Sms2抑制剂在制备治疗高侵袭性乳腺癌药物中的应用
阅读说明：本技术 Sms2抑制剂在制备治疗高侵袭性乳腺癌药物中的应用 (Application of SMS2 inhibitor in preparation of medicine for treating highly invasive breast cancer ) 是由 董继斌 余科 邓燕 叶德泳 于 2020-05-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了SMS2抑制剂在制备治疗高侵袭性乳腺癌药物中的应用。利用4T1细胞建立小鼠三阴性乳腺癌模型的整体实验以及采用小鼠原代骨髓巨噬细胞进行的体外实验,证实所述化合物I作为SMS2特异性抑制剂,通过降低体内鞘磷脂合酶2活性和鞘磷脂水平,能够有效抑制巨噬细胞的2型极化,并通过减少三阴性乳腺癌肿瘤微环境中M2型巨噬细胞和其他骨髓源性免疫抑制细胞的浸润程度,重塑肿瘤微环境,从而抑制三阴性乳腺的原位生长以及经血行带来的肺转移灶的形成和生长。抑制SMS2活性可用于预防和治疗包括三阴性乳腺癌在内的高侵袭性恶性乳腺癌。(The invention discloses application of an SMS2 inhibitor in preparation of a medicine for treating highly invasive breast cancer. The overall experiment for establishing a mouse triple negative breast cancer model by using 4T1 cells and the in vitro experiment by using mouse primary bone marrow macrophages prove that the compound I is used as an SMS2 specific inhibitor, can effectively inhibit 2-type polarization of macrophages by reducing in-vivo sphingomyelin synthase 2 activity and sphingomyelin level, and remodels a tumor microenvironment by reducing infiltration degree of M2-type macrophages and other bone marrow-derived immunosuppressive cells in a triple negative breast cancer tumor microenvironment, so that in-situ growth of triple negative mammary glands and formation and growth of lung metastases brought by hematopoiesis are inhibited. Inhibition of SMS2 activity is useful for the prevention and treatment of highly aggressive malignant breast cancers, including triple negative breast cancer.)
技术领域
本发明涉及制药领域，尤其涉及SMS2抑制剂在制备治疗高侵袭性乳腺癌药物中的应用。
背景技术
