用于核酸测定的新型荧光淬灭探针
阅读说明：本技术 用于核酸测定的新型荧光淬灭探针 (Novel fluorescence quenching probe for nucleic acid determination ) 是由 蔵田信也 高田克巳 于 2018-05-17 设计创作，主要内容包括：提供一种荧光标记成本更低廉的QProbe。经荧光染料标记的核酸探针与靶核酸杂交时,使上述荧光染料的发光减少。在该探针中,其5′末端部位通过下述ssH氨基接头被荧光染料标记,或其3′末端部位通过下述CA氨基接头被荧光染料标记。该探针的碱基序列被设计为使得当该核酸探针与靶核酸杂交时,在该末端部中,在该探针与靶核酸杂交的末端碱基相距1至3个碱基的靶核酸的碱基序列中至少存在一个碱基以上的G(鸟嘌呤)。<Image he="176" wi="700" file="DDA0002279091610000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>ssH氨基接头<Image he="159" wi="700" file="DDA0002279091610000012.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>CA氨基接头。(Provides a QProbe with lower fluorescence labeling cost. When a nucleic acid probe labeled with a fluorescent dye is hybridized with a target nucleic acid, the fluorescence of the fluorescent dye is reduced. In this probe, the 5 '-end portion thereof is labeled with a fluorescent dye via the ssH amino linker described below, or the 3' -end portion thereof is labeled with a fluorescent dye via the CA amino linker described below. The base sequence of the probe is designed such that when the nucleic acid probe is hybridized with the target nucleic acid, at least one or more bases of G (guanine) are present in the base sequence of the target nucleic acid at a distance of 1 to 3 bases from the terminal base to which the probe is hybridized, in the terminal portion. ssH amino linker A CA amino linker.)
技术领域
本发明涉及一种使用利用荧光染料标记的核酸探针，通过在均一溶液系统中由上述核酸探针与靶基因的杂交引起的荧光特性变化，而对靶基因进行定性、定量分析的基因分析技术。
背景技术
使用了在均一溶液系统中通过与靶核酸的杂交而荧光特性(荧光强度、荧光光谱等)发生变化的核酸探针(以下称为均一溶液系统探针)的基因分析方法被广泛普及。作为上述均一溶液系统探针，TaqMan探针(非专利文献1)、分子信标(Molecular beacons，非专利文献2)、QProbe(非专利文献3)等被广泛使用。其中，QProbe是基于由荧光染料和鸟嘌呤碱基之间的电子转移引起的荧光淬灭现象(非专利文献4)的均一溶液系统探针，通过与靶核酸杂交而荧光淬灭。通过监测该荧光淬灭，可以实现检测靶核酸。此外，由于QProbe通过与靶核酸中的鸟嘌呤相互作用来淬灭荧光，因此与探针标记的色素仅为一种，与其他探针相比具有非常简单的结构。因此，QProbe具有制造成本低廉的优点。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Detection of specific polymerase chain reaction productby utilizing the 5′----3′exonuclease activity of Thermus aquaticus DNApolymerase.，Holland PM，Abramson RD，Watson R，Gelfand DH.，Proc Natl Acad Sci US A.，1991 Aug 15；88(16)：7276-80.
非专利文献2：Molecular beacons：probes that fluoresce uponhybridization.，Tyagi S，Kramer FR.，Nat Biotechnol.，1996 Mar；14(3)：303-8.
非专利文献3：Fluorescent quenching-based quantitative detection ofspecific DNA/RNA using a BODIPY((R))FL-labeled probe or primer.，Kurata S，Kanagawa T，Yamada K，Torimura M，Yokomaku T，Kamagata Y，Kurane R.，Nucleic AcidsRes.，2001 Mar 15；29(6)：E34.
非专利文献4：Fluorescence-quenching phenomenon by photoinducedelectron transfer between a fluorescent dye and a nucleotide base.，TorimuraM，Kurata S，Yamada K，Yokomaku T，Kamagata Y，Kanagawa T，Kurane R.，Anal Sci.，2001Jan；17(1)：155-60.
