具体实施方式

本发明是基于开发用于确定聚合物上负载的药物的量的新型量化方法。在某些实施方案中，所述方法包括切割交联透明质酸-接头-肽药物(xHA-L-P)的样品中存在的透明质酸(HA)，以形成低聚透明质酸-接头-肽药物(oHA-L-P)的异质混合物。然后可以对oHA-L-P进行蛋白水解消化以产生均质的肽消化产物，所述均质的肽消化产物可以使用本领域熟知的方法(如例如液相色谱法、质谱法、UV吸收、基于荧光的测定等)进行检测和量化。在特定的示例性实施方案中，提供了包含xHA-L-P(例如，SAR425899前药)的组合物，其中“P”是肽药物SAR425899，“L”是自切割交联剂，并且“xHA”是交联透明质酸(图2)。

如本文所用，术语“前药”旨在指在展现出其药理作用之前经历生物转化的化合物。因此，前药可以被视为含有专用的无毒保护基团的生物活性部分，所述专用的无毒保护基团以瞬时的方式使用以改变或消除母体分子的不期望的特性。典型的前药可以是载体连接的前药，其含有给定活性物质与瞬时载体基团的暂时连接，所述瞬时载体基团产生改善的物理化学特性或药代动力学特性并且通常可以通过水解切割在体内被容易地去除；级联前药，其载体基团的切割仅在暴露激活基团之后才变得有效。

为了增强药物(如SAR425899)在体内的物理化学特性或药代动力学特性，可以将这种药物与载体(例如，xHA)缀合。如果药物与载体和/或接头瞬时结合，则通常将此类体系指定为载体连接的前药。根据IUPAC提供的定义，载体连接的前药是指含有给定活性物质与瞬时载体基团的暂时连接的前药，所述瞬时载体基团产生改善的物理化学特性或药代动力学特性并且通常可以通过水解切割在体内被容易地去除。

本文描述的载体连接的前药中使用的接头可以是任何已知的可切割的接头或不可切割的接头，例如，酶不稳定的接头(例如，酸可切割的接头、可还原的接头(例如，二硫键接头)、β-葡糖苷酸接头等)、光可切割的接头、硫醚接头、马来酰亚胺基己酰基接头、肽接头(例如，二肽接头)、交联剂等。合适的接头可以商购自多个供应商，如例如，Sigma-Aldrich、Millipore Sigma、Creative Biolabs等。

在某些示例性实施方案中，本文描述的载体连接的前药中使用的接头是瞬时的(例如，可自切割的)，这意味着它们在生理条件下是可非酶促水解降解的(可切割的)，其半衰期的范围为例如一小时至三个月。

如本文所用，“生理条件”是指关于身体中预期释放药物的特定环境的温度、pH等。例如，在血浆中的释放将在7.35与7.45之间的pH下、在约37℃(例如，在约36℃与约38℃之间)的温度下发生，而在溶酶体中的释放将在约6.5与约4.5之间的pH下、在约37℃的温度下发生。

在某些示例性实施方案中，药物(例如，肽药物)通过自切割接头(例如，xHA水凝胶载体)与水凝胶载体瞬时连接。术语“水凝胶前药”和“水凝胶连接的前药”是指与水凝胶瞬时连接的生物活性剂的前药，并且二者同义使用。

术语“药物”、“肽药物”、“生物活性分子”、“生物活性部分”、“生物活性剂”、“活性剂”等是指可影响生物有机体(包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人)的任何物理或生化特性的任何物质。特别地，如本文所用，生物活性分子包括旨在用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防人或动物的疾病或以其他方式增强人或动物的身体或精神健康的任何物质。在某些示例性实施方案中，术语“药物”、“生物活性分子”、“生物活性部分”、“生物活性剂”、“活性剂”等是指肽药物，如例如SAR425899。

药物的“游离形式”是指如从水凝胶缀合物前药(例如，SAR425899前药)释放后的未经修饰的药理学活性形式的药物(例如，SAR425899)。

如本文所用，短语“抗癌治疗剂”或“抗癌剂”是指对赘生性细胞或肿瘤细胞或癌细胞的生长和/或增殖不利并且可以起到减少、抑制或破坏恶性肿瘤的作用的分子。

如本文所用，术语“细胞生长抑制物”是指抑制细胞生长和增殖的分子。

如本文所用，短语“细胞毒性核苷”是指通过模仿内源性核苷来发挥细胞毒性作用的核碱基或核苷类似物。

如本文所用，短语“微管蛋白结合剂”是指与微管蛋白体系直接缔合的分子。

如本文所用，术语“激素”是指由多细胞有机体中的腺体产生并通过循环系统输送至远端靶器官以调节生理机能和/或行为的一类信号传导分子的任何成员。“激素拮抗剂”是作用于激素受体的特定类型的受体拮抗剂。

如本文所用，短语“抗血管生成剂”是指抑制血管生成的生理过程的分子，通过所述血管生成的生理过程从先前存在的血管形成新血管。

如本文所用，短语“酶抑制剂”是指抑制特定酶功能的分子。

如本文所用，短语“基因调节剂”是指可以从正面或从负面影响基因转录的分子。

如本文所用，短语“细胞毒性治疗剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。术语“细胞毒性剂”旨在包括化学治疗剂、酶、抗生素和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段和/或变体)，以及以下公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂是紫杉烷、长春新碱(vincas)、美登木素生物碱或美登木素生物碱类似物(如DM1或DM4)、小药物、来普霉素衍生物、瑞奥西汀(auristatin)或尾海兔素(dolastatin)类似物、前药、拓扑异构酶II抑制剂、DNA烷基化剂、抗微管蛋白剂、CC-1065或CC-1065类似物。

