实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法
阅读说明：本技术 实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法 (Method for detecting expression quantity of exogenous GhCAD6 gene in cotton fiber by real-time fluorescence quantitative PCR ) 是由 胡文冉 苏秀娟 李晓荣 周小云 杨洋 李波 范玲 樊国全 刘建喜 邓晓娟 于 2018-06-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种采用实时荧光定量PCR检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中的表达量的方法,首先采用热硼酸-蛋白酶K法提取出棉花纤维的RNA,反转录成cDNA,利用特异性引物和内参基因,在特定的反应条件和反应程序下进行荧光RT-PCR,检测外源GhCAD6基因在不同发育阶段棉纤维中的表达量,该方法自动收集荧光信号,避免了肉眼判断的主观性,提高了实验的灵敏度,保证了结果的可靠性和重复性,免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤,大大缩短了实验时间；本发明中棉花GhCAD6基因实时荧光RT-PCR检测方法的建立,为研究棉花GhCAD6基因表达调控机理及利用其改良棉花纤维品质的研究奠定了基础。(The invention discloses a method for detecting the expression quantity of an exogenous GhCAD6 gene in cotton fibers by adopting real-time fluorescent quantitative PCR, which comprises the steps of firstly extracting RNA of the cotton fibers by adopting a hot boric acid-proteinase K method, carrying out reverse transcription to form cDNA, utilizing specific primers and reference genes, carrying out fluorescent RT-PCR under specific reaction conditions and reaction programs, and detecting the expression quantity of the exogenous GhCAD6 gene in the cotton fibers at different development stages, wherein the method automatically collects fluorescent signals, avoids the subjectivity of naked eye judgment, improves the sensitivity of an experiment, ensures the reliability and repeatability of a result, avoids the subsequent fussy steps of electrophoresis, quantitative scanning and the like in the conventional PCR, and greatly shortens the experiment time; the establishment of the real-time fluorescence RT-PCR detection method of the cotton GhCAD6 gene lays a foundation for researching the expression regulation mechanism of the cotton GhCAD6 gene and the improvement of the quality of cotton fibers by using the cotton GhCAD6 gene.)
一、技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种转基因棉花外源基因表达量的分析方法，具体为一种实时荧光定量PCR技术检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中表达量的方法。
