具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中，检测8-OG DNA糖基化酶活性的方法通常只能检测缓冲溶液或细胞提取物中8-OG DNA糖基化酶活性，不能直接反映该酶在活细胞复杂环境中的活性水平。而基于DNA功能化纳米材料的原位荧光方法虽然能够用于成像细胞内8-OG DNA糖基化酶活性，但这些原位荧光方法仅通过单一荧光信号强度来显示细胞内8-OGDNA糖基化酶的活性信息，这些依靠单一荧光信号强度的原位荧光方法会受到细胞内核酸酶降解产生的假阳性信号的干扰，从而影响检测准确度。

为了解决如上的技术问题，本发明第一方面提供一种DNA四面体纳米开关，包括：DNA四面体，DNA四面体的一个顶点上连接有双链DNA探针；

其中，所述双链DNA探针是由含8-OG的识别链和标记有供体/受体双荧光团的报道链杂交而成。

本发明所提供的DNA四面体纳米开关，初始时，供体/受体双荧光团之间的距离较远，无FRET发生。在8-OG DNA糖基化酶的作用下，双链DNA探针中的8-OG被移除，并且产生的无嘌呤/无嘧啶(AP)位点也被切刻，因此报道链从双链DNA中解离并形成发夹结构，使供体/受体双荧光团彼此靠近，从而发生高效的FRET。

该DNA四面体纳米开关的构建能灵敏且选择性地检测细胞外的8-OG DNA糖基化酶活性。更重要的是，基于FRET信号输出模式，能避免核酸酶降解导致的假阳性信号，从而提高检测准确度。另外，再结合DTNS良好的细胞摄取能力，能准确、原位成像细胞内8-OG DNA糖基化酶活性。

进一步的，所述DNA四面体的制备方法为：

1)制备DNA四面体：将四条DNA链进行等摩尔量混合，并在90-95℃下加热5-10min，然后快速转移至冰水浴中冷却20-40min，接着在3-5℃下放置1-2h；

2)制备双链DNA探针R-H：将识别链R和报道链H进行等摩尔量混合，并在25℃下孵育1-1.5h；

3)制备DTNS：将上述制备的DNA四面体和双链DNA探针R-H进行等摩尔量混合，并在25℃下孵育1-1.5h。

所述制备DNA四面体、双链DNA探针R-H、DTNS的过程，均在在1×PBS缓冲溶液中进行。

本发明第二方面提供一种DTNS介导的检测细胞外目标物中8-OG DNA糖基化酶活性的方法，具体为：

(1)构建DNA四面体纳米开关；

(2)将细胞外目标物、DNA四面体纳米开关共同孵育；

(3)进行荧光光谱测量。

进一步的，在37℃下孵育60-100min，优选为90min。

进一步的，荧光光谱测量过程中，激发波长为525nm，发射波长为550nm-750nm。激发和发射狭缝宽度为10nm，光电倍增管电压为700V。

本发明第三方面提供一种DTNS介导的活细胞内8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶活性比率成像的方法，具体包括：

(1)构建DNA四面体纳米开关；

(2)将目标细胞、DNA四面体纳米开关共同孵育。

(3)进行共聚焦激光扫描显微镜成像。

进一步的，目标细胞先在添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养，然后接种在共聚焦培养皿上，孵育20-25h，再与DNA四面体纳米开关进行共同孵育。

进一步的，孵育时间为2-4h，优选为3h。

进一步的，共聚焦激光扫描显微镜成像过程中，在543nm波长的激发光下，采集550nm-639nm范围内的Cy3发射光以及640nm-700nm范围内的Cy5发射光。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

1、实验过程

(1)材料和仪器

本发明使用的DNA寡核苷酸是由生工(中国，上海)合成和纯化的，具体序列见表1。8-OG DNA糖化酶(Fpg)、尿嘧啶DNA糖化酶(UDG)、烷基化腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)、DNA酶I(DNase I)均购自New England Biolabs(中国，北京)。胎牛血清(FBS)购于双洳生物(中国，上海)。细胞培养基DMEM和RPMI-1640购于普诺赛(中国，武汉)。青霉素-链霉素溶液、胰酶购于碧云天(中国，上海)。

琼脂糖凝胶成像采用4600SF凝胶成像系统(中国，天能)。荧光光谱测量采用F-7000荧光分光光度计。共聚焦荧光成像采用LSM-880共聚焦激光扫描显微镜(德国，蔡司)。

(2)制备DTNS

首先，制备DNA四面体。在1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)中，将四条DNA链进行等摩尔量混合。该混合样品在95℃下加热5min，然后快速转移至冰水浴中冷却30min，接着在4℃下放置1h。制备的样品保存于4℃，以备下一步使用。