如本文所用，短语“药学上可接受的载体”是指生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括以下中的一种或多种：水、氨基酸、盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐；氨基酸及衍生物，如组氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甘氨酰甘氨酸；无机盐NaCl、氯化钙；糖或多元醇，如葡萄糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇；表面活性剂，如聚山梨酯80、聚山梨酯20、泊洛沙姆188；等等及其组合。在许多情况下，在组合物中包含等渗剂(如糖、多元醇或氯化钠)是合适的，并且配制品还可以含有抗氧化剂(如色胺)和稳定剂(如吐温20)。

如本文所用，术语“透明质酸”、“HA”和“玻尿酸”可互换使用，并且是指由通过β-1-3和β-1-4糖苷键((例如，→4)-β-d-GlcpA-(1→3)-β-d-GlcpNAc-(1→))连接的d-葡糖醛酸和N-乙酰基-d-葡萄糖胺的重复二糖单元组成的非硫酸盐线性多糖。HA具有不同的分子量。高分子量HA(HMWHA)大于约1×10⁶Da，并且低分子量HA(LMWHA)为约0.8至约8×10⁵Da。低聚HA典型地小于约6×10³Da。

HA可以商购自供应商，如Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)、Novozymes(内布拉斯加州布莱尔)和Stanford Chemicals(加利福尼亚州森林湖)。FDA批准的HA包括但不限于Hyalovet(Boehringer Ingelheim Vetmedica，获批用于兽医用途)、Hylira(Hawthorn)、Hylase(ECR)、Hylartin V(Zoetis，获批用于兽医用途)、Hyvisc(Anika Therapeutics，获批用于兽医用途)、Legend(Bayer Animal Health，获批用于兽医用途)、NexHA(Vetoquinol，获批用于兽医用途)、Orthovisc(DePuy Mitek)、ProVisc(Alcon)、Shellgell(Cytosol Opthalmics)、Solesta(Salix)、Supartz(Bioventus)、Synacid(Intervet，获批用于兽医用途)、Healon5(Abbott Medical Optics)、Healon GV(Abbott)、HealonEndocoat(Abbott Medical Optics)、Healon(Abbott)、Euflexxa(FerringPharmaceuticals)、Equron(Zoetis，获批用于兽医用途)、Coease(Abbott MedicalOptics)、Bionect(Cipher)、Amvisc(Chiron)、Synvisc(Genzyme)、Gel-One(ZimmerBiomet)、和Hyaglan(Fidia Pharma)。

为了改善HA的机械特性并延长其在体内的持续时间，可以通过将HA聚合物链共价交联成三维网络来形成水凝胶(参见例如，Berg和BioDrugs19:23；Edsman等人(2011)Cartilage 2:384)。交联HA(xHA)水凝胶的机械特性和物理特性取决于修饰和交联的程度(La Gatta，Schiraldi，Papa和De Rosa(2011)PolymerDegradation and Stability 96:603；)。

如本文所用，术语“交联剂”(“crosslinking agent”和“crosslinker”)旨在涵盖可以通过共价键和/或非共价键中的至少一个与透明质酸反应的化学剂。非共价键的非限制性例子包括离子键、疏水相互作用、氢键和范德华力(分散吸引力、偶极-偶极和偶极诱导的相互作用)。

如本文所用，术语“交联”旨在指已经经由交联剂共价和/或非共价键合的两条或更多条透明质酸的聚合物链。这种交联不同于分子间或分子内脱水，所述分子间或分子内脱水导致在单个聚合物链内或两个或更多个链之间形成内酯、酸酐或酯。但是可以预期分子内交联也可以在本文描述的组合物中发生。交联剂含有在两个或更多个分子(即透明质酸链)之间产生共价和/或非共价键的至少两个官能团。在本公开文本的一方面，交联剂包含与透明质酸的官能团互补的官能团使得可以进行交联。

HA的物理交联可以使用各种pH、温度、离子强度条件和物理化学相互作用(例如，疏水相互作用、氢键合、电荷相互作用或立体络合)来实现。特别地，已经针对各种应用对温度响应性水凝胶进行了广泛的检查。经常用于修饰HA以制备热敏HA水凝胶的常见热胶凝聚合物包括：聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、普朗尼克酸(pluronic acid)、甲基纤维素和聚乙二醇(PEG)。

使HA交联以形成水凝胶的方法包括但不限于：修饰-COOH基团的方法，修饰-OH基团的方法、修饰-NHCOCH₃基团的方法，以及使用希夫碱交联、二醛透明质酸(CHO-HA)、硫醇修饰、Diels-Alder反应和酶介导的连接的化学交联方法。