二、背景技术
新中国成立以来，我国棉花(G.hirsutum)产量和品质都得到了大幅度的提高。但还存在着纤维比强度偏低及纤维品质诸指标搭配不合理等问题，难以满足国内外市场和纺织工业的多种需求(唐淑荣等，2015)。新疆作为我国最大的优质棉生产基地也存在着同样的问题，严重影响着我国棉花在国际上的竞争力(许乃银等，2017)。由于缺乏优异种质和亲本材料，所以在常规育种方面棉花纤维品质改良效果并不明显。目前棉花纤维改良的途径已从常规育种转向常规育种与生物技术育种相结合，其中转基因研究是棉纤维品质改良的一个重要方面。
“十一五”期间国家根据农作物生产的实际需求，启动了转基因重大专项。本项目组范玲研究员主持了转基因生物新品种培育重大专项，在项目开展的过程中，应用自主研究成果，根据肉桂酸脱氢酶(Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase，CAD)是植物细胞壁交联结构形成的重要功能基因，从发育的棉花纤维中克隆出调节细胞壁交联结构形成的相关主效基因GhCAD6(GenBank序列号为：EU281305.1)。CAD是苯丙烷代谢途径上一个重要的基因家族，在形成细胞壁交联结构、细胞壁的延伸停止、次生壁发育起始及次生壁的发育中起重要作用。ChCAD6基因是CAD基因家族中重要的功能基因，该基因的表达量与棉花纤维的次生壁发育同步。项目组将ChCAD6基因利用农杆菌介导法转化棉花受体，获得了多个纤维长度较受体增加1.17-3.21mm(4.22-11.58％)，比强度较受体增加3.2-7.1cN/tex(12.26-27.20％)的转基因株系，且转基因株系经过田间多代种植表现稳定遗传。
外源ChCAD6基因转化棉花受体后获得的转基因后代纤维长度和比强度都得到明显改良，但外源ChCAD6基因在转基因后代植株纤维中尤其是在棉纤维次生壁发育过程中的表达情况还缺乏系统研究。因此，为研究外源GhCAD6改良棉花纤维品质的机理，非常有必要通过研究GhCAD6基因在转基因后代棉花纤维次生壁发育过程中的表达量。
基因表达的定量检测方法很多，主要从蛋白表达水平、mRNA表达水平及外源DNA几个方面入手，包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白杂交(Western Blotting)、高效液相色谱(HPLC)、Southern杂交、Northern杂交、生物芯片技术(Biochips)及聚合酶链式反应(PCR)技术、半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)等等。各个检测方法在检测基因表达量时各有其优缺点，其中实时荧光定量PCR技术具有特异性高、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，保证了结果的可靠性和可重复性，已广泛应用于分子生物学和医学等研究领域。但对于棉花纤维富含酚类化合物、多糖和次生代谢产物，内源RNA酶活性高等特点，适宜的棉花纤维RNA提取方法、合适的引物及内参基因是保证实时荧光定量PCR实施的关键，合适的实时荧光定量PCR反应条件也是实验实施必不可少的内容之一。因此，对于外源GhCAD6基因通过农杆菌介导法转入棉花后，还未见有利用实时荧光定量PCR检测其在不同发育阶段棉花纤维中表达量的报道。
三、
发明内容
本发明的目的是提供一种采用实时荧光定量PCR技术检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中的表达量的方法。利用这些特别设计的引物在特定的反应条件下对不同发育阶段的棉花纤维进行实时荧光定量PCR扩增，根据GhCAD6基因的相对表达量可以快速准确判断外源基因对棉花纤维品质形成的影响。
本发明采用的技术方案是：
(1)棉纤维取样：从被检测的棉花样品中，每个处理分别采摘5-25DPA(Day postanthesis)棉铃，去除棉壳，用锡箔纸包好，做好标记，液氮速冻后保存于-80℃冰柜；
(2)棉纤维RNA的提取及cDNA合成：用热硼酸-蛋白酶K法提取不同发育阶段棉花纤维中的RNA，采用反转录试剂盒完成cDNA的合成；
(3)内参基因的选择及内参基因、目标基因相关引物设计：
根据相关文献查找合适的内参基因，在NCBI数据库中查找内参基因和目标基因的序列信息，使用NCBI引物设计工具，Primer-Blast进行设计，并使用相关程序对引物序列进行特异性检验，由上海生物工程公司合成引物。设计合成的引物序列如下：
GhCAD6-F：5’-GTTCCTGGGCATGAAGTGGT-3’
GhCAD6-R：5’-TGCAACATCCAACAAGACAACC-3’
GhUBQ7-F：5’-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3’
