-nCoV和其它背景颗粒：同时使用红色荧光探针通过化学基团交联的2019-nCoV的S蛋白抗体，和使用橙色荧光探针通过化学基团交联的2019-nCoV的N蛋白抗体，对2019-nCoV的特异性外壳蛋白进行标记；2)区分样品中的2019-nCoV颗粒和2019-nCoV颗粒碎片：使用绿色的核酸荧光探针，标记2019-nCoV核酸的基因组；3)通过流式分析仪同时计数1)和2)产生的红色、橙色和绿色荧光信号，实现2019-nCoV颗粒的快速定量检测。
技术关键3：获取新冠病毒样本有较大难度，需要获得来自临床病人的真实样本
需要克服的困难：
2019-nCoV具有强传染性，属于第二类病原微生物，但是按照第一类病原微生物进行管理。方法开发时，样本的获取本身就是一件困难的事情。
检测细菌时，如果样品中细菌数量浓度达不到检测限，可以用各种方法进行培养，富集。而病毒的检测样本不可以培养，新冠病毒样本一般都取自病人的真实样本。这对检测又带来较大难度。
解决的手段：
项目组于2020年专程前往武汉金银潭医院，收集到了新冠患者病毒真实样本。
据此，本发明首次建立了一种新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价方法，包括以下步骤：
1)将一份含有2019-nCoV的样品混匀后分为两份(一份用于测颗粒浓度；另一份做核酸提取，两份浓度相同)。
2)取其中一份样品，测定2019-nCoV颗粒的浓度；
3)用待评价的核酸提取方法提取另一份样品中2019-nCoV病毒的核酸；
4)采用数字PCR(dPCR)技术测定步骤3)提取的核酸拷贝数；
5)按照下列公式，计算待评价核酸提取方法的提取效率E；
式中，E为待评价方法的的核酸提取效率；
cdPCR为步骤4)得到的核酸拷贝数，单位copies/μL；
cFCM为步骤2)得到的颗粒的浓度，单位events/μL。
其中，步骤2)中所述的测定2019-nCoV颗粒，方法如下：
(1)区分样品中的2019-nCoV和非生物性背景颗粒：
用荧光探针通过化学基团交联的2019-nCoV的S蛋白抗体和N蛋白抗体同时对2019-nCoV的特异性外壳蛋白进行标记；所述S蛋白抗体使用红色荧光探针，所述N蛋白抗体使用橙色荧光探针；
(2)区分样品中的2019-nCoV颗粒和2019-nCoV碎片：
使用绿色的核酸荧光探针标记2019-nCoV核酸的基因组；
(3)通过流式分析仪计数1)和2)产生的红色、橙色和绿色荧光信号，实现2019-nCoV颗粒的快速定量检测；
上述(3)中，对于一个颗粒产生的事件，判定方法如下：
如果仅检测红色荧光，则判定为2019-nCoV的S蛋白碎片；
如果仅检测橙色荧光，则判定为2019-nCoV的N蛋白碎片；
如果同时检测到红色、橙色和绿色三种荧光，则判定为2019-nCoV颗粒；
如果未检测到荧光，则判定为非生物性的杂质颗粒。
所述2019-nCoV的S蛋白抗体的技术指标如下：1)所述抗体可以在流动相内与2019-nCoV发生反应；2)所述抗体经过红色荧光探针交联后，能够对2019-nCoV进行荧光标记，且红色荧光可以被流式分析仪检测到3)所述抗体与2019-nCoV的S蛋白的亲和力KD应小于1×10-10。
所述2019-nCoV的N蛋白抗体的技术指标如下：1)所述抗体可以在流动相内与2019-nCoV发生反应；2)所述抗体经过橙色荧光探针交联后，能够对2019-nCoV进行荧光标记，且橙色荧光可以被流式分析仪检测到；3)所述抗体与2019-nCoV的N蛋白的亲和力KD应小于1×10-10。
所述通过流式分析仪计数，是通过流式分析仪的散射光通道进行圈门，并通过三荧光通道检测所述红色、橙色和绿色荧光信号，从而计数2019-nCoV颗粒；其中，前向角散射光通道的圈门在60nm到150nm之间。所述圈门，其方法为：使用流式分析仪测量60nm标准微球和150nm标准微球，在前向角散射光通道的直方图上，根据微球的信号位置进行圈门，下限在60nm，上限在150nm。
所述红色荧光探针的荧光发射光谱在601nm～640nm；所述橙色荧光探针的荧光发射光谱在551nm～590nm；所述绿色荧光探针的荧光发射光谱在501nm～540nm。
