阅读说明：本技术 一种治疗肝纤维化、硬皮病的化合物及其应用 (Compound for treating hepatic fibrosis and scleroderma and application thereof ) 是由 卢伟强 章涵堃 陈思 姜兴武 蒋蓓尔 刘明耀 于 2019-09-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药领域,具体公开了一种治疗纤维化相关疾病的化合物LQ-2-191。本发明提供了以大麻素受体CB2为作用靶点在抗纤维化药物开发中的应用。所述的LQ-2-191可在体内外特异性地激活CB2,通过作用于CB2抑制纤维化部位的炎症反应并有效缓解纤维化的症状。本发明通过动物实验证实,LQ-2-191能够有效减轻胆管结扎诱导的大鼠肝纤维化和博来霉素诱导的小鼠硬皮病模型纤维化程度。所述抗纤维化药物以大麻素受体CB2为作用靶点,可以明显抑制肝纤维化、硬皮病的发生和发展,可用于制备抗肝纤维化、防治肝硬化和硬皮病的药物。(The invention belongs to the field of medicines, and particularly discloses a compound LQ-2-191 for treating fibrosis related diseases. The invention provides application of a target point with cannabinoid receptor CB2 as an action in developing anti-fibrosis drugs. The LQ-2-191 can specifically activate CB2 in vivo and in vitro, inhibit inflammatory reaction at a fibrosis part by acting on CB2 and effectively relieve the symptoms of fibrosis. Animal experiments prove that the LQ-2-191 can effectively relieve rat hepatic fibrosis induced by bile duct ligation and mouse scleroderma model fibrosis induced by bleomycin. The anti-fibrosis drug takes cannabinoid receptor CB2 as an action target, can obviously inhibit the occurrence and the development of hepatic fibrosis and scleroderma, and can be used for preparing drugs for resisting hepatic fibrosis and preventing and treating liver cirrhosis and scleroderma.)

一种治疗肝纤维化、硬皮病的化合物及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种治疗肝纤维化、硬皮病的化合物及其应 用。

背景技术

纤维化，是由于组织修复过度引起的一种病理情况，一般发生在组织损伤后 伤口愈合的过程中。与组织纤维化相关的病症实例有很多，一般包括皮肤瘢痕的 形成、肝纤维化、肾纤维化、肺间质纤维化、肾小球性肾炎、心力衰竭(缺血性 的和非缺血性的)、硬皮病等。

硬皮病，即系统性硬化症，是一种自身免疫性疾病，最主要的外部特征就是 胶原堆积造成的皮肤增厚和小动脉损伤。目前临床常见的有两种形式的硬化症： 局部性硬化症和全身性硬化症。局部性硬化症主要影响面部、手和脚的皮肤。而 全身性硬化症除了涉及皮肤外，还会发展到内脏器官，包括肾脏、心脏、肺和胃 肠道等。现有数据表明局部性系统性硬化症患者的10年生存率为75％；10至 20年内有将近10％发展为肺动脉高压。全身性系统性硬化症患者的10年生存率 仅为55％，最常见的死亡原因是肺、心脏和肾脏的衰竭。除此之外，这些患者 罹患癌症的风险也略有增加。

肝纤维化是肝硬化等多种急慢性肝病进展的关键过程之一，也是肝癌的最主 要的风险因素。肝癌是世界范围内死亡率最高的癌症，其发病进程一般是酒精、 病毒以及其他致病因素引起急、慢性肝损伤，而肝脏在持续损伤及强烈的炎症反 应条件下，导致组织修复过度，使胶原纤维合成和降解的平衡被打破，引起大量 的细胞外基质蛋白在肝脏内过度累积，从而引起肝纤维化、肝硬化并最终可能发 展为肝癌，这种发病模式是我国肝癌主要发病模式。肝纤维化是肝炎和非酒精性 脂肪肝等多种慢性肝病向肝硬化发展的必经之路，因此早期预防肝纤维化可以减 缓多种肝病的进展。大量的动物实验和临床试验已证明，肝纤维化是一个可逆的 过程。改善肝纤维化不仅可以阻止肝细胞炎症性坏死，减少肝脏代谢失常，也可 以减缓肝硬化和肝癌的进展，从而有效地增加病人的存活时间并改善病人的生活 质量。

