一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂及试剂盒
阅读说明：本技术 一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂及试剂盒 (Reagent and kit for simultaneously detecting two subtype adenosine deaminase isoenzymes ) 是由 王薇 宋红梅 刘茜 夏良裕 曹晶 钟林庆 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物检测试剂技术领域,特别是涉及一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂及试剂盒。所述实际包括溶解有EHNA的二甲亚砜溶液,所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为0.8～10mg/ml,与1/2待检样品的体积比为(1～6:)40。所述试剂盒包括上述同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂。本发明提供的同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂及试剂盒,能够基于全自动生化仪直接诊断出ADA1缺陷病和ADA2缺陷病,节省了检测时间,且操作简单。填补了现有技术中心无法基于全自动生化仪检测ADA1和ADA2的技术空白点。(The invention relates to the technical field of biological detection reagents, in particular to a reagent and a kit for simultaneously detecting two subtype adenosine deaminase isozymes. The sample detection method comprises the step of actually dissolving the EHNA in the dimethyl sulfoxide solution, wherein the concentration of the EHNA in the dimethyl sulfoxide solution dissolved with the EHNA is 0.8-10 mg/ml, and the volume ratio of the EHNA in the dimethyl sulfoxide solution dissolved with the EHNA to 1/2 of a sample to be detected is (1-6:) 40. The kit comprises the reagent for simultaneously detecting the two subtype adenosine deaminase isozymes. The reagent and the kit for simultaneously detecting the two subtype adenosine deaminase isozymes can directly diagnose the ADA1 defect and the ADA2 defect based on a full-automatic biochemical analyzer, save the detection time and have simple operation. The technical blank that the center of the prior art can not detect the ADA1 and the ADA2 based on a full-automatic biochemical analyzer is filled.)
技术领域
本发明涉及生物检测试剂技术领域，特别是涉及一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂及试剂盒。
背景技术
腺苷脱氨酶(ADA)广泛存在于多种组织，有两种不同亚型同工酶ADA1及ADA2。临床上一般仅检测总的ADA，其升高用于提示肝功受损、或结核感染等。近年发现ADA的两种同工酶ADA1缺陷及ADA2缺陷会引发不同的原发免疫缺陷病，原发性免疫病是一类多发于儿童时期的严重、可致命的罕见病，该类疾病病种繁多，涉及基因近四百种，且症状重叠复杂，难以明确诊断。ADA1缺陷为严重的联合免疫缺陷，可致命；ADA2缺陷主要为自身炎症反应，发热、皮疹、血管炎及多系统受损。基因检测虽能给予一定提示，但由于大量致病性不明突变位点的存在，使其诊断存疑。直接对ADA1及ADA2的活性进行检测，可从功能上对两种疾病进行明确诊断。