所述流式分析仪的技术指标和检测参数是：荧光灵敏度<10MESF，散射光灵敏度<30nm，荧光分辨率RSD<3％，散射光分辨率<3％。
所以，通过上述方法，即可实现新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率的评价。
本发明用大量实验清楚公开了本发明的方法，详见实施例。其中：
实施例1为S蛋白抗体和N蛋白抗体的筛选。
实施例2为2019-nCoV外壳的特异性双荧光标记。
实施例3为2019-nCoV核酸荧光探针的筛选。
实施例4为2019-nCoV病毒颗粒测量方法的特异性评价。
实施例5为五个品牌的核酸提取试剂的比较。
以下是本发明一次实际检测的具体操作。
1、提取前2019-nCoV颗粒浓度测量：终浓度为1μg/mL的红色荧光探针交联的S蛋白抗体(Rd-S-Ab)、终浓度为1μg/mL的橙色荧光探针交联的N蛋白抗体(Org-N-Ab)和浓度为1μg/mL的2019-nCoV核酸绿色荧光探针(Grn)，加入到样本溶液，混匀后避光孵育10～30min。随后使用流式分析仪进行检测，流式分析仪前向角散射光通道的圈门在50nm到150nm之间。通过对圈门内的事件在三荧光通道进行分析，计算2019-nCoV颗粒浓度cFCM。
2、核酸提取：使用待评价的核酸提取方法，提取平行样品中2019-nCoV的核酸；
3、提取后2019-nCoV核酸拷贝数测量：使用dPCR技术，测量提取后的样本中2019-nCoV的N基因、E基因和Orf1ab基因的拷贝数，并计算三个基因拷贝数的平均值。
4、提取效率计算：使用公式计算新冠病毒(2019-nCoV)核酸提取效率。
本发明具有以下创新和优点：
1、可以识别并定量检测2019-nCoV颗粒；
2、可以准确评价2019-nCoV核酸提取效率
3、评价方式直接有效，评价结果可溯源。
附图说明
图1是实施例2中2019-nCoV颗粒的外壳的荧光标记。其中，图1上是S蛋白抗体(Rd-S-Ab)单独标记后的流式检测结果；图1中是N蛋白抗体(Org-N-Ab)单独标记后的流式检测结果；图1下是Rd-S-Ab和Org-N-Ab双荧光标记后的流式检测结果。
图2是实施例3中5个不同的绿色荧光探针标记2019-nCoV核酸后，使用流式分析仪检测的结果。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不能限制本发明的范围。
以下实施例中所用的实验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规试剂或材料。未注明具体条件的实验方法，按照常规条件或者制造厂商的建议条件进行。
实施例1 2019-nCoV的S蛋白抗体和N蛋白抗体的筛选
一、材料与方法
1.选择5个2019-nCoV的S蛋白抗体(编号S-Ab-1到S-Ab-5)稀释至相同初始浓度，并分别进行2倍系列稀释。
2.使用EDC/NHS反应，将2019-nCoV的S蛋白链接到羧基芯片上。并将该羧基芯片装入分析相互作用分析仪中。
3.对于一个S蛋白抗体，将2倍系列稀释的抗体，分别上样分子互作仪，收集数据，并用TraceDrawer对一系列反应曲线进行拟合，并对计算该抗体和S蛋白的亲和力KD。
4.参考步骤1至3，测定5个2019-nCoV的N蛋白抗体(编号N-Ab-1到N-Ab-5)与N蛋白的亲和力。
二、实验结果
使用分析相互作用分析仪，对5个2019-nCoV的S蛋白抗体和N蛋白抗体的亲和力进行分析，所得结果如表1所示。结果表明，抗体S-Ab-2和S蛋白的亲和力最好，为2.31×10-11；抗体N-Ab-3和N蛋白的亲和力最好，为3.99×10-11。
三、实验结论
本发明的筛选出了亲和力最好的2019-nCoV的S蛋白抗体(S-Ab-2)和N蛋白抗体(N-Ab-3)。
表1S蛋白和N蛋白的抗原抗体亲和力
实施例22019-nCoV外壳的双荧光标记
一、材料与方法
1.使用Cy5抗体偶联试剂盒将2019-nCoV的S蛋白抗体(S-Ab-2)标记红色荧光素Cy5，得到Rd-S-Ab。使用PE抗体偶联试剂盒将N蛋白抗体(N-Ab-3)标记橙色荧光素PE，得到Org-N-Ab。
2.经过纯化的2019-nCoV颗粒，来自武汉金银潭医院的新冠病毒患者唾液样本。