HA水凝胶的交联方法描述于以下各文献中：Kenne等人(2013)Carb.Polymers 91:410；和Khunmanee,同上；Hoare TR,Kohane DS.Hydrogels in drug delivery:progressand challenges.Polymer 2008；49(8):1993-2007；Gupta D,Tator CH,ShoichetMS.Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose forintrathecal,localized delivery to the injured spinal cord.Biomaterials 2006；27(11):2370–2379；Fang,J-Y,Chen,J-P,Leu,Y-L.Temperature-sensitive hydrogelscomposed of chitosan and hyaluronic acid as injectable carriers for drugdelivery.Eur J Pharm Biopharm 2008；68(3):626–636；和Ha DI,Lee SB,Chong MS,等人Preparation of thermo-responsive and injectable hydrogels based on hyaluronicacid and poly(N-isopropylacrylamide)and their drug releasebehaviors.Macromol.Res.2006；14(1):87–93，上述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文用于所有目的。

交联HA可以商购自供应商，如Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)和StanfordChemicals(加利福尼亚州森林湖)。

如本文所用，术语“水凝胶”旨在指能够吸收大量水的三维、亲水性或两亲性聚合物网络。这些网络由均聚物或共聚物组成，由于存在共价化学或物理(离子、疏水相互作用、缠结)交联而是不可溶的。交联提供网络结构和物理完整性。水凝胶展现出与水的热力学相容性，这使其可以在水性介质中溶胀。所述网络的链以以下方式连接，使得存在孔并且这些孔的很大一部分的尺寸在1nm与1000nm之间。

在某些实施方案中，本文描述的方法利用一种或多种酶和/或化合物来切割xHA，例如，来切割xHA-L-P中存在的xHA以形成oHA-L-P。

适用于切割xHA的酶包括但不限于：细菌β-内切糖苷酶、细菌β-外切糖苷酶(例如，β-葡糖苷酸酶、β-N-乙酰基-己糖苷酶等)、真核β-内切糖苷酶(例如、内切-β-n-乙酰基己糖苷酶、β-内切葡糖苷酸酶等)、真核β-外切糖苷酶(例如，β-外切葡糖苷酸酶、外切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶等)、透明质酸酶、透明质酸葡糖苷酶等。

切割xHA的非酶促方法包括但不限于：酸性水解、碱性水解、超声降解、热降解、通过氧化剂降解(例如、超氧阴离子自由基、过氧化氢、单线态氧、羟基自由基、一氧化氮、过氧亚硝酸盐阴离子、次氯酸阴离子、碳酸根阴离子、二氯根自由基阴离子等)、微波辐照、UV辐照、γ辐照、Hg灯辐照等。(参见Ripka等人(2007)Biotechnol.Adv.25:537，将其通过引用以其整体并入本文用于所有目的。)

在其他实施方案中，本文描述的方法利用一种或多种透明质酸葡糖苷酶(例如，透明质酸酶(HAase))来切割xHA，例如，切割xHA-L-P中存在的xHA以形成oHA-L-P。在某些示例性实施方案中，使用两种、三种、四种、五种或更多种HAase的组合来切割xHA。在其他实施方案中，使用单一HAase切割xHA。

如本文所用，“透明质酸酶”是指切割在N-乙酰基葡萄糖胺与葡糖醛酸酯之间的(1->4)-连接(EC 3.2.1.35)或(1->3)-连接(EC 3.2.1.36)以催化HA的降解的透明质酸葡糖苷酶。

存在三大类透明质酸酶：1.哺乳动物型透明质酸酶(EC 3.2.1.35)，其是内切-β-N-乙酰基己糖苷酶，主要的最终产物为四糖和六糖。它们具有水解活性和反式糖苷酶活性，并且可以降解玻尿酸和硫酸软骨素(CS)，特别是C4-S和C6-S；2.细菌透明质酸酶(EC4.2.99.1)，其降解玻尿酸并在不同程度上降解CS和DS。它们是内切-β-N-乙酰基己糖苷酶，其通过主要产生二糖最终产物的β消除反应起作用；以及3.来自蛭类、其他寄生生物和甲壳类的透明质酸酶(EC 3.2.1.36)，其是通过β1-3连接的水解产生四糖和六糖最终产物的内切-β-葡糖苷酸酶。

哺乳动物透明质酸酶可以进一步分为两类：中性活性酶和酸性活性酶。人类基因组中有六种透明质酸酶样基因，即HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4、HYALP1和PH20/SPAM1。HYALP1是假基因，并且HYAL3尚未显示出具有针对任何已知底物的酶活性。HYAL4是软骨素酶，并且缺乏针对玻尿酸的活性。HYAL1(也称为LUCA1、MPS9和NAT6)是原型酸-活性酶，并且PH20是原型中性-活性酶。酸性活性透明质酸酶(如HYAL1和HYAL2)在中性pH下缺乏催化活性。例如，HYAL1在超过pH 4.5的体外条件下没有催化活性(Frost等人(1997)Anal.Biochemistry)。HYAL2是在体外具有极低比活性的酸活性酶。

HYAL5是最初在小鼠中发现的HAase，其位于血浆中以及在顶体反应过程中释放的顶体完整的精子的顶体膜上。HYAL6是也在小鼠中发现的HAase。

化学级HAase可以商购自供应商，如Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)、Millipore Sigma(马萨诸塞州伯灵顿)和Calzyme Laboratories(加利福尼亚州圣路易斯奥比斯波)。FDA批准的HAase包括但不限于：Amphadase(牛透明质酸酶；新药申请(NDA)号021665；Amphastar Pharmaceuticals)、Hydase(牛透明质酸酶；NDA号021716；AkornInc.)、Hylenex(重组人透明质酸酶；NDA号021859；Halozyme)；Vitrase(绵羊透明质酸酶；NDA号021640；Bausch and Lomb)和Wydase(牛透明质酸酶；NDA号006343；BaxterHealthcare)。