高侵袭性乳腺癌是女性乳腺癌中致死率高的主要类型。其中，三阴性乳腺癌(Triple-Negative Breast Cancer，TNBC)是侵袭性最强的乳腺癌亚型，临床病理特征为雌激素受体(ER)阴性、孕激素受体(PR)阴性、人表皮生长因子受体(HER2)阴性，基因组学大多呈基底样乳腺癌特征(basal-like breast cancer)。TNBC恶性程度高，常见肺、脑转移，目前缺乏针对性有效治疗，患者平均生存时间维持在15个月左右，是乳腺癌致死的最主要亚型(N Engl J Med 2009；360:790-800)。以TNBC为代表的高侵袭性乳腺癌，因受体表达缺陷，新型靶向药物和免疫药物难以获得理想疗效，临床一线治疗手段仍是细胞毒性化疗，但治疗获益的患者不超过TNBC患者的20％，寻找新的有效的治疗手段成为了当务之急。
鞘磷脂(sphingomyelin,SM)是哺乳动物细胞中含量最丰富的鞘脂，其在体内的异常生物学调控可直接或间接参与疾病的发生和发展(Am J Physiol 275:L843–L851；AdvExp Med Biol.2010；688:72-85)。鞘磷脂合酶2(Sphingomyelin Synthase 2，SMS2)是SM体内从头合成路径的一个关键酶。前期研究表明SMS2在巨噬细胞表达丰富且对炎症状态发挥重要调节作用；下调SMS2活性可以缓解LPS诱发的腹腔巨噬细胞炎症状态，而过表达SMS2则诱发主动脉炎性生物标志分子的表达(Life Sci.2012Jun6；90(21-22):867-73)。
近年来，巨噬细胞在肿瘤生物学和肿瘤治疗学邻域的研究备受关注。巨噬细胞可以表现为抑炎促癌的M2型和促炎抑瘤的M1型。肿瘤微环境主要富集的是M2型巨噬细胞(又称肿瘤浸润型巨噬细胞，TAMs)，成为促进肿瘤发生发展和耐药的重要机制。基于SM是巨噬细胞膜上最主要的磷脂之一，考虑SM2的活性很可能与肿瘤微环境中M2型巨噬细胞的富集及其促癌功能存在联系。在本发明中探索研究了这一假设，发现SMS2在肿瘤微环境M2型巨噬细胞(TAMs)中的重要调控作用，SMS2抑制剂对治疗TNBC有效，且具有应用开发的价值。
选用的4-(氟苄氧基)-3-(吡啶基氨基)苯并异噁唑类化合物，在前期发现了具有SMS2抑制作用(烷氧基苯并五元(六元)杂环胺类化合物及其药物用途，中国发明专利，申请号:201810124854.9，申请日：2018年2月7日；PCT/CN2019/072468，国际申请日2019年1月21日，国际优先权日2018年2月27日)，其中包含化合物I，且化合物I具有良好的生物利用度(对ICR小鼠灌胃给药，生物利用度为56％，J.Med.Chem.2018，61：8241-54)。该类SMS2抑制剂可用于预防和治疗动脉粥样硬化和炎症性肠病(Y9在抗动脉粥样硬化的应用，中国发明专利，申请号:201610392529.1，申请日：2016年6月3日；4-(2,6-二氯苄氧基)-3-(3-氨基吡啶)苯并[d]异噁唑在制备预防和治疗炎症性肠病药物中的用途，中国发明专利，申请号：2019100859357，申请日：2019年1月29日)，但其对巨噬细胞以及肿瘤微环境的影响以及在预防和治疗人和动物三阴性乳腺癌中的作用尚未经实验证实。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种SMS2抑制剂在制备治疗高侵袭性乳腺癌药物中的应用。
进一步的，SMS2抑制剂的化学结构式如式(I)所示，
进一步的，SMS2抑制剂通过降低体内鞘磷脂合酶2的活性和鞘磷脂水平，能够有效抑制巨噬细胞的2型极化，并通过减少三阴性乳腺癌肿瘤微环境中M2型巨噬细胞和其他骨髓源性免疫抑制细胞的浸润程度，重塑肿瘤微环境，从而抑制三阴性乳腺的原位生长以及经血行带来的肺转移灶的形成和生长
本发明还提供一种抗高侵袭性乳腺癌的药物，是以SMS2抑制剂为活性成分，加上药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
进一步的，SMS2抑制剂的化学结构式如式(I)所示，
