阅读说明：本技术 一种多肽类复合生物保鲜剂及其应用 (Polypeptide composite biological preservative and application thereof ) 是由 谢海伟 吴琳芝 黄欲菲 吴思婷 莫小燕 区嘉朗 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种多肽类复合生物保鲜剂及其应用,包括合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和抗菌组分；所述抗菌组分为壳聚糖和Nisin中的一种或两种。采用本发明提供的技术方案解决了现有缺少对低温环境下的冷鲜肉进行保鲜的应用技术问题。(The invention discloses a polypeptide composite biological preservative and application thereof, comprising synthetic tachyplesin antimicrobial peptide Tac I and an antimicrobial component; the antibacterial component is one or two of chitosan and Nisin. The technical scheme provided by the invention solves the technical problem that the application technology for keeping the chilled meat fresh in the low-temperature environment is lacked.)

一种多肽类复合生物保鲜剂及其应用

技术领域

本发明涉及食品保鲜技术领域，尤其涉及一种多肽类复合生物保鲜剂及其应用。

背景技术

为了防止食品腐烂变质，同时保持较长时间的色香味以及营养成分，食品保鲜成为了目前的研究热点。

目前国内市场食品的保鲜还是主要依靠各类防腐剂或者烘干、腌渍、加热等物理方式，但是这些方法在一定程度上会影响食品的感官风味及营养价值的降低，使用化学防腐剂则会给健康带来负面影响。多种化学保鲜剂剂都证明对人体有害,如山梨酸钾、苯甲酸钠，硝酸盐等。例如硝酸盐在使用过程中虽然抑制了微生物的生长可是同时会产生亚硝酸盐造成安全隐患。而抗菌肽具有耐酸、耐高温、溶解性好、热稳定性强等特性，对食品中多数革兰氏阴性和阳性细菌均有显著的抑制消灭作用，且在人、畜体内易被蛋白酶消化水解而无毒副作用，可被开发成为有应用价值的新型绿色食品保鲜剂。

新型食品保鲜剂的研发与应用，将是食品防腐，保鲜领域的重要研究方向，多肽类抗菌保鲜剂由于其高效，低度，无残留等特性越来越受到重视。目前，乳酸菌素(nisin)是有一种微生物抗菌肽，能够显著抑制细菌的增长繁殖，同时能够控制细菌孢子的生长进而延长食品的货架期，利用此种方法可降低灭菌的温度、大大缩短灭菌时间，减少灭菌成本，提高食品的营养价值及感官品质。但多肽类抗菌肽作为保鲜剂单独使用，也有其制约性，主要表现在自身稳定性差，价格昂贵，不易获得，单独使用保鲜机理单一，因此采用以多肽类抗菌剂和多种生物保鲜剂复合，配置成复合生物保鲜剂，可以起到协同保鲜效果，在食品保鲜中，效果更明显，副作用更低，是目前开发新型保鲜剂的一个重要方向。

在食品保鲜领域上，温度也是影响食品保鲜的一个重要因素。在大多数情况下，低温能够有效的抑制大部分微生物的生长繁殖，但仍存在一些低温腐败菌能够在低温环境下有效的生存，如单增李斯特菌，该菌在4℃的环境中仍可生存和繁殖，普通冰箱不能阻止它生长繁殖，冷鲜肉若被单增李斯特菌污染可引起食物中毒，造成食品安全事件，是冷藏食品威胁人类健康的主要致病菌之一。而中国是肉类生产大国也是消费大国，目前中国主要的消费生肉是以热鲜肉、冷鲜肉和冷冻肉三种形式供应市场。其中，冷鲜肉也因其具有营养价值高、颜色鲜红、汁液流失率低等独特优势，在肉类消费市场上越来越受到消费者的青睐。

因此亟需一种能够有效针对低温环境下鲜肉保鲜的保鲜剂。来保证冷鲜肉的有效保鲜。为此，本发明将目标移至一些具有广谱抗菌且能用于食品保鲜的物质中，如鲎素抗菌肽。

鲎素抗菌肽由17个氨基酸构成，具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌、抑制肿瘤细胞增殖分化等的生物活性，具有巨大的潜在研究和应用价值。除了直接应用于食品中，抗菌肽还可作为添加剂应用于保鲜的包装材料中，应用于保鲜膜中间接起到抑菌的作用并且这种方法更安全方便。因此，近年来多肽型保鲜剂的研究和开发利用成了食品工业的一个热点，在食品防腐保鲜领域的应用具有广阔的发展前景。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种多肽类复合生物保鲜剂及其应用，采用本发明提供的技术方案解决了现有缺少对低温环境下的冷鲜肉进行保鲜的应用技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种多肽类复合生物保鲜剂及其应用，包括合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和抗菌组分；所述抗菌组分为壳聚糖和Nisin中的一种或两种。