GhUBQ7-R：5’-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3’
(4)实时荧光定量PCR检测：以稀释后的棉花纤维cDNA为模板，以GhCAD6-F和GhCAD6-R为引物，选用棉花纤维的GhUBQ7为内参基因，GhUBQ7-F和GhUBQ7-R为内参基因引物，进行荧光定量PCR，得到各自的Ct值(循环阈值)。所有反应包括三次生物学重复。
(5)数据分析：采用excel 2003进行数据整理，用2-ΔΔCt方法计算棉花GhCAD6基因的表达量，在每个样品的每次PCR反应中均重复三次，取三次重复的平均值为棉纤维GhCAD6基因的最终表达量，所述2-ΔΔCt为棉花纤维GhCAD6基因的相对表达量，其中ΔΔCt＝ΔCt(转GhCAD6基因后代样品)-ΔCt(相同发育阶段对照样品)，ΔCt＝GhCAD6(mean Ct)-GhUBQT(相同发育阶段mean Ct)。采用DPS7.05进行数据统计分析，GraphPad Prism 5软件进行作图。
本发明的一种采用实时荧光定量检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中的表达量的方法，其荧光定量PCR的反应体系为：总体积为20μL，内含Select Master Mix(2X)10μL，Forward primer(10μM)0.40μL，Reverse primer(10μM)0.40μL，cDNA 1μL，RNase-free水补足到20μL。
本发明的一种采用实时荧光定量检测外源GhCAD6基因在棉花纤维中的表达量的方法，其荧光定量PCR的反应条件为：UDG Activation AmpliTaq DNA，50℃，2min；Polymerase，UP Activation，95℃，2min；PCR反应40cycles，95℃，15sec，60℃，1min。
该技术实施的技术关键：本发明针对棉花纤维富含酚类化合物、多糖和次生代谢产物，内源RNA酶活性高等特点，采用热硼酸-蛋白酶K法提取棉花纤维中的RNA，保证了所得的棉花纤维RNA提取的完整和纯度；目标基因GhCAD6和合适的内参基因的引物的选择及设计；合适的实时荧光PCR扩增体系和实时荧光PCR扩增参数的设置，这些条件都是需要大量的创造性实验，而不是通过简简单单的技术组合就能实现的。
该技术具有以下优点：(1)自动收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，提高了实验的灵敏度，保证了结果的可靠性和重复性；(2)免除了常规PCR中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间；(3)操作简单，具有很强的推广性。
四、附图、表说明
图1是新陆早36号及其转GhCAD6基因高代材料纤维RNA电泳图。
图2是新陆早36号转GhCAD6基因高代材料纤维GhCAD6基因扩增曲线图。
图3是新陆早36号转GhCAD6基因高代材料纤维GhCAD6基因熔解曲线图。
图4是内参基因GhUBQ7扩增曲线图。
图5是内参基因GhUBQ7熔解曲线图。
图6是新陆早36号纤维不同发育阶段GhCAD6基因的相对表达量。图中Δ表示与5d相比达到显著差异(P＜0.05)；▲表示与10d相比达到显著差异(P＜0.05)；表示与15d相比达到极显著差异(P＜0.01)；表示与20d相比达到显著差异(P＜0.05)。
图7是新陆早36号转GhCAD6基因高代材料纤维不同发育阶段GhCAD6基因的相对表达量。图中Δ表示与5d相比达到显著差异(P＜0.05)；▲表示与10d相比达到显著差异(P＜0.05)；表示与15d相比达到极显著差异(P＜0.01)；表示与20d相比达到显著差异(P＜0.05)。
图8是新陆早36号和新陆早36号转GhCAD6基因高代材料纤维不同发育阶段GhCAD6基因的相对表达量比较。图中**表示相同发育阶段棉纤维中GhCAD6基因表达量达到极显著差异(P＜0.01)。
五、
具体实施方式
仪器、试剂及溶液：
Thermo mixer混合器；GL-88B漩涡混合器；Neofuge 15R台式高速冷冻离心机；K5500核酸蛋白定量仪；DYCP-31DN水平电泳仪；Tanon2500凝胶成像系统；移液器；Bio-Rad梯度PCR仪；ABI Real Time PCR仪；DKZ系列电热恒温水槽；美菱-86℃ DW-HL398S超低温冰箱。
焦炭酸二乙酯(DEPC)、十水四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)、LEGTA、SDS、二硫苏糖醇(DTT)、脱氧胆酸钠、PVP40、乙基苯基聚乙二醇(NP-40)、蛋白酶K、氯化钾(KCl)、氯化锂(LiCl)、Tris-HCl、醋酸钾(KAc)、无水乙醇、异丙醇、琼脂糖、TRUEscript第一链cDNA反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(Roche)、核酸染料(Gold view)及常规PCR试剂等，所有试剂均为国产或进口分析纯。