目前国内医院仅检测总ADA，不能检测两种不同亚型的同工酶。一般为应用全自动生化仪配合相应的ADA检测试剂盒检测，而未开展ADA1和ADA2两种同工酶的检测。有科研实验室应用ADA1特异性抑制剂——EHNA特异性抑制ADA1，进而通过检测剩余ADA活性而明确ADA2的方法，然而一般在科研实验室进行，需要将EHNA加入体积巨大的反应池中进行检测，且一般为手工操作，未应用于临床。目前尚未见到可方便快捷直接应用全自动生化仪同时检测ADA1和/或ADA2的试剂盒。由此可见，能否提出一种方便快捷的应用全自动生化仪检测ADA1及ADA2的试剂及试剂盒，包括其中优化选择的试剂浓度及剂量，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的一个目的是要提供一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂及试剂盒，以解决现有技术中采用人工配制和检测的技术难题，提供一种试剂盒能够基于全自动生化仪进行自动检测，能够直接诊断出ADA1缺陷病和ADA2缺陷病节省了检测时间，且操作简单。所述同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂中包括用于抑制ADA1活性的溶解有EHNA的二甲亚砜溶液。
进一步优选的，所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为0.8～10mg/ml，更进一步优选的所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为5-10mg/ml。
一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒，所属试剂盒包括上述同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂。
进一步的，所述试剂盒还包括用于检测ADA总活动值的A组试剂。
更进一步优选的，所述A组试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括以下组分：25mmol/L pH为8.0Tris-HCL、4mmol/L的4-AA、0.3U/ml的PNP、0.4U/ml的XO、0.1U/ml的过氧化物酶、稳定剂、防腐剂；所述试剂2包括以下组分：25mmol/L pH为4.0的Tris-HCL、11mmol/L的腺苷、4mmol/L的EHSPT、防腐剂。
进一步的，所述A组试剂加入到全自动生化仪的反应池中，所述A组试剂中溶解有EHNA的二甲亚砜溶液与1/2待测样本按照体积比为(1～6)：40进行混合，完全混匀后，用全自动生化仪采样针取样后，与反应池中的A组试剂混合检测得到ADA2活性值；另外1/2待测样本，用全自动生化仪采样针取样后，与反应池中的所述A组试剂混合检测得到ADA总活性值；ADA1活性值＝ADA总活性值-ADA2活性值。
进一步的，所述ADA2活性值需进行校正，校正方法为：校正ADA2活性值＝ADA2活性值×[(1/2待测样本体积值+溶解有EHNA的二甲亚砜溶液体积值)÷1/2待测样本体积值]；校正ADA1活性值＝ADA总活性值-校正ADA2活性值。
本发明提供的同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒由于能够应用全自动生化仪检测，因此节省了时间，并且操作简单。填补了现有技术中心无法基于全自动生化仪检测ADA1和ADA2的技术空白点。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
后文将参照附图以示例性而非限制性的方式详细描述本发明的一些具体实施例。附图中相同的附图标记标示了相同或类似的部件或部分。本领域技术人员应该理解，这些附图未必是按比例绘制的。附图中：
图1是根据本发明实施例4的ADA(或ADA2)校正活性值-溶解有EHNA的二甲亚砜溶液体积的曲线图。
具体实施方式
实施例1：一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂，包括用于抑制ADA1活性的溶解有EHNA的二甲亚砜溶液，所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为0.8～10mg/ml，具体的所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度可以为0.8mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、4mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、8.5mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml、10mg/ml中的任一种，本领域技术人员可根据检测样本量进行选择。进一步优选的，所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为5～10mg/ml，在该浓度范围内，在尽量少的加入DMSO的同时，保证在采用全自动生化仪检测过程中不堵针，且对其他指标无影响，检测结果更为精准。
实施例2：一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒，所述试剂盒包括实施例1所述的同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂。