用于本文的其他合适的HAase描述于以下文献中：万维网(worldwide web)网站：brenda-enzymes.org/enzyme.php？ecno＝3.2.1.35；Karl Meyer和Maurice M.Rapport’schapter on“Hyaluronidases”Advances in Enzymology-and Related Areas ofMolecular Biology第199-236页第13卷(doi.org/10.1002/9780470122587.ch6)；Stern和Jedrzejas Chem.Rev.2006,106,818-839Hyaluronidases:Their Genomics,Structures,and Mechanisms of Action；Stern and Jedrzejas,Chem.Rev.2008,108,5061–5085；Yoshida等人(2013)“KIAA1199,A deafness gene of unknown function,is a newhyaluronan binding protein involved in hyaluronan depolymerization.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.110,5612–5617；Nagaoka等人2015Regulation of Hyaluronan(HA)Metabolism Mediated by HYBID,doi:10.1074/jbc.M115.673566，最初于2015年10月30日在线发表；Yoshino等人2018Biochemical and Biophysical Research Communications第505卷,第1期,2018年10月20日；Yamaguchi等人2019(Matrix Biol.(2019)78-79,139–146TMEM2:A missing link in hyaluronan catabolism identified？；上述文献中的每一篇通过引用以其整体并入本文用于所有目的。

“透明质酸酶裂解酶”、“透明质酸裂解酶”、“HA裂解酶”、“EC 4.2.2.1”或“HA裂解酶4.2.2.1”是指在β-D-GalNAc-(1->4)-β-D-GlcA键处切割玻尿酸链，最终将多糖消化成3-(4-脱氧-β-D-葡糖-4-烯醛酸基)-N-乙酰基-D-葡萄糖胺的透明质酸葡糖苷酶(即细菌碳-氧裂解酶)。透明质酸裂解酶可以从细菌和链霉菌属(Streptomyces)分离，并且通过其作用方式与其他来源的透明质酸酶区分开来，因为它们催化N-乙酰基-β-D-葡萄糖胺与D-葡糖醛酸残基之间的β1,4-糖苷连接的消除反应而不是水解。

在其他实施方案中，本文描述的方法利用一种或多种蛋白水解酶(例如，通过经由水解来切割肽键以催化蛋白水解的酶)来切割肽，例如，切割xHA-L-P中存在的P以形成oHA-L-P。合适的蛋白酶包括但不限于：丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬酰胺肽裂解酶等。通过其在其中具有活性的最佳pH进行分类的合适的蛋白酶包括但不限于：酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。在某些示例性实施方案中，使用两种、三种、四种、五种或更多种蛋白水解酶的组合来切割肽。在其他实施方案中，使用单一蛋白水解酶切割肽。

在某些实施方案中，本文描述的方法利用一种或多种酶和/或化合物来切割作为游离药物或前药(例如，作为游离SAR425899或作为SAR425899前药)存在的肽药物，以产生所述药物或前药的肽消化产物。

在某些实施方案中，本文描述的方法利用一种或多种胞内蛋白酶来切割作为游离药物或前药(例如，作为游离SAR425899或作为SAR425899前药)存在的肽药物，以产生所述药物或前药的肽消化产物。用于选择适当的胞内蛋白酶的标准如下：1)产生尽可能少的高特异性片段；2)产生不含有与赖氨酸连接的谷氨酸盐-棕榈酸盐的C末端片段；以及3)使用常见的可商购的酶。

适当的胞内蛋白酶包括但不限于Glu-C、Asp-N、Lys-C、Arg-C、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。在某些示例性实施方案中，在本文描述的方法中使用胞内蛋白酶Asp-N。各种合适的胞内蛋白酶可以商购自公司，如Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)、New EnglandBiolabs(马萨诸塞州伊普斯威奇)、Thermo Scientific(堪萨斯州莱内克萨)和Promega(威斯康星州菲奇堡)。

在某些实施方案中，压力循环仪可以用于改善(例如，缩短)xHA和/或oHA消化时间。在某些实施方案中，xHA和/或oHA消化可以在压力循环仪中在约5KPSI与约80KPSI之间的范围内的循环压力下(例如，在约5KPSI、约10KPSI、约15KPSI、约20KPSI、约25KPSI、约30KPSI、约35KPSI、约40KPSI、约45KPSI、约50KPSI、约55KPSI、约60KPSI、约65KPSI、约70KPSI、约75KPSI或约80KPSI下)进行。

在某些实施方案中，压力循环仪与一种或多种透明质酸葡糖苷酶(例如，HAase)一起使用，以在低于约50KPSI、低于约40KPSI、低于约30KPSI或低于约20KPSI的压力下消化xHA。在某些实施方案中，压力循环仪与一种或多种透明质酸葡糖苷酶(例如，HAase)一起使用，以在约5KPSI、约10KPSI或约15KPSI的压力下消化xHA。在某些实施方案中，压力循环仪与一种或多种透明质酸葡糖苷酶(例如，HAase)一起使用，以在约10KPSI的压力下消化xHA。