进一步的，所述药物的给药途径为口服或者静脉注射。
进一步的，所述SMS2抑制剂通过降低体内鞘磷脂合酶2的活性和鞘磷脂水平，能够有效抑制巨噬细胞的2型极化，并通过减少三阴性乳腺癌肿瘤微环境中M2型巨噬细胞和其他骨髓源性免疫抑制细胞的浸润程度，重塑肿瘤微环境，从而抑制三阴性乳腺的原位生长以及经血行带来的肺转移灶的形成和生长。
技术效果
本发明证实了SMS2抑制剂，结构如式I所示，具有抑制高侵袭性乳腺癌的作用，为高侵袭性乳腺癌的治疗提供了新的有效治疗药物。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是化合物I在小鼠来源巨噬细胞株RAW264.7和BALBC小鼠骨髓原代巨噬细胞BMDM中的半数抑制率IC50测定，数值以均数±标准误差表示，n＝9；
图2是化合物I对小鼠来源巨噬细胞株RAW264.7和BALBC小鼠骨髓原代巨噬细胞BMDM的细胞毒性作用测定，数值以均数±标准误差表示，n＝9；
图3是SMS2在侵袭性乳腺癌中高表达；
图4是TCGA数据库522个乳腺癌肿瘤样本数据分析：A.乳腺癌患者肿瘤中，SMS2高表达与CD206/CD68比值高有关；B.乳腺癌患者肿瘤中，SMS2高表达与FOXP3、CD11b及CD33高表达有关，***，P<0.001；****，P<0.0001；
图5是SMS2高表达与患者预后关系：A.SMS2在“基底样”乳腺癌中的高表达；B.在“基底样”乳腺癌中，SMS2高表达与低RFS有关，***，P<0.001；
图6是SMS2活性缺失对IL-4诱导的巨噬细胞2型极化的影响：A.流式细胞仪鉴定细胞表面F4/80的表达；B.流式细胞仪检测F4/80+CD206+细胞的百分比以及细胞表面CD206的MFI；C.Western Blot检测细胞中Arg1蛋白的表达；D.Q-PCR检测细胞CD206、Arg1、YM1、TGF-βmRNA表达；**，P<0.01，***，P<0.001；
图7是SMS2活性缺失对IL-4诱导条件下的巨噬细胞1型极化的没有影响；
图8是化合物I显著降低IL-4诱导的BMDM细胞M2型表面蛋白的表达：A.流式细胞仪检测BMDM细胞中F4/80+CD206+细胞的百分比及CD206 MFI；B.流式细胞仪检测RAW 264.7细胞CD206 MFI，**，P<0.01；***，P<0.001；
图9是化合物I显著减少IL-4诱导的BMDM和RAW264.7细胞CD206和Arg1的蛋白表达。A.Western Blot检测BMDM细胞中Arg1和CD206的蛋白表达；B.Western Blot检测RAW264.7细胞中Arg1和CD206的蛋白表达；**，P<0.01；***，P<0.001；
图10是化合物I显著减少IL-4诱导的BMDM和RAW264.7细胞M2型标志基因的表达：A.Q-PCR检测BMDM中CD206，Arg1，YM1和TGF-β的mRNA表达；B.Q-PCR检测RAW264.7细胞中CD206，Arg1，YM1和TGF-β的mRNA表达；**，P<0.01；***，P<0.001；
图11是化合物I显著减少TNBC细胞条件培养基诱导的BMDM细胞M2型表面蛋白的表达，但对M1型无影响：A.化合物I显著降低4T1细胞条件培养基诱导的BMDMs细胞表面CD206的表达而对CD86的表达无明显抑制作用；B.化合物I显著降低MDA-MB-231细胞条件培养基诱导的BMDMs细胞表面CD206的表达而对CD86的表达无明显抑制作用；**，P<0.01；
图12是化合物I显著减少TNBC细胞条件培养基诱导的BMDM细胞IL-10和TGF-β的分泌：A.4T1-CM诱导BMDM细胞分泌IL-10和TGF-β；B.MDA-MB-231-CM诱导BMDM细胞分泌IL-10和TGF-β；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001；