***素受体及其下游通路与多种炎症引起的纤维化密切相关。在肝脏中，成 纤维细胞中的CB1受体被激活后可以使肝星型细胞活化，加快肌成纤维细胞的 ***速度，从而促进肝纤维化。而表达于枯否氏细胞的CB2受体活化后不但可 以分泌促进肝星形细胞凋亡的抗炎因子，而且还可以诱导肌成纤维细胞凋亡，从 而起到抑制肝纤维化的作用。因此，抑制CB1受体或者激活CB2受体均可以有 效治疗肝纤维化。同样，对于由炎症引起的皮肤纤维化，通过激活CB2受体能 够有效地抑制炎症，从而有效抑制皮肤纤维化的发生和发展。但是，大量的临床 证据表明抑制CB1受体的拮抗剂会带来诸如抑郁、***倾向等严重的副作用。 因此，开发CB2选择性激动剂是极具前景的肝纤维化治疗新策略。

目前已经有多个***素受体激动剂进入抗纤维化临床研究。Anabasum是已 进入临床的一个人工合成的天然***素类似物，用于治疗纤维化疾病，并且取得 了较为显著的效果。但是Anabasum对不同***素受体亚型选择性一般，限制了 其在临床中的使用。因此，亟需开发新型高活性、高选择性CB2受体激动剂应 用于纤维化疾病的治疗。其中，CB2受体活化能够抑制甚至逆转纤维化的发生。

发明内容

通过大规模药物筛选，本发明发现了LQ-2-191可高效地激活CB2下游的G 蛋白通路，从而有效地改善肝纤维化和硬皮病。本发明所述的LQ-2-191通过激 活CB2抑制纤维化部位的炎症反应并有效缓解纤维化的症状。

本发明要解决的技术问题是提供用于治疗肝纤维化、硬皮病的化合物。

本发明提供了化合物LQ-2-191在制备治疗纤维化疾病相关药物中的应用。

其中，所述纤维化相关疾病药物以***素受体CB2为作用靶点。

本发明所述的药物为抗纤维化药物，命名为LQ-2-191，所述LQ-2-191的分 子式为：C₁₈H₂₃F₃N₄O₂，结构如式(1)所示：

本发明中，所述LQ-2-191通过抑制炎性介质生成或浸润，从而减轻肝脏、 皮肤炎症。

其中，所述所述炎性介质为TNF-α，TGF-β。

本发明中，所述LQ-2-191通过减少胶原沉积，改善纤维化症状。

本发明中，所述LQ-2-191的用药剂量为每千克个体体重施用1-20mg。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的如式(1) 所示的化合物和药学上可接受的载体：

本发明中，所述药物组合物剂型为口服液剂。

本发明还提供了所述药物组合物在制备抗肝纤维化、硬皮病药物中的应用。

本发明中，将所述LQ-2-191注入动物个体(如灌胃)中，所述LQ-2-191 的终浓度为1-20mg/kg。优选地，所述LQ-2-191的终浓度为20mg/kg。

利用本发明所述的抗纤维化药物，在治疗上进行施用(给药)时，可提供不 同的效果。通常，可将抗纤维化药物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水 性载体介质中形成药物组合物。其中，所述水性载体介质为生理盐水、磷酸盐缓 冲液、葡萄糖溶液、蒸馏水、甘油、乙醇及其组合。

其中，所述药物组合物的pH值通常约为5-8；优选地，pH值约为6-8，pH 值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。

本发明的LQ-2-191可以被制成口服制剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄 糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1-20mg/kg。具体剂量还应考虑给 药途径、病人健康状况等因素。此外，本发明的LQ-2-191还可与其他治疗剂一 起使用。

本发明对诱导的纤维化动物模型进行了体重监测，并检测了Ⅰ型胶原(colla I)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，以及组织中羟脯胺酸的含量，实验结果显示， 所述LQ-2-191能减轻纤维化部位炎性细胞的浸润以及胶原蛋白的沉积，从而改 善纤维化症状。