在某些实施方案中，压力循环仪与一种或多种酶(例如，胞内蛋白酶、蛋白水解酶、Glu-C、Asp-N、Lys-C、Arg-C、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)一起使用，以在低于约80KPSI、低于约70KPSI、低于约60KPSI或低于约500KPSI的压力下消化肽。在某些实施方案中、压力循环仪与一种或多种酶(例如，胞内蛋白酶、蛋白水解酶、Glu-C、Asp-N、Lys-C、Arg-C、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)一起使用，以在约35KPSI、约40KPSI或约45KPSI的压力下消化肽。在某些实施方案中、压力循环仪与一种或多种酶(例如、胞内蛋白酶、蛋白水解酶、Glu-C、Asp-N、Lys-C、Arg-C、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)一起使用，以在约40KPSI的压力下消化肽。

在某些实施方案中，与非加压条件下的消化相比，压力循环仪将肽、xHA和/或oHA消化时间缩短了至少约一小时、约两小时、约三小时、约四小时、约五小时、约六小时、约七小时、约八小时、约九小时、约十小时、约十一小时、约十二小时、约十三小时、约十四小时、约十五小时、约十六小时、约十七小时、约十八小时、约十九小时、约二十小时、约二十一小时、约二十二小时、约二十三小时、约二十四小时或更长时间。

如本文所用，“肽消化产物”是指由酶产生的且小于完整肽药物的肽药物(例如，游离药物或前药)的任何部分(part)或部分(portion)。在某些示例性实施方案中，肽消化产物的长度小于50个氨基酸，例如长度在约2个与约100个氨基酸之间、长度在约3个与约75个氨基酸之间、长度在约2个与约50个氨基酸之间、长度在约4个与约50个氨基酸之间、长度在约5个与约40个氨基酸之间、长度在约6个与约30个氨基酸之间、或长度在约15个与约20个氨基酸之间或这些范围内任何值或子范围。在某些示例性实施方案中，肽消化产物的长度为约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约11个、约12个、约13个、约14个、约15个、约16个、约17个、约18个、约19个、约20个、约21个、约22个、约23个、约24个、约25个、约26个、约27个、约28个、约29个、约30个、约31个、约32个、约33个、约34个、约35个、约36个、约37个、约38个、约39个、约40个、约41个、约42个、约43个、约44个、约45个、约46个、约47个、约48个、约49个、约50个、约51个、约52个、约53个、约54个、约55个、约56个、约57个、约58个、约59个、约60个、约61个、约61个、约63个、约64个、约65个、约66个、约67个、约68个、约69个、约70个、约71个、约72个、约73个、约74个、约75个、约76个、约77个、约78个、约79个、约80个、约81个、约82个、约83个、约84个、约85个、约86个、约87个、约88个、约89个、约90个、约91个、约92个、约93个、约94个、约95个、约96个、约97个、约98个、约99个或约100个氨基酸。

在特定实施方案中，肽消化产物的长度为约19个氨基酸。在其他特定实施方案中，肽消化产物的长度为约1个、约2个或约3个氨基酸。在又一些特定实施方案中，肽消化产物的长度在约4个与约50个氨基酸之间。在又一些特定实施方案中，肽消化产物的长度在约15个与约20个氨基酸之间。

在某些示例性实施方案中，使用以下肽鉴定方法检测肽消化产物：如液相色谱-质谱法(LC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS-MS)、液相色谱-高分辨率质谱法(LC-HRMS)、纳米LC-MS-MS、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS-MS)、纳米HPLC-MS-MS、超高效串联MS(UPLC-MS-MS)、纳米UPLC-MS-MS、超高效串联MS(UHPLC-MS-MS)、纳米UHPLC-MS-MS、紫外(UV)光谱法、荧光光谱法等。

在某些示例性实施方案中，本文描述的方法利用分离过程，如色谱法(例如，液相色谱法)。根据实施方案，检测肽消化产物是通过以下方式进行：(i)高效液相色谱法(“HPLC”)，(ii)阴离子交换，(iii)阴离子交换色谱法；(iv)阳离子交换；(v)阳离子交换色谱法；(vi)离子对反相色谱法；(vii)色谱法；(viii)单向电泳；(ix)多向电泳；(x)尺寸排阻；(xi)亲和力；(xii)反相色谱法；(xiii)毛细管电泳色谱法(“CEC”)；(xiv)电泳；(xv)离子迁移率分离；(xvi)场非对称离子迁移率分离或光谱法(“FAIMS”)；(xvii)毛细管电泳；和(xviii)超临界流体色谱法。

肽消化产物的量可以通过测量由肽前体离子、一个或多个片段离子和保留时间组成的多反应监测(MRM)跃迁来确定。该测量是例如在三重四极杆仪器上进行的。还可以通过完整肽的保留时间和精确的高分辨率质谱分析相结合来获得签名(signature)。这些量化方法典型地需要标记内标物和外部合成肽校准曲线。

在某些示例性实施方案中，使用的内标物包括与肽药物相对应的标记肽，例如与SAR425899的C末端Asp-N消化产物相对应的标记C末端肽。内标物典型地具有已知的肽序列并且以已知的量提供。在一些实施方案中，将标准物用一种或多种重同位素(例如，¹³C或¹⁵N)标记。