0.1％(V/V)焦炭酸二乙酯(DEPC)水溶液：将800μL DEPC溶解于800mL蒸馏水中，摇匀，静置过夜。121℃湿热灭菌30min，备用。用于配置提取RNA相关溶液。
RNA提取液：0.2mol/L十水四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)、0.03mol/LEGTA、0.1％(W/V)SDS、0.01mol/L二硫苏糖醇(DTT)、1％(W/V)脱氧胆酸钠、2％(W/V)PVP40、0.5％(V/V)乙基苯基聚乙二醇(NP-40)。先将前三种溶液按照要求称量溶解，105℃湿热灭菌20min。待溶液冷却至40℃左右时，加入DTT。每次使用前根据需要添加不同质量的脱氧胆酸钠、PVP40和NP-40。
20mg/mL蛋白酶K：称取适量蛋白酶K，用DEPC水溶解，配制成20mg/mL蛋白酶K溶液。用无RNase的1.5mL离心管分装，每管200μL，-20℃贮存。
1.6mol/L氯化钾(KCl)、4mol/L氯化锂(LiCl)、2mol/L氯化锂(LiCl)、10mg/LTris-HCl(pH7.5)、2mol/L醋酸钾(KAc，pH5.5)，70％(V/V)乙醇，以上试剂全部用0.1％(V/V)DEPC水配置。
实验材料：
新陆早36号及其转GhCAD6基因的高代材料(第6代材料)。
1.RNA的提取及质量检测
采用热硼酸-蛋白酶K法提取不同发育阶段棉纤维中的RNA，具体步骤如下：
(1)在棉花开花盛花期，采用不同颜色毛线标记棉花花柄，记录时间，分别于5DPA时采摘棉铃20-30个、10DPA 20-25个、15DPA 15-20个、20DPA 10-15个、25DPA 5-10个，去除棉壳，用锡箔纸包好，每包中1-2个棉铃，做好标记，将包裹棉铃的锡箔纸迅速投入液氮中速冻，-80℃冰柜中保存备用；
(2)样品研磨：同一发育天数样品，取5-8个棉铃，每个棉铃中各随机取1瓣棉瓣，混合放置于研钵中，液氮条件下研磨成粉末后置于无RNase离心管中；
(3)向管中加1mL预热至80℃的RNA提取液，剧烈震荡2min；
(4)向各离心管中分别加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀后在Thermo mixer中42℃以800rpm的转速孵育1.5h；
(5)再向离心管中分别加入50μL 1.6mol/L的KCl，冰浴1h；
(6)4℃，12,000rpm离心20min，取上清移入新的无RNase离心管；
(7)加入等体积4mol/L的LiCl，-80℃过夜；
(8)4℃，12,000rpm离心20min，保留沉淀；
(9)用0.5mL 2mol/L的LiCl洗沉淀3次，每次混匀后12,000rpm离心20min，弃上清；
(10)沉淀重悬于0.2mL 10mmol/L的Tris-HCl(pH 7.5)中，4℃，12,000rpm离心20min，取上清移入新的无RNase离心管；
(11)上清中加入40μL 2mol/L的KAc(pH 5.5)，冰浴15min；
(12)4℃，12,000rpm离心20min，取上清移入新的无RNase离心管；
(13)每管内分别加入1mL无水乙醇，混匀后，-80℃过夜；
(14)4℃，12,000rpm离心20min，取沉淀；
(15)用0.5mL预冷的70％乙醇清洗沉淀两次；
(16)自然风干沉淀，用20μL的DEPC-ddH2O溶解，取1μL在紫外分光光度计260nm和280nm处吸收值检测RNA浓度和纯度，另取1μL利用1％琼脂糖凝胶电泳进一步检测有无DNA污染，其余的RNA于-80℃保存；
2.反转录实验步骤
按照下列反应体系配制：
将上述溶液置于无RNase的PCR反应管内，轻轻混匀；25℃ 10min，42℃ 30min，85℃ 5s取出，结束反转录实验；将反转录得到的cDNA置于-20℃保存，用于后续实验。
3.Real-Time PCR
荧光定量PCR反应体系如下表：
ABI7500荧光定量PCR循环条件：
4.统计分析
采用excel2003进行数据整理，用2-ΔΔCt方法计算棉花GhCAD6基因的表达量，在每个样品的每次PCR反应中均重复三次，取三次重复的平均值为棉纤维GhCAD6基因的最终表达量，所述2-ΔΔCt为棉花纤维GhCAD6基因的相对表达量，其中ΔΔCt＝ΔCt(转GhCAD6基因后代样品)-ΔCt(相同发育阶段对照样品)，ΔCt＝GhCAD6(mean Ct)-GhUBQT(相同发育阶段mean Ct)。采用DPS7.05进行数据统计分析，GraphPad Prism 5软件进行作图，所有数据以均数±标准差表示(x±s)，两组均数比较用独立样本T检验分析，多组均数比较用单因素方差分析方法，P＜0.05有统计学意义。