优选的，包括合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和壳聚糖；所述合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和壳聚糖的质量比为1：333～1000。

优选的，包括合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和Nisin；所述合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和Nisin的质量比为1:3～10。

优选的，包括合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、壳聚糖和Nisin；所述合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、壳聚糖和Nisin的质量比为1：333～1000：3～10。

一种多肽类复合生物保鲜剂的应用，包括上述任一项所述的一种多肽类复合生物保鲜剂在冷鲜肉中的应用。

优选的，在所述冷鲜肉表面形成含有所述多肽类复合生物保鲜剂的保护层。

优选的，所述冷鲜肉冷藏温度为0～4℃。

优选的，将所述多肽类复合生物保鲜剂涂抹于经预处理的保鲜膜上，再将保鲜膜覆盖于所述冷鲜肉表面。

优选的，将所述多肽类复合生物保鲜剂直接涂抹于所述冷鲜肉外表面。

优选的，将所述多肽类复合生物保鲜剂，将所述冷鲜肉浸泡于含有所述多肽类复合生物保鲜剂的溶液中1～3min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种多肽类复合生物保鲜剂，包括合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和抗菌组分；所述抗菌组分为壳聚糖和Nisin中的一种或两种。其中鲎素抗菌肽具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌、抑制肿瘤细胞增殖分化等的生物活性，能够有效的抑制多种微生物的生长繁殖，延长食品的保鲜时间。

(2)本发明提供了一种多肽类复合生物保鲜剂，其中乳酸菌素(nisin)是有一种微生物抗菌肽，能够显著抑制细菌的增长繁殖，同时能够控制细菌孢子的生长进而延长食品的货架期，利用此种方法可降低灭菌的温度、大大缩短灭菌时间，减少灭菌成本，提高食品的营养价值及感官品质。

(3)本发明提供了一种多肽类复合生物保鲜剂，其中壳聚糖来源于虾、蟹壳中的甲壳素，是在浓碱性溶液中经脱乙酰化得到的多糖类物质。壳聚糖分子主链中连接较多的可以螯合引发油脂氧化的金属离子的－NH2和－OH基团，从而使油脂氧化的反应链被破坏，抑制脂肪氧化；壳聚糖的多阳离子性质，使其与许多微生物便面负电荷相互作用，导致细胞表面发生巨大改变，进而使细胞内物质泄漏，引起细胞死亡。因此其具有的可降解、无毒性、抑制氧化及广谱抑菌的特点十分适合用于食品保鲜领域。

(4)多肽类抗菌肽若作为保鲜剂单独使用，会出现自身稳定性差，价格昂贵，不易获得，单独使用保鲜机理单一的问题。本发明提供一种多肽类复合生物保鲜剂，将合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、壳聚糖和nisin按合适的比例进行复合，配置成复合生物保鲜剂，可以起到协同保鲜效果，在食品保鲜中，效果更明显，副作用更低。

(5)本发明提供一种多肽类复合生物保鲜剂的应用，具体为在冷鲜肉中的应用。现有技术大多都是对常温下的鲜肉进行保鲜，由于在正常情况下大多人会认为冰箱冷藏能够有效抑制微生物生长，因此对鲜肉无需处理。但仍存在一些低温腐败菌在低温下依然能够生长繁殖，影响食物品质与安全。而本发明充分利用复合生物保鲜剂的安全性、抗氧化性、以及广谱抑菌性，经组合配方筛选出合适的调配比例有效抑制和杀死导致冷鲜肉制品腐败的微生物，从而降低冷鲜肉制品生产贮运商业流通中的贮藏成本，延长肉制品的货架期

附图说明

图1是不同保鲜溶液对冷鲜猪肉冷藏过程中pH变化的影响的折线图；

图2是不同保鲜溶液对冷鲜猪肉冷藏过程中菌落总数变化的影响的折线图；

图3是不同保鲜溶液对冷鲜猪肉冷藏过程中汁液流失率变化的影响的折线图。

图4是本发明的实验技术路线图。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，所使用的试剂或材料均为通过商业途径得到。