图13是化合物I显著抑制TNBC细胞条件培养基诱导的mTOR1信号通路的激活；***P<0.001；
图14是化合物I降低M2型巨噬细胞诱导的4T1细胞的迁移能力：A.巨噬细胞条件培养基收集示意图；B.4T1细胞迁移实验；***，P＜0.001；
图15是化合物I降低小鼠血浆中的总SM水平；***，P<0.001；
图16是化合物I有效抑制4T1细胞在体内的血行转移：A.小鼠活体成像；B.肺组织HE染色；**，P＜0.01；***，P＜0.001，n＝8；
图17是化合物I有效减少TNBC肺转移灶中M2型巨噬细胞浸润数量，但对正常生理状态下的巨噬细胞极化状态没有影响：A.化合物I对正常生理状态小鼠腹腔巨噬细胞极化无明显抑制作用；B.化合物I有效减少肺转移灶中M2型巨噬细胞比例；**，P<0.01，n＝8；
图18是化合物I有效减少TNBC肺转移灶中多种免疫抑制细胞的浸润：A.化合物I有效减少肺转移灶中FOXP3+CD4+细胞浸润；B.化合物I有效减少肺转移灶中CD11b+Gr1+细胞浸润；**，P<0.01；****，P<0.0001，n＝8；
图19是化合物I可有效减少小鼠模型中三阴性乳腺癌的原位生长，有效促进原位肿瘤组织的坏死和凋亡：A.化合物I给药组的瘤体重量显著降低；B.化合物I给药组的肿瘤坏死和凋亡显著增加；C.化合物I给药组的胶原纤维含量显著降低(200X)；**，P<0.01；**，P<0.001；****，P<0.0001，n＝8；
图20是化合物I有效增加了肿瘤微环境中的效应T细胞并减少了免疫抑制M2型巨噬细胞：A.化合物I有效增加肿瘤间质中浸润的CD8+ T细胞；B.化合物I有效减少肿瘤间质中浸润的M2型巨噬细胞比例；***，P<0.001，n＝8；
图21是化合物I显著抑制肿瘤组织中血管的正常发育：A.化合物I有效减小肿瘤组织中血管官腔面积；B.化合物I显著抑制肿瘤组织中血管的正常成熟发育。***，P<0.001，n＝8。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
本文中的SMS2指鞘磷脂合酶2。
作为本发明实验的基础，我们先后利用Oncomine以及TCGA在线数据库分析发现了SMS2在人的三阴性乳腺癌中存在异常表达，SMS2高表达与M2型巨噬细胞高浸润有关，且与肿瘤患者预后较差有关。
本发明首先利用SMS2基因敲除小鼠的原代骨髓巨噬细胞验证了SMS2活性缺失，可以显著降低IL4诱导的巨噬细胞2型极化，为本发明奠定了实验基础。之后本发明选用人和小鼠最具代表性的三阴性乳腺癌(TNBC)细胞株4T1和MDA-MB-231，针对BALBC小鼠来源的骨髓原代巨噬细胞(BMDM，后续实施例中BMDM均同此含义)开展体外试验；利用4T1建立的小鼠原位三阴性乳腺癌以及肺血行转移模型开展体内实验。
结果表明，体外实验中化合物I可以显著抑制巨噬细胞的SMS2活性，明显减少TNBC细胞诱导的巨噬细胞M2型极化；且该抑制作用可能与mTOR信号通路相关，同样条件下化合物I对巨噬细胞SMS2活性的抑制不改变巨噬细胞M1型极化水平。
体内实验中，采用治疗性给药方案，化合物I能够有效抑制原位肿瘤模型中肿瘤的生长以及血管正常发育；在血行转移模型中，化合物I可以有效抑制肺转移灶的形成；以上治疗作用与化合物I能够有效降低体内血浆鞘磷脂水平，减少肿瘤微环境中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、调节性T细胞(Treg)和骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)这类免疫抑制细胞的浸润，重塑肿瘤微环境密切相关。
SMS2可作为治疗以TNBC为代表的高侵袭性乳腺癌的药物靶点。化合物I可用于预防和治疗人和动物的三阴性乳腺癌。