发明内容
发明要解决的问题
当使探针的末端碱基为胞嘧啶并且将该碱基用具有通过与鸟嘌呤相互作用而淬灭荧光的特性的荧光染料标记的情况下，上述淬灭现象被最为明显地观察到(非专利文献3)。因此在许多情况下，QProbe被构成为末端的胞嘧啶碱基被荧光标记的结构。在对QProbe的末端碱基进行荧光标记的情况下，通过如下方法实施：首先将胞嘧啶末端(在末端的胞嘧啶碱基位于5′末端侧的情况下，为5′末端的磷酸基；在末端的胞嘧啶碱基位于3′末端侧的情况下，为3′-末端的磷酸基)合成利用具有氨基的接头(以下称为氨基接头，aminolinker)标记的寡DNA，然后将荧光染料标记于氨基接头的氨基。像这样通过氨基来进行荧光标记时使用的荧光染料通常使用具有与氨基的反应性高的官能团如琥珀酰亚胺基酯(succinimidyl ester)、磺基琥珀酰亚胺基酯(sulfosuccinimidyl ester)、TFP酯(tetrafluorophenyl ester)、STP酯(sulfotetrafluorophenyl ester)的那些。另外，作为氨基接头，通常使用在碳链的其中一端具有氨基的结构的氨基接头(参考图1)。
如上所述，QProbe中需要修饰的荧光染料仅一种，因此制造成本通常低于其他均一溶液系统探针，但是氨基和荧光染料之间的反应性普遍较低。因此，必须相对于氨基添加大量过量的荧光染料。由于荧光染料的成本通常较昂贵，因此，如果能够提高氨基与荧光染料之间的反应效率，则可以进一步降低QProbe的制造成本。
本发明要解决的问题是提供一种荧光标记成本更低廉的QProbe。
解决问题的方法
近年来，已报道了提高了与荧光染料的反应性的新型氨基接头(5′ssH氨基接头、3′氨基CA接头)(日本专利第4336820号)。图2示出了在引入了该新型氨基接头后的寡DNA末端的结构。当使用了新型氨基接头时，由于该接头的氨基与荧光染料之间的反应效率大大提高，因此能够实现大幅减少昂贵的荧光染料的用量。因此，如果能够将该新型氨基接头用于QProbe的荧光标记，则与使用了现有氨基接头的情况相比，可以实现大幅降低在试剂成本中占很大比例的荧光试剂的成本。
但是，在使用了新型氨基接头的情况下，利用荧光染料标记后的分子结构与使用现有氨基接头时的分子结构不同(图3)。因此，担心由于变更为新型氨基接头而导致QProbe在功能方面的性能下降。
因此，本发明实际合成了适用了新型氨基接头的QProbe(以下称为新型QProbe)，并就功能方面(与靶核酸杂交时的荧光淬灭效率)，与适用了现有氨基接头的常规的QProbe(以下称为现有QProbe)进行了比较，结果对于新型QProbe确认了等于或高于现有QProbe的性能。基于这样的发现完成了本发明。
本发明提供一种用于核酸测定的核酸探针，其特征在于：所述核酸探针用荧光染料标记，在与靶核酸杂交时，所述荧光染料的发光减少，且该探针的5′末端部位通过下述ssH氨基接头被荧光染料标记，所述探针的碱基序列被设计为使得该核酸探针与靶核酸杂交时，在该末端部中，在该探针与靶核酸杂交的末端碱基相距1至3个碱基的靶核酸的碱基序列中至少存在一个碱基以上的G(鸟嘌呤)。
另外，本发明提供了一种用于核酸测定的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针用荧光染料标记，在与靶核酸杂交时，所述荧光染料的发光减少，且该探针的3′末端部位通过下述CA氨基接头被荧光染料标记，所述探针的碱基序列被设计为使得该核酸探针与靶核酸杂交时，在该末端部中，在该探针与靶核酸杂交的末端碱基相距1至3个碱基的靶核酸的碱基序列中至少存在一个碱基以上的G(鸟嘌呤)。
另外，本发明还提供了一种用于核酸测定的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针用荧光染料标记，在与靶核酸杂交时，所述荧光染料的发光减少，且该探针的5′末端部位通过下述ssH氨基接头被荧光染料标记，所述探针的碱基序列被设计为使得该核酸探针与靶核酸杂交时，在该末端部分中，杂交的碱基对至少形成一对以上的G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)配对。
另外，本发明还提供了一种用于核酸测定的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针用荧光染料标记，在与靶核酸杂交时，所述荧光染料的发光减少，且该探针的3′末端部位通过下述CA氨基接头被荧光染料标记，所述探针的碱基序列被设计为使得该核酸探针与靶核酸杂交时，在该末端部分中，杂交的碱基对至少形成一对以上的G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)配对。
另外，本发明还提供一种上述用于核酸测定的核酸探针，其特征在于，被荧光染料标记的末端碱基为C(胞嘧啶)。
此外，本发明提供一种上述用于核酸测定的核酸探针，其特征在于，在经荧光染料标记的核酸探针中，该荧光染料为Pacific Blue、ATTO465、BODIPY FL、5-CR 6G、6-TAMRA、ATTO655、ATTO680和ATTO700中的任一种。
进一步，本发明提供一种经荧光染料标记的核酸探针的核酸测定方法，其特征在于，该核酸探针与靶核酸杂交时，使标记核酸探针的荧光染料的发光减少，并测定该发光的减少，其中，该核酸测定方法使用上述用于核酸测定的探针。
发明效果
根据本发明，能够保持常规QProbe的性能不变而降低核酸探针的制造成本。
本说明书包括作为本申请的优先权的基础的日本专利申请特愿2017-105202的说明书和/或附图中记载的内容。
附图说明
图1示出了在寡DNA的末端引入了现有的氨基接头(C6氨基接头)后的情况的结构式。
图2示出了在寡DNA的末端引入了新型氨基接头后的情况的结构式。
图3示出了由于氨基接头种类的差异而引起的荧光标记后的寡DNA末端附近的结构式的变化。
图4示出了实施例1中合成的QProbe的结构式。
图5示出了实施例1中合成的QProbe的最大荧光淬灭率(％)。
图6-1示出了使用了新型氨基接头的QProbe与使用了现有氨基接头的QProbe的荧光淬灭率的比较(将5′-末端胞嘧啶进行荧光标记)。
图6-2示出了使用了新型氨基接头的QProbe与使用了现有的氨基接头的QProbe的荧光淬灭率的比较(将3′-末端胞嘧啶进行荧光标记)。