第二，制备双链DNA探针R-H。将识别链R和报道链H在1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)中进行等摩尔量混合，并在25℃下孵育1h。

最后，制备DTNS。将上述制备的DNA四面体和双链DNA探针R-H在1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)中进行等摩尔量混合，并在25℃下孵育1h。最终得到的DTNS浓度为500nM。

(3)电泳表征

利用琼脂糖凝胶电泳，表征DNA四面体和无标记的DTNS。制备2.5％的琼脂糖凝胶：1.5g琼脂糖,60mL 1×TBE缓冲溶液，8.0μL核酸染料GelRed。10.0μL DNA样品与2.0μL6×凝胶上样缓冲液进行混合，然后取6.0μL的混合物上胶。在100V电压下，电泳在1×TBE缓冲液中运行约1小时。

(4)检测细胞外的目标物8-OG DNA糖基化酶活性

为检测细胞外的目标物8-OG DNA糖基化酶活性，含100nM DTNS,不同浓度目标物(0U/mL,1.0U/mL,2.0U/mL,5.0U/mL,8.0U/mL,10U/mL和20U/mL),1×NEBuffer 1和100μg/mL牛血清蛋白(BSA)的100μL混合溶液在37℃下孵育90min。然后，对混合溶液进行荧光光谱测量。激发波长为525nm，发射波长为550nm-750nm。激发和发射狭缝宽度为10nm，光电倍增管电压为700V。另外，为了研究选择性，除了将目标物8-OG DNA糖基化酶换成其他DNA糖基化酶之外，其他步骤与上述一致。

(5)预防假阳性信号能力的研究

为研究本策略对DNase I降解导致的假阳性信号的预防能力，含100nM DTNS,0.5U/mL DNase I,1×PBS缓冲液(pH 7.4)的100μL混合溶液在37℃下孵育2h。对照组中除了无DNase I外，其他条件与上述相同。测量荧光光谱时的光谱条件与(4)中的一致。

(6)细胞培养

HeLa细胞在添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养。MCF-7细胞在添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中培养。所有细胞系均置于37℃、含5％CO₂的细胞培养箱中进行培养。

(7)共聚焦荧光成像活细胞内的8-OG DNA糖基化酶活性

为了比率成像活细胞内的8-OG DNA糖基化酶活性，将HeLa细胞接种在共聚焦培养皿上，孵育24h。然后，将HeLa细胞与100nM DTNS或对照组DTNS共同孵育3h。随后，用PBS冲洗细胞三次，用于共聚焦激光扫描显微镜成像。在543nm波长的激发光下，采集550nm-639nm范围内的Cy3发射光以及640nm-700nm范围内的Cy5发射光。

2、结果分析

(1)DTNS-介导的FRET策略的设计原理

本发明的设计原理如图1所示，设计的DTNS是由两部分组成：DNA四面体和双链DNA探针。DNA四面体是由四条定制的DNA链组装而成(A、B、C、D，表1)，其顶点上悬垂着一条短单链DNA。双链DNA探针是由含8-OG损伤碱基的识别链和标记有Cy3/Cy5双荧光团的报道链杂交而成，其末端悬垂着与四面体顶点上悬垂的DNA序列互补的短单链DNA。因此，该双链DNA探针可通过碱基互补配对连接到DNA四面体的一个顶点上，得到DTNS。

初始时，DTNS处于打开状态，标记的Cy3供体和Cy5受体彼此分离，导致低效的FRET。然而，当8-OG DNA糖基化酶存在时，DTNS的结构由打开态变为闭合态。具体来讲，8-OGDNA糖基化酶移除双链DNA探针中的8-OG，并切除产生的AP位点，导致双链DNA解旋并释放出报道链。随后，释放的报道链通过碱基互补配对形成发夹结构，使Cy3供体和Cy5受体之间的距离靠近，从而发生高效的FRET。另外，由于DNA四面体良好的细胞摄取能力，DTNS容易进入活细胞，在细胞内8-OG DNA糖基化酶的作用下，Cy3供体的荧光强度减弱，而Cy5受体的荧光强度增强。

(2)DTNS的表征及检测可行性研究

为验证DTNS的形成，进行琼脂糖凝胶电泳分析。首先，随着四条DNA链的逐一加入，产物条带的电泳迁移率逐渐降低(图2A)。这是由于杂交产物的分子量逐渐增大且其空间结构更加复杂，表明DNA四面体已成功组装。接着，将识别链R与报道链H等量混合，在泳道2中只观察到一个条带，且该条带的电泳迁移率比泳道1中报道链H的迁移率更低(图2B)，表明R和H杂交形成了具有更高分子量的DNA双链R-H。最后，将DNA双链R-H与DNA四面体等量混合，在泳道4中观察到R-H的条带和四面体的条带均消失，而是出现了一个迁移率更低的新条带(图2B)，这表明DNA双链R-H已连接到DNA四面体上，从而形成了DTNS。