实施例1：化合物I的实验剂量是有效且安全的。
通过测定化合物I(图中均以ComdI表示)对小鼠来源的巨噬细胞株(RAW264.7)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)的IC50值，确定3倍半数抑制率(IC50)浓度作为本发明的实验用剂量，该剂量对相同实验细胞具有显著的SMS2活性抑制作用(如图1所示)，且该剂量下的细胞毒性作用可忽略(如图2所示)，因此本发明选用的化合物剂量是安全有效的。
实施例2：SMS2在基底样乳腺癌病人中高表达，且与癌组织中M2型巨噬细胞等免疫抑制细胞高度浸润以及患者的不良预后正相关。
为了奠定本发明的实验基础，利用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org)对比分析了乳腺癌组织和正常乳腺组织中SMS2的表达差异；发现相比于正常乳腺组织，SMS2在侵袭性乳腺癌(invisave breast carcinoma)中的表达显著升高(如图3所示)。接下来利用TCGA数据库(Cancer Genome Atlas N.Comprehensive molecular portraits ofhuman breast tumours.Nature 2012；490:61-70.)，分析了522例人乳腺癌中SMS2的表达与肿瘤中免疫抑制细胞浸润的关系。将样本中SMS2的mRNA表达从高到低排序，根据中位数将肿瘤样本划分为“SMS2高”和“SMS2低”。在不同SMS2表达的肿瘤样本中，分析比较了M2型巨噬细胞标志性基因甘露糖受体1(CD206)和巨噬细胞通用基因CD68(CD68)的mRNA表达比值。同时，也分析比较了调节性T细胞(Treg)细胞标志基因叉头转录因子3(FOXP3)的表达和骨髓来源的抑制性细胞(MDSC)细胞标志基因CD11b(CD11b)和CD33(CD33)的表达。统计分析结果如图20所示，在SMS2基因高表达的样本中，CD206/CD68的比值较高，说明SMS2高表达与M2型巨噬细胞浸润程度高有关。同样的，SMS2基因高表达的样本中FOXP3、CD11b和CD33的表达也越高，说明SMS高表达与调节性T细胞和骨髓来源的抑制性细胞高浸润有关，如图4A所示，乳腺癌患者肿瘤中SMS2高表达(SMS2-H)与CD206/CD68比值高有关；如图4B所示，乳腺癌患者肿瘤中SMS2高表达与FOXP3、CD11b及CD33高表达有关。图中SMS2-L代表SMS2低表达。***，P<0.001；****，P<0.0001。
利用在线生物信息学工具Kaplan-Meyer((https://kmplot.com)，将TCGA数据库中的522例乳腺癌样本的mRNA表达根据以下公式计算比值：(KRT5+KRT14)/(KRT8+KRT18)。按照样本的中位数将乳腺癌分为“基底样”(Basal-like)和“导管样”(Luminal-like)两类，高于中位数定义为“基底样”乳腺癌；低于中位数定义为“导管样”乳腺癌。分析比较SMS2在两种乳腺癌中的表达差异，发现SMS2在“基底样”乳腺癌样本中显著高表达，且在“基底样”乳腺癌病人SMS2高表达提示病人无复发生存率(RFS)越低，图5示出了SMS2高表达与患者预后关系，图5A为SMS2在“基底样”乳腺癌中的高表达；图5B为在“基底样”乳腺癌中，SMS2高表达与低RFS有关。***，P<0.001。
实施例3：SMS2活性缺失可有效抑制IL-4诱导的巨噬细胞M2型极化