本文描述的肽消化产物分析(profiling)法可用于测量水凝胶前药配制品中存在的药物的量。本文描述的方法还可用于进行批次间重现性评估。

如本文所用，“样品”是指含有肽药物(例如，以前药形式)的任何组合物。示例性样品包括但不限于药物组合物、溶解或释放介质等。在某些实施方案中，样品是水凝胶。在其他实施方案中，样品是水性的。

用于本文描述的量化方法的样品可以是治疗组合物，如用于口服、舌下、粘膜、皮内、皮下、静脉内、肌肉内、肠胃外或通过吸入给予的液体配制品。

在其他实施方案中，样品将包括底物，如纳米颗粒、胶囊、薄膜或片剂、或凝胶(如水凝胶，例如，xHA水凝胶)。本文描述的量化方法可用于量化底物中(如，例如纳米颗粒或胶囊中、或薄膜或水凝胶(例如xHA水凝胶)中)的肽药物的量。释放可以是来自底物(例如，xHA水凝胶)内部，或从底物外部(例如，表面)。在一实施方案中，通过如下方式测定释放曲线(profile)：进行肽药物的完全释放，然后如在一段时间内或在不同的培养物或溶液条件下(例如，在不同的温度、pH等下)测定控制释放。在控制释放测定中释放的肽药物的量典型地以与在完全释放条件下释放的肽药物的量相比的分数或百分比来报告。

如本文所用，“一种溶解介质”、“多种溶解介质”、“一种释放介质”和“多种释放介质”是指用于提供体外药物释放信息的组合物。溶解或释放介质可用于例如样品的质量控制测试，以确定样品中肽药物的释放和/或稳定性。在选择合适的溶解或释放介质时，确定肽药物的分析目标特征(例如，延迟释放、恒定释放、延长释放等)和/或肽药物溶解度特征是有用的。有关溶解介质选择的综述，请参见Martin和Gray(2011年夏季，Journal ofValidation Technology)。

如本文所用，“释放速率”是指在体外释放测试中肽药物从水凝胶前药配制品流入周围介质的速率。在一个示例性实施方案中，首先通过将组合物悬浮在适当的体外释放介质中来制备用于释放测试的组合物。这一般通过以下方式进行：在离心以使底物(例如，水凝胶)沉淀后更换缓冲液，并在温和的条件下重构底物。在某些实施方案中，通过在适当的温控型设备中在37℃下使样品悬浮来开始测定。典型地，在各个时间点移取样品。

本领域技术人员将易于明了，本文所述方法的其他适宜修饰和适应可在不背离本文所公开实施方案的范围的情况下使用适宜等效方式来进行。虽然现已详细描述某些实施方案，但参照以下实施例将更清楚地理解所述实施方案，所述实施例仅出于说明目的而被包括，并且不打算具有限制性。

实施例I

前药配制品中存在的肽药物的量化

SAR425899是靶向胰高血糖素和GLP1受体的双重受体激动剂。由于快速清除，因此需要每天一次剂量。为了降低给药频率，将每天一次SAR425899候选肽药物(图1)经由自切割接头与聚合物载体(交联透明质酸(xHA))结合，以提供活性肽药物从非活性前药的缓慢释放(图2)。SAR425899前药包含经由自切割接头(L)与SAR425899脂肽(P)结合的交联透明质酸(xHA)。

需要确定水凝胶的肽负载量以用于给药和质量控制。交联透明质酸在水性环境中形成数百万道尔顿的水凝胶。典型地用于溶液中肽的基本量化的简单UV测量不能用于水凝胶，因为这种分析要求水凝胶-接头-肽完全溶解。虽然接头是自切割的，但是通过设计在生理条件下的完全切割是非常缓慢的，因此不适用于需要确定已实现完全释放的分析量化方法。

为了解决这一分析挑战并使得能够确定肽负载量，开发了一种允许将生物聚合物前药中测量为重量/重量百分比的肽药物负载量的新型方法。原则上，可以将生物聚合物-接头-肽药物应用于可以被切割或水解的任何小分子(例如，多肽、多核苷酸等)药物，并且所述方法可以广泛地应用于确定含有生物聚合物的前药的药物负载量。

所述方法基于双重酶促消化，接着对代表肽的消化产物进行量化。首先，将交联透明质酸-接头-肽(xHA-L-P)用消化交联透明质酸的酶进行消化。随后施用蛋白水解酶以消化附着的肽并产生蛋白水解消化产物。随后对这些代表肽的蛋白水解消化产物进行量化。

将xHA-L-P称重并作为水凝胶部分地溶解在缓冲液中。将所述水凝胶酶促地降解为可溶性的多个低聚透明质酸-接头-肽(oHA-L-P)。所得oHA-L-P的透明质酸低聚物是异质混合物，由肽、接头和不同长度的透明质酸低聚物组成。低聚透明质酸异质性对于量化是不期望的，并且为此引入了第二酶促(例如，蛋白水解)消化步骤，其中肽药物部分被消化以产生均质的19个氨基酸的C末端肽消化产物DFIE…PPPS-NH₂(图3)。该C末端肽使用LC/HRMS检测并量化。

在没有先前的透明质酸葡糖苷酶处理的情况下使用Asp-N消化前药产生了低产率的C末端肽，据推测这是由于交联透明质酸对Asp-N活性的空间位阻所致(图5)。经确定，接头的水解作为用于量化的肽释放方法是不切实际的。