本发明还提出了LQ-2-191或药物组合物在制备抑制和/或治疗肝纤维化、硬 皮病过程中生成的炎性介质的药物中的应用。

其中，所述炎性介质为TNF-α，TGF-β。

其中，所述药物用于治疗肝病，所述肝病是指与肝纤维化有关的疾病；所述 肝病为慢性肝炎、非酒精性脂肪肝、肝硬化或肝癌及由于肝损伤引起的疾病。

其中，所述药物用于减少皮肤的硬度和厚度。

其中，所述药物用于治疗硬皮病；所述硬皮病是一种自身免疫性疾病，其主 要的特征是胶原堆积造成的皮肤增厚和小动脉损伤以及心、肝、肺器官的纤维化 变性。

本发明还提出了LQ-2-191或药物组合物在制备减少和/或治疗肝纤维化、硬 皮病过程中沉积的胶原蛋白的药物中的应用。

其中，所述LQ-2-191或药物组合物用于降低血清中ALT、AST以及总胆红 素的表达量。

本发明的有益效果包括：本发明提供了LQ-2-191或药物组合物在制备抗肝 纤维化、硬皮病药物中的应用。LQ-2-191或药物组合物能够明显抑制肝纤维化 和硬皮病的发展。本发明将LQ-2-191作为新的抗纤维化药物或者其辅助成分进 行开发，抗纤维化效果明显，性质稳定，将为肝纤维化和硬皮病治疗提供了一种 新的途径和手段。

附图说明

图1为实施例1LQ-2-191在CB2受体上的钙流测试结果；其中，图1a为阳 性药CP55940的钙流活性，图1b为LQ-2-191的钙流活性。

图2为实施例1LQ-2-191对CB2受体的活化作用受CB2受体拮抗剂AM630 的抑制。

图3为实施例1LQ-2-191能够引起CB2受体脱敏；其中，图3a为DMSO、 CP55940以及LQ-2-191先后两次刺激CB2时引起的钙流活性，图3b为3a的统 计分析图。

图4为实施例1LQ-2-191在CB2受体上的HTRF测试结果；其中，图4a 为阳性药CP55940的HTRF测试数据，图4b为LQ-2-191的HTRF测试结果。

图5为实施例2H&E染色的对照组与给予LQ-2-191动物肝脏组织病理图。

图6为实施例2的天狼星红染色的对照组与给予LQ-2-191动物肝脏组织病 理图。

图7为实施例2大鼠血清中肝功能指标，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转 氨酶(AST)以及总胆红素(T-BIL)。

图8为实施例2LQ-2-191减少大鼠肝纤维化相关标志物的量，包括TGF-β、 Col1a1、α-SMA和TNF-α。

图9为实施例2LQ-2-191降低大鼠血清中肝纤维化指标，包括III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(CIV)、层粘连蛋白(Laminin)以及透明质酸(HA)。

图10为实施例3H&E染色的对照组与给予LQ-2-191动物皮肤组织病理图。

图11为实施例3天狼星红染色的对照组与给予LQ-2-191动物皮肤组织病理 图。

图12为实施例3免疫组织化学荧光染色的对照组与给予LQ-2-191动物皮肤 组织病理图。

图13为实施例3LQ-2-191减少小鼠皮肤纤维化相关标志物的量，包括 TGF-β、Col1a1、α-SMA和TNF-α。

具体实施方式

结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不 局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想 到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实 施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为 本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1 LQ-2-191是***素受体CB2的选择性激动剂

使用测试钙流的方法对所有化合物进行单浓度测试，浓度选择为10μM。本 发明分批测试了252个化合物，对在10μM能激活CB2受体效率达到阳性药 CP55940的30％以上的化合物进行8浓度梯度的复筛，发现LQ-2-191在CB2受 体上具有较好的活性(EC₅₀＝15.73nM，如图1所示)，优于阳性药CP55940 (EC₅₀＝21.69nM)，且在CB1受体上的EC₅₀大于10μM，说明LQ-2-191是*** 素受体CB2的选择性激动剂。

为了确认化合物是通过CB2受体引起的胞内钙流，本发明紧接着使用CB2 受体特异性拮抗剂AM630进行验证，结果如图2所示。细胞先加入AM630处 理后，再加入阳性药CP55940以及LQ-2-191均不能引起细胞内钙流信号，而未 用AM630处理，只加入CP55940和LQ-2-191的细胞则可以检测到信号，说明 LQ-2-191通过激活CB2受体引起胞内钙流，即LQ-2-191是CB2受体的激动剂。

受体脱敏是很多膜受体共有的特征。GPCR在被配体激活后，为了避免受体 被持续激活，机体一般会有自身的负调节机制，受体脱敏便是最常见的调节方式 之一。受体被激活完成信号转导后，便会发生内吞而脱敏，一旦受体发生内吞， 便无法再接受胞外信号的刺激，从而避免信号通路被持续激活。本发明在脱敏的 实验中发现，LQ-2-191能引起CB2受体的脱敏，当第一次使用LQ-2-191激活 CB2受体后，孵育十分钟，再次使用CB2受体的阳性药CP55940刺激细胞，不 能引起胞内钙流信号响应，由此可见，在LQ-2-191激活后，引起了受体的脱敏， 致使再次用阳性药刺激也无法激活CB2受体(结果见图3)，再次证明LQ-2-191是CB2受体的激动剂。