分离SMS2基因敲除小鼠(KO组)的原代骨髓巨噬细胞BMDM，用含20ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的1640完全培养基分散细胞使终浓度为2x106个/mL。将细胞铺在10cm培养皿或12孔板中培养三天。第三天更换新鲜BMDM生长培养基。待细胞培养7天后，使用流式细胞仪检测CD11b和巨噬细胞通用标志蛋白分子F4/80的表达，评估成熟BMDM的形成(后续实施例中BMDM诱导分化条件均同此)。然后，换用含20ng/mL白介素-4(IL-4，是经典的巨噬细胞2型极化诱导因子)的1640完全培养基诱导细胞极化48小时(48h)。使用流式细胞仪检测M2型巨噬细胞表面标志蛋白(F4/80和CD206)的表达，实时荧光定量PCR法检测M2型相关标志基因的表达水平，以野生型C57bl/6j小鼠(WT组)BMDM作为对照组，SMS2基因敲除小鼠BMDM以KO组表示。
结果显示，SMS2基因敲除不影响BMDM细胞的分化成熟(如图6A所示)，但可以显著抑制IL-4诱导的2型极化标志蛋白分子CD206(图6B)和标志蛋白精氨酸酶1(Arg1)(图6C)的表达(以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参)，同时2型极化的系列标志分子(几丁质酶3样分子(Ym1)、转化生长因子-β(TGF-β))的基因表达水平亦呈现显著降低(图6D)，但IL-4的作用对巨噬细胞I型极化标志蛋白分子CD86的表达没有产生有效影响(图7)。图中control代表正常对照组，DMSO为抑制剂溶剂，作为样本对照组，后续实施例如无特别指出均为以上含义。
实施例4：化合物I可有效抑制IL4诱导的巨噬细胞2型极化。
化合物I在安全实验剂量下，能够有效抑制IL4所诱导的巨噬细胞2型极化。在诱导成熟的BABLC小鼠骨髓原代巨噬细胞(BMDM，后续实施例中BMDM均为此来源的BMDM)和小鼠来源的巨噬细胞株RAW 264.7的细胞培养基(含有10％胎牛血清的1640完全培养基，后续实施例中如无特别指出均为相同培养基)中加入化合物I使其终浓度为10μM，待细胞孵育1小时后加入20ng/mL的IL-4继续培养细胞48小时，然后经流式细胞仪检测BMDM和RAW 264.7细胞表面蛋白F4/80和CD206的表达。结果显示BMDM细胞经化合物I预处理后，F4/80+CD206+细胞的百分比显著减少且CD206的平均荧光强度(MFI)显著降低。同样的，RAW 264.7细胞经化合物I预处理后，CD206 MFI显著降低(图8)。Western blotting方法测定同样证实BMDM和RAW 264.7细胞表面2型极化标志蛋白CD206和Arg1的表达，在化合物I处理后呈现显著下降(图9)。相同实验条件下，反转录荧光实时定量PVR(Q-PCR)方法检测M2型极化标志基因CD206、Arg1、YM1、TGF-β的表达，获得了同样的结果，经化合物I预处理后的BMDM和RAW264.7细胞上述标志基因的mRNA水平显著降低(图10)。
实施例5：化合物I可显著减少TNBC细胞条件培养基诱导的BMDM细胞M2型极化而对M1型极化无影响。
将选用的代表性三阴性乳腺癌细胞株(4T1和MDA-MB-231)分别培养于1640完全培养基，至细胞80％融合度后，收集并重悬细胞使其终浓度为2x106个/mL，取10mL细胞悬液铺种于10cm培养皿中，继续培养72小时后收集细胞培养上清，离心过滤后作为条件培养基(4T1-CM和MDA-MB-231-CM)用于BMDM的培养，以模拟肿瘤生长的微环境。
BMDM细胞用化合物I(终浓度10uM)预处理1小时后，将培养基换成4T1-CM和MDA-MB-231-CM并继续加入化合物I培养细胞72小时。采用流式细胞术分析BMDM细胞表面CD86和CD206的蛋白表达。结果显示，BMDM细胞经4T1-CM和231-CM诱导后，其细胞表面的CD206 MFI和CD86 MFI均显著升高。再经化合物I处理后，CD206 MFI显著降低，而CD86 MFI无明显变化(图11)。
实施例6：化合物I可抑制TNBC细胞条件培养基诱导的BMDM细胞IL-10和TGF-β的分泌。