开发了HA消化方法。(图6。)使用适于后续胞内蛋白酶(例如，Asp-N)消化的消化条件。测试了能够消化HA的几种酶(例如，HAase)。

交联透明质酸的消化不干扰游离SAR425899的Asp-N消化(图7A-图7F)，并且被证明显著提高后续Asp-N消化C末端肽消化产物的产率(图8A-图8B)。实际上，已确定Asp-N蛋白水解酶对SAR425899肽的消化效率接近100％。

Asp-N已被证明在缓冲液中且在存在HA消化产物的情况下完全消化SAR 425899(图4)。通过HAase对HA-接头-肽一式三份地进行消化，接着用Asp-N进行消化，并猝灭。后续水解在37℃下进行24小时以释放任何结合的完整肽，并在LC/MS分析之前添加内标物(IS)。释放的完整肽与C末端肽的比率为0.0006。

用HAase对HA-接头-肽一式三份地进行双重消化，持续2x24小时，接着用Asp-N进行消化，并猝灭。后续水解在37℃下进行24小时以释放任何结合的完整肽，并在LC/MS分析之前添加IS。没有观察到完整肽。

用HAase对HA-接头-肽一式三份地进行消化，持续14天，接着用Asp-N进行消化。与消化1天相比，没有观察到C末端肽增加，但是观察到C末端肽异构体比常规C末端肽稍早洗脱。

反应产物的LC/MS如下进行。在25％乙腈(ACN)、0.1％甲酸(FA)中制备样品和标准物，以防止观察到的吸附问题。分离是在50℃下在配备有Luna Omega C18柱100x2.1mm，100A(零件号OOD-4742-AN)(S/N H16-168886)的Accela 1250 LC系统上进行。

流动相A：0.1％甲酸水溶液流动相；流动相B：ACN 0.1％甲酸；流速为400μL/min。梯度：7分钟内5％至50％，99％B保持30sec，5％B下平衡2.5min。还应用了以20％B开始的梯度并且这是可行的。

使用在阳离子模式下运行的标准HESI ESI源将洗脱液引入Orbitrap ELITE中。应用[email protected]/z 400的Orbitrap分辨率，m/z范围为350-1500。

已确定所有肽均被转化为消化产物，没有完整肽残留。

表1.用HAase-1消化xHA，添加C末端肽(对应于Asp-N消化产物)，通过LC/MS进行分析(实验编号1)；用HAase-1消化xHA，添加全长肽，用Asp-N消化，通过LC/MS进行分析(实验编号2)；用HAase-2消化xHA，添加对应于Asp-N消化物的C末端肽，通过LC/MS进行分析(实验编号3)；用HAase-2消化xHA，添加全长肽，用Asp-N消化，通过LC/MS进行分析(实验编号4)；对照：添加全长肽，用Asp-N消化，通过LC/MS进行分析(实验编号5)；用HAase-1消化xHA-接头-肽，然后用Asp-N消化，通过LC/MS进行分析(实验编号6)；用HAase-2消化xHA-接头-肽，然后用Asp-N消化，通过LC/MS进行分析(实验编号7)。

以多种方式证明了在连续的双重消化后C末端肽的高产率。(图10。)允许进行双重消化，接着通过煮沸猝灭所有酶促活性。随后，通过使水解在37℃下进行，释放可能仍经由接头附着至透明质酸的任何完整肽。没有观察到完整肽或观察到极少量的完整肽，这指示双重消化导致所有肽药物分子几乎被完全消化。在单独的实验中，通过经2周的水解接着Asp-N消化进行的释放没有比双重消化程序产生更高量的C末端肽。作为方法评定的一部分，经分析显示，所获得的xHA-L-P批次具有18％的肽负载量，这与显示大约20％负载量的若干个批次获得的结果一致(不希望受到科学理论的束缚，20％的较低量归因于冻干材料的水吸收)。当冻干的水凝胶吸收水时，由于增加了水，加重的所得量含有较低百分比的肽。这可以使肽的百分比从20％降到18％。补救措施是要注意不要将加重的材料暴露于潮湿的空气条件下。

将不含肽的交联HA消化并作为基质使用。向消化产物(基质)掺加对应于SAR425899的C末端Asp-N肽消化产物的合成的未标记C末端肽，并产生一系列稀释物。将重同位素标记的C末端肽用作内标物。将曲线与在25％ACN和0.1％甲酸缓冲液中绘制的等效曲线进行比较。

通过LC/MS分析对曲线进行分析，以确定斜率是否在彼此的15％之内，这是接受缓冲液校准曲线的最低标准。

使用本文描述的方法进行的肽量化是可重现的。将三份HA-接头肽的等分试样称重，并用HAase和Asp-N消化。将消化产物的ACN调整到25％，然后进一步稀释100倍，接着通过添加重内标物(H-IS)进行另外的2倍稀释。使用2倍稀释步骤绘制从10μg/mL到20ng/mL的10点标准曲线。通过以1:1体积:体积添加H-IS将曲线进一步稀释2倍。

所述方法对基质有着强大的容忍度。(图7A-图7F)缓冲液中的C末端肽校准曲线显示出与通过消化交联透明质酸(xHA)产生的提取基质中的校准曲线相同的斜率。(图9A、图9B、图11A、图11B、图12A、12B、图13A和图13B。)还确定了通过消化xHA产生的基质会干扰Asp-N消化效率。