针对目前缺少低温环境下的冷鲜肉的保鲜应用技术，本发明实施例提供一种多肽类复合生物保鲜剂，主要材料包括：

合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ(合成序列：NH2-K-W-C-F-R-V-C-Y-R-G-I-C-Y-R-R-C-R-CONH2)；乳酸菌素(nisin)，壳聚糖。

其中合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ为必要成分，乳酸菌素(nisin)和壳聚糖则为备选成分，可择一选取完成搭配，也可以全部选取完成搭配。选取壳聚糖与合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ搭配时，合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和壳聚糖的质量比为1：333～1000；选取乳酸菌素(nisin)与合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ搭配时，合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和Nisin的质量比为1:3～10；若同时选取乳酸菌素(nisin)和壳聚糖与与合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ搭配，合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、壳聚糖和Nisin的质量比则为1：333～1000：3～10。

针对上述多肽类复合生物保鲜剂，本实施例以新鲜龙脊肉作为检测样品，单增李斯特菌作为实验菌株对本实施例提供的多肽类复合生物保鲜剂的保鲜效果做详细说明。

实验操作步骤如下所述：

新鲜龙脊肉→无菌条件下切成10g/份→至于不同保鲜溶液中浸泡2min→4℃左右的冰箱冷藏→检测样品。在检测过程中，以单位天数设置时间梯度为1、4、5、7、9、11(天)，测定一次各处理样品的感官品质指标、pH值、菌落总数、汁液损失率等保鲜指数的变化，筛选保鲜效果最佳组合。

其中，保鲜指数中的感官品质指标测定

根据GB/T 22210—2008的标准，请5名无生理缺陷专业人士组成的感官评价小组根据肉的颜色、光泽、气味、弹性、粘度、含水量等进行感官评定。采用十分制进行打分。分别从肉的颜色、粘度、弹性、气味四个方面进行综合评价。评价标准如表1。

表1猪肉感官评价标准

其中，保鲜指数中的pH值测定

按照GB/T 9695.5—2008《肉与肉制品pH测定》进行测定。从冰箱冷藏室内取各肉样等量，剪碎，加入一定量的无菌水，用pH酸度计测定其pH值。肉的新鲜程度用pH值进行评价:变质肉≥6.7；6.3≤二级鲜肉≤6.6；5.8≤一级鲜肉≤6.2，冷鲜肉的pH值会随着腐败程度的加深而上升。

其中，保鲜指数中的菌落总数的测定：

从冰箱冷藏室内分别取样品5g，在超净工作台内，剪碎，置于盛有45mL无菌水的锥形瓶中，摇匀，制成1∶10的样品匀液；然后参照GB4789.2－2016《食品安全国家标准－菌落总数测定》进行测定。根据菌落总数将肉的新鲜度分为三级:小于1×104cfu/g为新鲜肉，在1×104cfu/g～1×106cfu/g之间为次鲜肉，大于1×106cfu/g为变质肉。

其中，保鲜指数中的汁液流失率的测定：

称取整理好的肉样的重量(W₀)，于0-4摄氏度冰箱内保鲜冷藏，每三天取出肉样，用洁净滤纸轻轻拭去肉样表层汁液后称量(Wt)

肉样汁液流失率(DL)：

针对以上多种保鲜指数的测定，本实施例采用不同保鲜溶液对新鲜龙脊肉完成保鲜测试，该不同保鲜溶液包括实验分组和本方案多肽类复合生物保鲜剂，以下对实验分组做详细说明：

实验分组主要分为空白对照组、单一保鲜实验组、以及在多因素下不同成分比例的多因素对照组。具体如下：

A组：PBS缓冲溶液，为空白对照组；

B组：0.2g/L Nisin溶液，为单一保鲜实验组；

C组：2％壳聚糖溶液，为单一保鲜实验组。

表2不同保鲜溶液对冷鲜肉冷藏过程中感官评价变化的影响

表3不同保鲜溶液对冷鲜猪肉pH的影响

表4不同保鲜溶液对冷鲜猪肉菌落总数的影响

注：以上数据为菌落总数对数值/(cfu/g)

表5不同保鲜溶液对冷鲜猪肉汁液流失率的影响

以下将从具体的实施例中对在多因素下不同成分比例的多因素对照组进行说明：

实施例1

在本实施例中，将从鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和壳聚糖之间不同比例对以上各个检测指标进行检测。并将鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和壳聚糖之间组成的组合分组命名为D组，并根据不同比例分别设置有D1组、D2组、D3组，具体如下：