肿瘤微环境中的巨噬细胞被多种因素所刺激，一方面会发生2型极化，另一方面会分泌多种抗炎、促肿瘤的细胞因子，如白介素-10(IL-10)和TGF-β。利用ELISA方法，测定了BMDM细胞经条件培养基4T1-CM和MDA-MB-231-CM诱导培养后，IL-10和TGF-β的分泌。结果显示，BMDM经化合物I处理后，分泌的IL-10和TGF-β显著减少。(图12)
实施例7：化合物I对肿瘤微环境中BMDM细胞分化的调节作用可能与mTOR1信号通路有关。
为初步探究SMS2参与调控TNBC细胞诱导的巨噬细胞M2型分化的机制，利用Western Blotting方法检测了BMDM中mTORC1信号通路相关标志蛋白磷酸化S6核糖体蛋白(P-S6)和磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)的表达变化。结果可见，BMDM细胞经4T1-CM和MDA-MB-231-CM培养后，P-S6和P-Akt的蛋白表达均升高，而化合物I的作用则显著下调了P-S6和P-AKT的蛋白的升高趋势(图13)。
实施例8：化合物I降低M2型巨噬细胞诱导的4T1细胞的迁移能力。
分离BMDM并诱导分化成熟后，用培养基将BMDM重悬并调整密度为2.5x105个/mL。按2mL每孔的量铺种于6孔板中，培养24小时后换液，SMS2抑制剂组先用化合物I以10μM的终浓度预处理1小时后，再加入20ng/mL的IL-4诱导BMDM极化，对照组先加入DMSO预处理1小时后加入等渗磷酸盐缓冲盐(PBS)，继续培养48小时。之后将各孔培养基全部更换为2mL新鲜1640培养基，继续培养24h，收集各孔的培养上清，过滤后用于4T1细胞的跨膜迁移实验(Transwell实验)。将4T1细胞培养于收集的不同巨噬细胞条件培养基中，48小时后换为无血清1640培养基使细胞饥饿过夜(约16小时)，然后收集细胞重悬于无血清1640培养基中，吸取100μL铺种于提前放置在24孔板中的8μm孔径transwell小室内，孔下层放有600μL1640完全培养基，继续培养12小时后，将transwell小室上层未穿透的细胞用棉签轻轻擦去，向小室中加入95％乙醇，固定细胞20分钟。取出小室，加入0.2％结晶紫染液，染色20min。蒸馏水轻轻漂洗掉小室中多余的染液，放置晾干。
将小室放在载玻片上，用200倍显微镜，拍摄小室中的五个视野，ImageJ软件统计并分析。结果如图14显示，BMDM经IL-4处理后，其条件培养基可有效增加4T1细胞的迁移能力；而经化合物I和IL-4共同处理的BMDM，其条件培养基诱导4T1细胞的迁移能力相比于前者显著降低。
实施例9：口服给予化合物I可有效降低小鼠血浆SM水平。
将6-8周龄BALBC小鼠随机分为两组，每组小鼠8-9只，SMS2抑制组中小鼠每日灌胃20mg/kg的化合物I，对照组中的小鼠每日灌胃0.5％羧甲基纤维素钠(control)，每周两次监测小鼠血浆中的SM含量(ELISA试剂盒检测)，待小鼠经化合物I灌胃14天后，显示血浆中总SM水平显著下降(图15)。
实施例10：口服给予化合物I可有效抑制TNBC细胞在模型小鼠体内的血行转移，并改善肿瘤微环境中TAMs和MSDCs的浸润程度，且这种作用对非肿瘤微环境中的巨噬细胞状态没有影响。
实验用小鼠随机分为两组，给药组预先灌胃给予化合物I(20mg/kg/day)两周，收集体外培养的带荧光素标记的细胞4T1-luc用预冷PBS重悬后，按照1x106的细胞量注射于小鼠尾静脉。细胞接种6小时后，用活体成像仪检测小鼠肺中的荧光信号。实验两周后，再次检测小鼠肺中的荧光信号。接种后SMS2抑制剂组持续灌胃给予化合物I 20mg/kg/day至实验结束，对照组给予等量溶剂(DMSO)。