由于CB2受体自然条件下通过偶联Gαi传递下游信号，因此本发明也检测 了LQ-2-191在激活CB2受体时胞内cAMP的变化。Gαi被活化后会抑制腺苷酸 环化酶的活性，从而降低胞内cAMP的含量，因此本发明先使用2.5μM的 forskolin进行刺激，以便于测试。本发明使用HTRF(均相时间分辨荧光技术) 的方法对化合物进行验证，结果如图4所示，本发明发现HTRF的结果基本与钙 流结果一致。一来说明了筛选化合物所用的测试方法是稳定可靠的，二来说明 LQ-2-191确实是通过CB2受体发挥作用的，是CB2受体的有效激动剂。

实施例2 LQ-2-191通过CB2受体减轻胆管结扎诱导的大鼠肝纤维化症状

选取4-6周龄、约200g的CB2敲除大鼠，手术前饥饿6小时。使用阿弗 丁麻醉大鼠，每只大鼠腹腔注射阿弗丁2mL。待大鼠麻醉后在腹部开口找到胆 管，造模组使用5号线结扎胆管，为避免结扎线脱落，结扎两次；对照组只打 开腹腔，分离胆管，并不结扎。结扎完成后将大鼠内脏恢复原样，然后加入含双 抗的生理盐水润洗内脏器官。最后缝合伤口。并将大鼠放置37℃恒温台待其麻 醉恢复。术后三天内每天更换垫料，并用碘酒消毒伤口，避免伤口感染。手术后 第三天开始给予LQ-2-191(口服，20mg/kg)处理，每天给药持续两周，两周以 后处死大鼠取材。检测大鼠血液指标，以及肝纤维化指标，评价药物效果。

结果显示：胆管结扎手术后，无论是CB2基因敲除的大鼠，还是野生型大 鼠，肝脏都出现了明显的肿大，肝脏重量显著增加，但是野生型大鼠在LQ-2-191 治疗后，LQ-2-191治疗组与胆管结扎模型诱导组相比，肝脏重量显著降低。同 时肝重指数也显著降低，说明LQ-2-191对抑制肝损伤有一定的效果，而在CB2 受体缺失的大鼠上，治疗前后肝重指数几乎没有任何变化。同时本发明发现无论 是野生型大鼠还是CB2受体缺失型大鼠，在进行胆管结扎手术后，其血清中的 ALT、AST以及T-BIL均显著增加(如图7所示)。但是野生型大鼠经LQ-2-191 治疗后，ALT和AST的含量均显著下降，预示着LQ-2-191减轻了大鼠胆管结扎诱导的肝损伤，除此之外，血清中T-BIL也显著下降，但对CB2受体缺失的大 鼠没有保护作用，说明CB2受体在LQ-2-191治疗过程中发挥重要作用，即 LQ-2-191是通过激活CB2受体发挥保护肝脏的作用。

除了测试血清中基础肝功能损伤外，本发明也测量了评价肝纤维化的四项基 本指标，包括III型前胶原(PCIII)、IV型胶原(CIV)、层粘连蛋白(Laminin) 以及透明质酸(HA)。PCIII型前胶原是纤维化过程中的一个中间产物，其血清 中的含量与肝脏纤维化程度呈正相关，因此通过检测血清中PCIII的量可以判断 肝脏纤维化的程度。而CIV、Laminin和HA都是组成基底膜的成分，其血清中 的含量也都可以反应出肝脏纤维化程度。由结果可知(如图9所示)，野生型大 鼠和CB2受体缺失的大鼠在结扎胆管后血清中四项肝纤维化指标均有明显升高， 但是只有野生型大鼠在LQ-2-191治疗后有所缓解，CB2受体缺失的大鼠血清中 的四项纤维化指标在化合物的治疗后并没有减轻。

肝纤维化是肝脏受到损伤后，由于肝脏自我修复过度引起的。在纤维化进展 过程中，炎症性淋巴细胞起到重要作用，正是由于肝脏内炎症过强，才会引起肝 脏过度的修复。因此，淋巴细胞的浸润与肝脏炎症的强弱以及纤维化程度也是呈 正相关的。从该批大鼠肝脏切片的H&E染色结果可知(如图5所示)，LQ-2-191 治疗后，野生型大鼠炎性细胞的浸润显著降低，而CB2受体缺失的大鼠炎性细 胞浸润量却没有减少。除此之外，从肝脏细胞的形态上看(如图5所示)，胆管 结扎后肝细胞水肿性死亡数明显增多，而药物治疗后野生型大鼠有所缓解，但是CB2受体缺失的大鼠化合物治疗组与对照组并无显著性差异。