D1组：2％的壳聚糖溶液+20μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ

D2组：2％的壳聚糖溶液+40μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ

D3组：2％的壳聚糖溶液+60μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ

检测结果如下：

表1-1不同保鲜溶液对冷鲜肉冷藏过程中感官评价变化的影响

表1-2不同保鲜溶液对冷鲜猪肉pH的影响

表1-3不同保鲜溶液对冷鲜猪肉菌落总数的影响

注：以上数据为菌落总数对数值/(cfu/g)

表1-4不同保鲜溶液对冷鲜猪肉汁液流失率的影响

将本实施例中的D组与A组、B组、C组对比得，多因素对照组对比空白对照组和单一保鲜实验组从感官指标、PH值、抑菌效果、汁液流失率等方面表现的更好，且保鲜效果持续时间更长，将多因素对照组D组与空白对照组A组对比结果更明显，A组在到达11天时，感官评价已十分低，但D组在17天时仍能保持较好的保鲜效果，无论是从感官体验还是抑菌效果方面均有较好的表现。

本实施例还对不同比例下的壳聚糖与合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ进行了更进一步的实验，由表1-1到1-4中可以看出，D2组较D1和D3组的保鲜效果更优，从表1-3中可以看出，提高合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ的含量在抑菌效果上较优，但在感官体验和汁液流失率等方面较D2组不如，而D1组中的合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ含量最低，而在以上各项检测指标上也效果较为不佳，但相较于空白对照组和单一保鲜实验组保鲜效果较佳。

实施例2

在本实施例中，将从鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和Nisin之间不同比例对以上各个检测指标进行检测。并将鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和Nisin溶液之间组成的组合分组命名为E组，并根据不同比例分别设置有E1组、E2组、E3组，具体如下：

E1组：0.2g/L Nisin溶液+20μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ

E2组：0.2g/L Nisin溶液+40μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ

E3组：0.2g/L Nisin溶液+60μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ

检测结果如下：

表2-1不同保鲜溶液对冷鲜肉冷藏过程中感官评价变化的影响

表2-2不同保鲜溶液对冷鲜猪肉pH的影响

表2-3不同保鲜溶液对冷鲜猪肉菌落总数的影响

注：以上数据为菌落总数对数值/(cfu/g)

表2-4不同保鲜溶液对冷鲜猪肉汁液流失率的影响

将本实施例中的E组与实施例1中的D组相比，从感官指标、PH值、抑菌效果、汁液流失率等方面表现的较不足，但与A组、B组、C组相比，保鲜效果持续时间较长，各项指标的检测较佳。且本实施例1中表现较好的E2组与空白对照组A组相比，保鲜效果还是明显的。

本实施例还对不同比例下的Nisin与合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ进行了更进一步的实验，由表2-1到2-4中可以看出，E2组较E1和E3组的整体保鲜效果更优，其中E2组虽在前期存在一些检测指标不如E1与E2组，但其保鲜效果持续时间较E1与E2组更长，并且在第11天或第13天时的检测结果较优。

实施例3

在本实施例中，将从鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、Nisin和壳聚糖之间不同比例对以上各个检测指标进行检测。并将鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、Nisin和壳聚糖溶液之间组成的组合分组命名为F组，并根据不同比例分别设置有F1组、F2组、F3组，具体如下：

E1组：0.2g/L Nisin溶液+20μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ+2％的壳聚糖溶液

E2组：0.2g/L Nisin溶液+40μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ+2％的壳聚糖溶液

E3组：0.2g/L Nisin溶液+60μg/ml合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ+2％的壳聚糖溶液

检测结果如下：

表3-1不同保鲜溶液对冷鲜肉冷藏过程中感官评价变化的影响

表3-2不同保鲜溶液对冷鲜猪肉pH的影响

表3-3不同保鲜溶液对冷鲜猪肉菌落总数的影响

注：以上数据为菌落总数对数值/(cfu/g)表3-4不同保鲜溶液对冷鲜猪肉汁液流失率的影响

将本实施例中的F组与实施例1中的D组和实施例2中的E组相比，从感官指标、PH值、抑菌效果、汁液流失率等方面表现极佳，是以上多组实验组中效果最佳的一个分组。尤其是与空白对照组A组的对比尤其明显。

本实施例还对不同比例下的合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、Nisin和壳聚糖溶液进行了更进一步的实验，由表3-1到3-4中可以看出，F2组较F1和F3组的整体保鲜效果更优。