3.终浓度为1μg/mL的红色荧光探针交联的S蛋白抗体(Rd-S-Ab)和终浓度为1μg/mL的橙色荧光探针交联的N蛋白抗体(Org-N-Ab)，加入到样本溶液，混匀后避光孵育30min。
4.用流式分析仪进行检测。前向角散射光通道的圈门在50nm到150nm之间。通过对圈门内的事件在FL2和FL3荧光通道进行分析，计算2019-nCoV颗粒浓度。
二、实验结果
流式分析仪圈门内颗粒，都可以在红色荧光通道(FL3)的直方图中观察到红色荧光，同时可以在橙色荧光通道的直方图中观察到橙色荧光。并且在FL2-FL3散点图中，同时具有两种荧光的颗粒可以与背景颗粒区分开来。说明2019-nCoV颗粒成功标记上了红色荧光和橙色荧光(图1)。
三、实验结论
本发明筛选出的、荧光标记的Rd-S-Ab和Org-N-Ab，可以在流动相中与2019-nCoV颗粒发生反应。且双荧光标记的2019-nCoV颗粒可以被流式分析仪检测到。
实施例3 2019-nCoV核酸的荧光标记
一、材料与方法
1.选择6个2019-nCoV的核酸荧光探针(编号Grn-1到Grn-5)稀释至相同初始浓度1μg/mL。
2.经过纯化的2019-nCoV颗粒，来自武汉金银潭医院的新冠病毒患者唾液样本。使用DNA清除剂，清楚样本中的DNA。
3.将Grn-1到Grn-5，分别加入到样本溶液，混匀后避光孵育30min。
4.用流式分析仪进行检测。前向角散射光通道的圈门在50nm到150nm之间。通过对圈门内的事件在FL1荧光通道进行分析，计算2019-nCoV颗粒浓度。
二、实验结果
Grn-1、Grn-2、Grn-5无法使得圈门内2019-nCoV颗粒标记绿色荧光。Grn-4虽然可以标记2019-nCoV，但是无法将2019-nCoV与背景颗粒区分开。仅Grn-3可以使得圈门内2019-nCoV颗粒标记绿色荧光，并与背景颗粒区分开来(图2)。
三、实验结论
本发明筛选出效果好的，能识别2019-nCoV基因组的，适用于流式分析仪的绿色荧光探针，命名为Grn。
实施例4流式测量方法特异性的验证
一、材料与方法
1.经过纯化的2019-nCoV颗粒，来自武汉金银潭医院的新冠病毒患者唾液样本。使用DNA清除剂，清楚样本中的DNA。
2.经过纯化的水疱性口炎病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、甲肝病毒、丙肝病毒、肠道病毒71型，来源于中科院武汉病毒所。
3、终浓度为1μg/mL的红色荧光探针交联的S蛋白抗体(Rd-S-Ab)、终浓度为1μg/mL的橙色荧光探针交联的N蛋白抗体(Org-N-Ab)和浓度为1μg/mL的2019-nCoV核酸绿色荧光探针(Grn)，加入到2019-nCoV样本溶液，混匀后避光孵育10～30min。
4、流式分析仪检测：前向角散射光通道的圈门在50nm到150nm之间。通过对圈门内的事件在三荧光通道进行分析，计算2019-nCoV颗粒浓度。
5.重复步骤3和4，测量对照组的病毒样本。
二、实验结果
将2019-nCoV颗粒以及不同病毒的溶液分别与Rd-S-Ab、Org-N-Ab和Grn反应，然后使用流式分析仪进行检测，以验证方法的特异性。结果(表2)显示，仅2019-nCoV颗粒同时检测到了红、橙、绿三种荧光，其它病毒均仅检测到绿色荧光。
三、实验结论
流式测量方法具有良好的特异性，可以准确识别2019-nCoV。
表2流式方法的特异性实验结果
实施例5五个品牌的核酸提取试剂的比较
一、材料与方法
1.经过纯化的2019-nCoV颗粒，来自武汉金银潭医院的新冠病毒患者唾液样本。使用DNA清除剂，清楚样本中的DNA。将2019-nCoV颗粒溶液进行浓缩，使得其浓度达到约107个/mL，并使用流式分析技术测量其精确浓度。
2.五个品牌的核酸提取试剂的信息如表3所示。分别使用5个试剂盒，对2019-nCoV样本进行核酸提取。
表3五个品牌的核酸提取试剂基本情况
3.使用dPCR分别对5份提取后的样本进行核酸拷贝数测量。
二、实验结果
结果显示，样本中新冠病毒颗粒的浓度为4.2×107events/mL。五个品牌(A至E)核酸提取试剂的提取效率分别是：48.5％、67.6％、59.3％、55.4％、63.0％。
三、实验结论
本方法可以直接有效准确评价新冠病毒的核酸提取效率。