胶原沉积是肝纤维化过程中最主要的一个表型，接下来本发明使用天狼星红 染色观察大鼠肝脏中胶原沉积的情况，结果表明(如图6所示)胆管结扎后野生 型大鼠和CB2受体缺失的大鼠胶原沉积量明显增多，但是经过LQ-2-191的治疗 后，野生型大鼠肝脏内胶原的沉积量显著降低，而CB2受体缺失的大鼠治疗组 与对照组相比胶原沉积量没有显著变化，同时本发明也发现，CB2敲除后肝纤维 化程度显著上升，说明CB2敲除后大鼠自身抵抗肝纤维化能力下降。

接着本发明在mRNA水平也检测了化合物LQ-2-191抗纤维化的作用(如图 8所示)。结果与前文一致，化合物LQ-2-191也能在mRNA水平抑制胆管结扎 诱导的野生型大鼠肝纤维化，可以减轻炎症的发生以及胶原的表达，但对CB2 受体缺失的大鼠没有任何缓解作用，进一步说明了LQ-2-191能通过激活CB2 受体抑制胆管结扎诱导的肝纤维化。

实施例3 LQ-2-191减轻博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化

具体地，LQ-2-191可以减轻博来霉素诱导的皮肤厚度增加和胶原沉积。

取6-8周龄Balb/c小鼠50只，随机分成5组，分别为对照组，造模组，造 模组+LQ-2-1911mg/kg，造模组+LQ-2-1915mg/kg，造模组+Win55212-21 mg/kg(阳性对照组)。

实验组小鼠每天皮下注射100μL 1mg/mL的博来霉素(15mg博来霉素溶于 15mLPBS缓冲液)作为造模组，对照组只皮下注射生理PBS缓冲液。

诱导两周后开始使用药物治疗，并同时每天注射博来霉素溶液，持续四周。

药物治疗四周后处死小鼠，取皮肤组织固定、包埋，切片后对组织进行形态 学染色、胶原染色以及免疫组化染色，评价小鼠皮肤纤维化程度以及药物治疗效 果。

与正常对照组(PBS+Vehicle)相比，使用博来霉素处理后的博来霉素(100μL，1mg/ml溶于PBS缓冲液)诱导纤维化组的小鼠的皮肤厚度和胶原沉积量显著增 加。但用LQ-2-191处理后的LQ-2-191组的小鼠的皮肤的厚度得到了明显的改善。

H&E染色结果表明(如图10所示)，博来霉素诱导后，小鼠的皮肤明显增 厚，真皮层、脂肪层以及皮肌层的炎症相关的细胞数目明显增多。而使用 LQ-2-191处理的小鼠，皮肤组织中的炎症相关的淋巴细胞浸润数量显著减少， 小鼠的皮肤厚度相对于博来霉素诱导组有显著下降。

同时，使用天狼星红染料分别染了不同处理组小鼠的皮肤组织切片后(如图 11所示)，本发明发现LQ-2-191可以显著减少胶原沉积，在1mg/kg和5mg/kg 的不同剂量下，均可显著减少皮肤中胶原的沉积。本发明也使用免疫组化的方法 检测另一个纤维化的主要指标α-SMA，免疫组化结果如图12所示，博来霉素诱 导后，小鼠毛囊处的α-SMA量明显增加。而使用LQ-2-191治疗小鼠后，能显著 抑制毛囊内的α-SMA的表达。这些结果说明，LQ-2-191在治疗博来霉素诱导的 皮肤纤维化上有一定作用。

为了进一步确认皮肤中其他纤维化标志物的变化，本发明取小鼠的患处皮肤， 抽提皮肤总mRNA，然后通过QPCR的方法进一步检测了与纤维化密切相关的 三个指标，包括TGF-β、Col1a1和α-SMA，以及与炎症相关的指标TNF-α。结 果表明(如图13所示)，使用LQ-2-191治疗后，小鼠皮肤中与纤维化和炎症相 关的标志物表达量显著减少，进一步证明了LQ-2-191可以治疗博来霉素诱导的 小鼠皮肤纤维化。

本发明保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下， 本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利 要求书为保护范围。