另外，在细胞外考察了DTNS-介导的FRET用于检测目标物8-OG DNA糖基化酶活性的可行性。如图2C所示，当加入目标物之后，Cy3供体在565nm处的荧光强度降低，而Cy5受体在665nm处的荧光强度增加。这表明DTNS能有效识别目标物，并发生结构从打开态到闭合态的转变，引发高效的FRET，从而验证了本策略在细胞外检测目标物的可行性。

(3)DTNS-介导的FRET策略的细胞外分析性能

随后，在细胞外考察了DTNS-介导的FRET策略用于定量检测目标物8-OG DNA糖基化酶活性的能力。如图3A所示，随目标物浓度的增加，Cy3供体荧光逐渐降低，而Cy5受体荧光逐渐增强。并且，Cy5受体与Cy3供体的荧光比值(F_A/F_D)与目标物浓度在0U/mL到10U/mL范围内显示出良好的线性关系(图3B)。本策略对8-OG DNA糖基化酶活性的检测限为0.3653U/mL，优于或相当于之前的研究。

为考察本策略的选择性，其他DNA糖基化酶活性也通过本策略进行了细胞外检测。如图3C和3D所示，只有目标物8-OG DNA糖基化酶能引发高效的FRET以及高的F_A/F_D比值，这证实本策略具有良好的选择性。

因此，本策略能在细胞外灵敏且选择性地检测目标物8-OG DNA糖基化酶活性，也暗示其有潜力应用于8-OG DNA糖基化酶活性的细胞成像。

(4)考察DTNS-介导的FRET策略预防假阳性信号的能力

为考察本策略对假阳性信号的预防能力，研究了DNaseI对背景F_A/F_D比值的影响。DNaseI是一种既能水解单链DNA又能水解双链DNA的核酸内切酶。如图4所示，当向DTNS中加入DNaseI之后，背景的F_A/F_D比值不仅没有升高，反而稍下降。这是因为DTNS被DNaseI降解之后，Cy3供体和Cy5受体之间的距离将更远，无FRET发生。该结果表明本策略能预防核酸酶降解导致的假阳性信号，这对细胞内的准确成像而言非常关键。

(5)8-OG DNA糖基化酶活性的细胞内成像

基于上述结果，进一步研究DTNS-介导的FRET策略用于比率成像活细胞内8-OGDNA糖基化酶活性的可行性。如图5A所示，DTNS与HeLa细胞共同孵育3h之后，在细胞质中观察到明显的FRET信号(红色，Cy5)。这是因为在细胞内源性8-OG DNA糖基化酶的作用下，DTNS的结构由开放态变为闭合态，使Cy3供体和Cy5受体之间的距离靠近，从而引发高效的FRET。这一结果证明了本策略在活细胞中对8-OG DNA糖基酶活性进行比率成像的可行性。另外，为了证实本策略在活细胞内成像内源性8-OG DNA糖基化酶活性的特异性，设计了无8-OG的对照组DTNS。如图5B所示，对照组DTNS与HeLa细胞共同孵育3h之后，细胞质中无明显的FRET信号(红色，Cy5)。这些结果证实了本策略可用于细胞内8-OG DNA糖基酶活性的原位和准确成像。

实施例中使用的DNA寡核苷酸序列如表1所示：

表1

其中，SEQ ID NO.5中的符号“O”为损伤碱基“8-OG”。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 聊城大学

<120> 一种DTNS介导的检测8-OG DNA糖基化酶活性的方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atcacccaaa ccctcaatct tttacattcc taagtctgaa acattacagc ttgctacacg 60

agaagagccg ccatagta 78

<210> 2

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcagccaagc atactaacta ttttatcacc aggcagttga cagtgtagca agctgtaata 60

gatgcgaggg tccaatac 78

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaactgcct ggtgataaaa cgacactacg tgggaatcta ctatggcggc tcttc 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcagactta ggaatgtgct tcccacgtag tgtcgtttgt attggaccct cgcat 55

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatcaactog gagaatotaa ctga 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aatcaactgg gagaatgtaa ctga 24

<210> 7

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agattgaggg tttgggtgat tttcagttac attctcccag ttgattccat gtgtagaaat 60

caactgggag aa 72