实施例4

本实施例从实施例1-3中挑选出效果较佳的D2、E2、F2组与空白对照组和单一保鲜实验组进行逐一比对，并通过图1-3进行说明。

由图1可以看出，冷藏5d后，A组已经降到二级范围内，A组的pH为6.3，；而其余五组还在一级范围内。冷藏8d后，A组已经发生了变质，pH分别为6.8；而B、C、E2三组降到了二级范围内，D2和F2依然保持在一级范围内；在冷藏11d后，A、B、C三组均已变质；而D2组降到了二级范围内，pH为6.3；E2组保持在二级范围内，仅有F2组依然能够继续保持在一级范围内，pH为5.9。且在第15天时，D2组合F2组的保鲜效果依然较佳，其中D2组在二级范围内，F2组邻近二级范围的边缘。由此可以看出F2组的保鲜效果最显著，其次是D2组，即合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、壳聚糖以及Nisin复合对冷鲜肉的保鲜效果极好，其次为D2组，而E2组是经过鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和nisin复合对冷鲜肉保鲜效果较D2组和F2组不太理想。

由图2可以看出，在冷藏5d后，A、B、C、E2四组均在二级范围内，而D2组和F2组仍在一级范围内；。冷藏8d后，A组发生变质，而其余五组还在二级范围内。在冷藏13天后，A、B、C三组均发生变质，而E2组的菌落数也接近1×10⁶cfu/g。从总体上看B、C、E2组还是具有一定的保鲜效果的，D2和F2组表现较佳，在冷藏13天后，依然能控制在二级范围内，且F2组的菌落数也接近1×10⁵cfu/g左右，抑菌效果好。

由图3可以看出，在冷藏8d后，A组的汁液流失率接近7％，而其余五组的汁液流失率在4.0％—5.0％。到第13天A组为11％，C组为8.2％。到了第15天，A组的汁液流失率已经达到13.7％；仅有D2组和F2组保持在8％以下，D2组的汁液流失率为7.52％，F2组的汁液流失率为6.91％，。由此可以看出F2组是合成鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、壳聚糖和Nisin复合对冷鲜肉的保水效果极好的，而E2组是经过鲎素抗菌肽Tac Ⅰ和nisin复合对冷鲜肉的保水效果较为不佳，但较空白组依然有显著效果。

新鲜龙脊肉在不同保鲜液中浸泡处理2min后，沥干冷藏，单一保鲜组B组和C组，能延长保鲜三天，而F2组是采用鲎素抗菌肽Tac Ⅰ、Nisin和壳聚糖复合而成的多肽类复合生物保鲜剂效果明显，对冷鲜肉的保藏能够延长至17天，比单一保鲜组延长了14天，但在复合保鲜组中的E2组采用Nisin和鲎素抗菌肽Tac Ⅰ的复合效果较D2组和F2组效果较为不佳，可能是由于两者之间发生了反应，导致保鲜效果受影响，但相较于空白对照组A组效果还是明显的。

实施例5

需要说明的是，本发明提供的一种多肽类复合生物保鲜剂应用于冷鲜肉中。

具体的保鲜原理为，在冷鲜肉表面形成含有本发明各实施例中提到的多肽类复合生物保鲜剂的保护层。

进一步的，应用于冷鲜肉的具体冷藏温度范围为0～4℃。

具体应用操作方法有以下几种：

(1)取一待保鲜的冷鲜肉，并将该冷鲜肉浸泡于含有本发明中的多肽类复合生物保鲜剂的溶液中1～3min，后将浸泡完毕的冷鲜肉取出，沥干后放入0～4℃的环境中保藏；

(2)取一待保鲜的冷鲜肉，直接将本发明中的多肽类复合生物保鲜剂涂抹于待保鲜的冷鲜肉外表面上，再将其放入0～4℃的环境中保藏；

(3)将本发明中的多肽类复合生物保鲜剂涂抹于经预处理的保鲜膜上或直接涂抹于保鲜膜上，又或与其他制膜组分混合制成保鲜膜，并将该保鲜膜覆盖于待保鲜的冷鲜肉外表面，再将其放入0～4℃的环境中保藏；其中的经预处理的保鲜膜主要指通过辐射、加热等方法将保鲜膜外表面进行改性，使其更易于保鲜剂有效成分结合，粘附力更强，使保鲜剂更好的覆盖于待保鲜的冷鲜肉中。

以上仅是本发明中的肽类复合生物保鲜剂的其中几种应用方法，本发明的应用方法目的主要在待保鲜的冷鲜肉外表面覆盖有本发明中保鲜剂，因此，凡能满足以上目的的实施方式、应用方式均可为本发明对冷鲜肉的应用。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。