实验结束后，取小鼠肺组织制备组织切片，通过H&E染色观察并统计肺转移灶的数量。IHC染色分析肺转移灶中巨噬细胞标志性蛋白F4/80和M2型巨噬细胞标志蛋白CD206的表达。免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)双染色分析调节性T细胞的标志蛋白FOXP3和CD4的表达，以及骨髓来源的抑制性细胞标志蛋白CD11b和Gr1(骨髓分化抗原1)的表达。结果显示，化合物I给药组小鼠的肺转移肿瘤灶明显减少(图16)，同时肺转移灶中CD206表达量及CD206和F4/80的比值均显著下降(图17B)；而且FOXP3的表达和FOXP3+占CD4+的比例也明显减少(图18A)，CD11b+Gr1+的细胞数量同样显著较低(图18B)，说明化合物I能够有效减少肺转移灶中M2型巨噬细胞以及其他抑制性免疫细胞的浸润，对TNBC晚期易造成的浸润转移具有一定的治疗效果，且该效果可能与化合物I抑制了SMS2活性后，改善了免疫抑制型的肿瘤微环境相关。
为了证明化合物I的这种治疗作用为肿瘤环境中所特有，提取了灌胃14天的小鼠的腹腔巨噬细胞进行流式细胞仪分析，比较化合物I给药组和对照组中小鼠腹腔巨噬细胞表面蛋白F4/80和CD206的表达。实验结果如图17A所示，两组间的F4/80+CD206+的巨噬细胞百分比没有显著性改变，表明正常生理状态的小鼠巨噬细胞表型不受SMS2抑制剂的影响。化合物I对巨噬细胞极化的影响是与肿瘤微环境相互作用发生的。
实施例11：口服给予化合物I可有效减少小鼠模型中三阴性乳腺癌的原位生长，改变了肿瘤环境中抑制性巨噬细胞和杀伤性T淋巴细胞的浸润比例，同时限制了肿瘤部位血管的成熟。
实验用小鼠首先分两组，给药组预先灌胃给予化合物I(20mg/kg/day)两周，然后收集处于培养的对数生长期的4T1细胞，用预冷PBS调整细胞悬液密度为5x106个/mL，用1mL胰岛素注射器吸取0.1mL单细胞悬液接种于BALB/c小鼠左侧第二乳房垫下，建立乳腺癌原位肿瘤模型并持续每日灌胃给药。接种后第五天开始，每隔一天用游标卡尺测量瘤体的长和宽，按照公式：V(mm3)＝l×W×W/2(V表示体积，L表示瘤体长度，W表示瘤体宽度)，计算并记录瘤体大小，持续三周至给药结束。
实验结束后，分离小鼠肿瘤组织，称重并制备组织切片。然后通过H&E染色考察肿瘤组织的坏死情况；TUNEL染色考察肿瘤组织中细胞的凋亡情况；Masson染色考察肿瘤组织中的胶原纤维含量。结果如图19所示，与对照组相比，化合物I给药组瘤体质地较软、重量较轻(图19A)，肿瘤细胞凋亡数增多(图19B)，肿瘤坏死区域面积增加(图19C)。
还采用免疫组化染色检测了肿瘤环境中2型巨噬细胞和杀伤性T细胞的含量。从结果(图20)可知，巨噬细胞通用蛋白F4/80的表达在两组肿瘤间无明显差异，但M2型标志蛋白CD206的表达在化合物I给药组明显下降，且CD206和F4/80的比值也显著降低，说明化合物I并不影响肿瘤组织中浸润的总巨噬细胞数量。但能够有效抑制肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞(图20B)。我们还检测了肿瘤组织中杀伤性CD8+ T淋巴细胞的含量，结果如图20A所示，治疗组的肿瘤组织中，CD8+ T淋巴细胞的浸润程度远大于对照组。最后，我们利用免疫荧光染色对肿瘤组织中血管内皮细胞标志蛋白CD31和周皮细胞标志蛋白α-SMA(α-肌动蛋白)进行了分析。结果如图21所示，与对照(control)组相比，化合物I治疗组肿瘤中的成熟血管腔面积明显减小(图21A)，周皮细胞标志性蛋白α-SMA显著降低，瘤组织中血管的正常成熟发育受限(图21B)。
综合以上结果可知，口服给予化合物I可以有效降低小鼠血浆SM水平，同时改善TNBC的肿瘤生长状况，减少了M2型巨噬细胞在肿瘤组织中的浸润程度，增加了杀伤性免疫细胞，阻断了肿瘤中血管的正常生长，起到了治疗TNBC的作用。