已知EHNA为ADA1特异性抑制剂，为了实现基于全自动生化仪检测ADA1和ADA2，需要使待检测物能够被全自动生化仪顺利抽样，并且不会堵针，并能顺利洗脱，不会影响全自动生化仪检测其他项目。然而EHNA为粉末状固体，如果直接加入待检样本中，需要精确称量到ng(10-9克)或pg(10-12克)水平，而达到如此精确的称量水平难度较高。因此本发明将EHNA溶解于二甲亚砜中，选用DMSO(二甲亚砜)溶解EHNA，溶解度大，又可与血清、血浆、其他各种组织液完美互溶，能够解决上述技术难题。
检测试验：
检测方法：取某血清检测全套自动生化仪所有生化指标。然后试验性将溶解有EHNA的二甲亚砜溶液(浓度24.2mmol/L，7.59mg/ml)，以1:10比例加入血清作为试验样品，如50μl溶解有EHNA的二甲亚砜溶液加入500μl血清(根据全自动生化仪采样需要的体积而设定)。
检测结果：采用全自动生化仪检测，设定每次取样5μl，重复检测全套生化指标，未发现堵针现象，可有效洗脱。除ADA检测结果外，其余各项指标均与加抑制剂前所有结果一致。结果表明所使用的溶解有EHNA的二甲亚砜溶液不影响其他检测项目。说明该溶媒可完美适用于全自动生化仪。
更优选的，所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为7.59mg/L。即可节省用量，又能完全抑制样本中的ADA1活性。
实施例3：一种同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒，包括用于抑制ADA1活性的溶解有EHNA的二甲亚砜溶液，所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液中EHNA的浓度为7.59mg/L，以及用于检测ADA总活动值的A组试剂，所述A组试剂包括ADA检测所需试剂。
进一步为了提高同时检测两种亚型
腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒的检测精度，A组试剂包括试剂1和试剂2，所述试剂1包括以下组分：25mmol/L pH为8.0Tris-HCL、4mmol/L的4-AA、0.3U/ml的PNP、0.4U/ml的XO、0.1U/ml的过氧化物酶、稳定剂、防腐剂；试剂2包括以下组分：25mmol/L pH为4.0的Tris-HCL、11mmol/L的腺苷、4mmol/L的EHSPT、防腐剂。
所述试剂盒的操作方法如下：所述A组试剂加入到全自动生化仪ADA检测的反应池中，所述溶解有EHNA的二甲亚砜溶液与1/2待测样本按照体积比为(1～6)：40进行混合，完全反应后，用全自动生化仪采样，检测得到ADA2活性值；所述另外1/2待测样本用全自动生化仪采样检测得到ADA总活性值；ADA1活性值＝ADA总活性值-ADA2活性值。
所述ADA2活性值和ADA1活性值需进行校正，校正方法为：校正ADA2活性值＝ADA2活性值×[(1/2待测样本体积值+溶解有EHNA的二甲亚砜溶液体积值)÷1/2待测样本体积值]；校正ADA1活性值＝ADA总活性值-校正ADA2活性值。
实施例4：分别取5个人的血清，每人各取若干份200μl血清，每份依次加入EHNA的DMSO溶液(浓度7.59mg/L)0μl，1μl，2μl，5μl，10μl，15μl，20μl，30μl，40μl，50μl，应用全自动生化仪检测ADA活性，根据各自加入的体积，进行活性校正。校正方法同实施例3所述的校正方法，进一步绘制ADA校正活性值-溶解有EHNA的二甲亚砜溶液体积的曲线图，如图1所示。
如图1结果可知，在加入1μlEHNA溶液时即可对ADA1产生明显抑制作用；2μl达到基本抑制效果；5μl-30μl时可完全抑制ADA1，使校正后的ADA2活性值趋于稳定。但在加入40μl及50μl时，加入EHNA溶液的血清产生了明显的沉淀，且检测结果出现了异常。因此我们选用5-30μl的范围都是可行的，则所述A组试剂中溶解有EHNA的二甲亚砜溶液与1/2待测样本的体积比为(1～6)：40。
实施例5：采用实施例3所述的同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒和检测方法检测3例ADA2(DADA2)缺陷患儿及其父母，分别取每个人的血清，分成2份，每份200μl。全自动生化仪ADA检测的反应池中加入实施例3所述的A组试剂。其中一份血清加入实施例3所述的A组试剂(浓度7.59mg/L)20μl，另一份血清不加任何物质。分别应用全自动生化仪采样进行ADA检测，分别得到ADA2值和ADA总值，进行校正后，3例患儿的校正ADA2值分别为：0IU,0.20IU，0IU；总ADA值分别为：3.45IU，3.64IU，3.61IU；校正ADA1值为：3.45IU，3.44IU,3.61IU。患儿父母(携带者,5人)的校正ADA2值分别为：1.58IU，3.44IU,1.79IU，2.17IU，1.91IU；总ADA值分别为4.13IU,6.73IU,4.55IU,5.34IU,4.25IU；校正ADA1值分别为：2.55IU,3.39IU,2.76IU，3.17IU，2.34IU。可见3例患儿ADA2值非常低下，符合ADA2缺陷的诊断。由此证明本发明所提供的同时检测两种亚型腺苷脱氨酶同工酶的试剂盒能够应用全自动生化仪检测，能够直接诊断出ADA1缺陷病和ADA2缺陷病，节省了检测时间，且操作简单。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。