测试了几种商用透明质酸酶，并确定HAase 2是较优的。此外证明了当进行气相碰撞诱导的片段化(CID)时，C末端肽产生了几乎完整的片段系列，并且这些片段显示出这样的强度，所述强度适于将多反应监测量化方法MRM(LC/MS MRM)开发为在初始工作中应用的基于高分辨率质谱法的方法(通过LC/HRMS进行量化)的替代方法。

UV或荧光检测的先决条件是分析物是可溶性的。xHA-L-P是不可溶的。另一方面，oHA-L-P是水溶性的，并且因此可用于UV或荧光分析。然而，从xHA-L-P产生oHA-L-P所需的消化确实将透明质酸葡糖苷酶(例如，透明质酸酶或HA裂解酶)引入到混合物中。透明质酸葡糖苷酶(例如，透明质酸酶或HA裂解酶)是本身吸收UV的蛋白质。因此，透明质酸葡糖苷酶将在第一消化步骤之后被去除，接着直接进行UV检测。此方法将更适于受监管的分析开发/制造环境。

确定了三个单独批次的xHA-L-P(其中P为SAR425899)的载肽量(图14)。获得极好的线性，没有基质效应。整个过程的重复实验具有良好的重现性，并且结果与使用正交NMR获得的结果一致。本文描述的方法是广泛适用的并且正在应用于辅助配制品优化。本文描述的方法适用于使用广泛范围的聚合物和肽药物的可切割和不可切割接头的情况。

总结

开发了用于分析HA-接头-SAR425899、SAR425899和片段/消化产物的LC/MS方法。证明了用Asp-N完全切割SAR425899来释放C末端肽片段以供量化。证明了首先通过Asp-N切割HA-接头-SAR425899，但基于适度的LC/MS响应，所述消化很可能不完全。

测试了若干种HAase，并且HA裂解酶(Sigma-Aldrich)EC 4.2.2.1证明Asp-N消化产物的产率显著提高。引入同位素标记的C末端肽，并在解决了粘附问题后证明了线性范围。进行了评价消化效率的实验。基质曲线检查显示无基质效应，并且基质曲线与缓冲液曲线对齐良好，斜率差异仅为3％。一式三份的称重、处理和分析显示出良好的重现性，CV为7.5％。

发现样品批次中的总肽百分比为18％(样品的含水量是未知的，特别是在多次冻融(室温)循环后)。

实施例II

用于量化前药配制品中存在的肽药物的压力循环仪

使用新型压力循环仪过程经由前药的水合和变性来确定SAR425899前药中负载的药物量。消化反应用AspN对SAR425899消化进行测试(在一小时内达到100％反应)。鉴定条件从而允许使用压力循环仪将xHA消化时间从24小时缩短到2小时。

HAase显现出对极高压是敏感的。因此，施加10KPSI的最大压力并使用更高的酶浓度。在优化的条件下，对于压力循环仪辅助的2小时消化，观察到更高的oHA-L-P产物浓度。

同时测定16个样品(50-150μL/样品)。控制压力增加/减少的速率。观察到压力分布图的形状(正弦/方波等)。使用内置电加热器控制样品温度。使用的最大压力为40KPSI。典型的测定是从大气压到10-40KPSI施加1Hz循环，持续时间为一小时。

在37℃下每分钟一次的40KPSI压力循环下oHA-L-P的AspN消化被确定为与在37℃下在大气压下对oHA-L-P进行12小时的AspN消化的有效性一样。所有实验均使用PressureBiosciences Bar Cycler(型号2320EXT，马萨诸塞州南伊斯顿)进行。

已确定，使用在37℃下以1分钟的间隔在40KPSI压力与大气压之间循环1小时进行的AspN消化与在37℃下在大气压下进行12小时的消化效率相同。同样，使用以1分钟循环时间在10KPSI压力之间持续2小时的循环对HAase(E.C.4.2.2.1)进行消化所产生的结果(基于观察到的低聚物)与在37℃下在大气压下进行24小时所产生的结果一样。

通常，每种新酶都在温度和压力、压力分布图、压力施加的频率和持续时间方面进行了优化。

分析了样品纯度和主要杂质的确定(图15)。确定了在温和水解条件下完整肽的释放(4℃，14天；或37℃，24小时)。两种释放方法均产生了足够用于通过LC/MS进行杂质分析的材料，低至0.01％或更低。已证明释放不产生杂质。

在t＝0时和完全释放时分析接头-肽对照。在t＝0时观察到接头-肽的高水平杂质。通过对释放的肽进行LC/MS测定来进行杂质分析。

总体结论

成功地完成并实现了LC/MS方法评定。证明了产生完全AspN消化的消化条件。据显示基质不是问题。证明了所述方法具有良好的重现性和线性。

通过LC/MS获得的结果与通过正交NMR方法获得的结果一致。使用第二代压力循环仪的方法显著缩短了总分析时间。所述方法既可用作参考方法，也可用于辅助配制品优化研究。建立了用于释放和分析杂质的方法，例如，已经建立了释放条件，并且已对杂质进行了检测和鉴定。

等同物

在不脱离本公开文本的精神或本质特征的情况下，本公开文本可以以其他特定形式实施。因此，前述实施方案在所有方面都应被视为是说明性的，而不是对本公开文本进行限制。因此，本公开文本的范围是由所附权利要求而不是由前述描述指示的，并且落入权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化从而都应包含在本文中。