图7-1示出了在进行了5′-末端荧光标记的情况下，在使用了新型氨基接头的QProbe中和在使用了现有的氨基接头的QProbe中与荧光染料反应的胺化寡DNA的比例。
图7-2示出了在进行了3′-末端荧光标记的情况下，在使用了新型氨基接头的QProbe中和在使用了现有的氨基接头的QProbe中与荧光染料反应的胺化寡DNA的比例。
具体实施方式
接下来，将参考优选实施例更详细地描述本发明。在本发明中，以下术语与目前的分子生物学、基因工程、微生物工程等中通常使用的术语具有相同的含义：DNA、RNA、cDNA、mRNA、rRNA、XTPs、dXTPs、NTPs、dNTPs、核酸探针、辅助核酸探针(或核酸辅助探针、或简称为辅助探针)、进行杂交(Hybridize)、杂交(Hybridization)、嵌入剂(intercalator)、引物、退火、延伸反应、热变性反应、核酸解链曲线、PCR、RT-PCR、RNA引物PCR、拉伸PCR(StretchPCR)、反向PCR、使用Alu序列的PCR、多重PCR、使用混合引物的PCR、使用PNA的PCR法、杂交法(hybridization assays)、FISH(fluorescent in situ hybridization assays)法、PCR法(polymerase chain assays)、LCR法(ligase chain reaction)、SD法(stranddisplacement assays)、竞争杂交法(competitive hybridization)、DNA芯片、核酸检测用(基因检测用)装置、SNP(单碱基置换多态性)、复合微生物系统等术语。在本发明中，在使用经荧光染料标记的核酸探针的靶核酸的测定方法中，测定在该核酸探针与靶核酸杂交时产生的、杂交前后的荧光染料的发光的减少量。
在本发明中，靶核酸的测定是指定量或定量检测或仅仅检测。使用经荧光染料标记的核酸探针的核酸测定方法是指杂交法(hybridization assays)、FISH(fluorescentin situ hybridization assays)法、PCR法(polymerase chain assays)、LCR法(ligasechain reaction)、SD法(strand displacement assays)、竞争杂交法(competitivehybridization)等。在这些方法中，在添加了经荧光染料标记的核酸探针之后，通过诸如洗涤等方法从测定系统中去除未与靶核酸杂交的未反应的核酸探针的荧光染料，并使与靶核酸杂交的该核酸探针上标记的荧光染料直接从该探针发光，或者对该探针施以间接的手段(例如，通过酶进行作用)而使其发光，并测定其发光量的测定方法。本发明的特征在于并无如此复杂操作而测定靶核酸。
在本发明中，靶核酸是指以定量或定量检测或仅仅检测为目的的核酸。与是否纯化无关。此外，与浓度的大小无关。可以混合存在各种核酸。例如，以在复合微生物系统(多种微生物的RNA或基因DNA的混合存在系统)或共生微生物系统(多种动植物和/或多种微生物的RNA或基因DNA的混合存在系统)中进行以定量或定量检测或仅仅检测为目的的特定核酸。此外，在需要靶核酸的纯化的情况下，可以通过常规已知的方法进行。例如，可以使用市售的纯化试剂盒等而进行。作为上述核酸的具体实例，能够列举：DNA、RNA、PNA、2-O-甲基(Me)RNA、脱氧核糖-寡核苷酸(deoxyribo-oligonucleotides)、核糖-寡核苷酸(riboxy-origonucleotides)等。
本发明中的荧光染料可以方便地使用通常被用于对核酸探针进行标记而进行核酸的测定/检测的荧光染料，但是，优选使用以下荧光染料：当经荧光染料标记的核酸探针与靶核酸杂交时，使核酸上标记的该荧光染料的发光减少的荧光染料。例如能够列举出：荧光素(fluorescein)或其衍生物类{例如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)(FITC)或其衍生物等、Alexa 488、Alexa 532、cy3、cy5、EDANS(5-(2′-氨基乙基)氨基-1-萘磺酸}、罗丹明(rhodamine)6G(R6G)或其衍生物(例如，四甲基罗丹明teramethylrhodamine)(TMR)、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tetramethylrhod amineisothiocyanate)(TMRITC)、x-罗丹明(x-rhodamine)、德克萨斯红(Texas red)、BODIPY FL(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY FL/C3(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY FL/C6(商标名；ThermoFisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY 5-FAM(商标名；Thermo FisherScientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY TMR(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)或其衍生物(例如，BODIPY TR(商标名；Thermo FisherScientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY R6G(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY 564(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、Dep(BODIPY)581(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、Pacific Blue(货号P10163[Thermo Fisher Scientific公司制造])、ATTO465(货号AD 465-31[ATTO-TEC公司制造])、5-CR 6G(货号C6127[Thermo Fisher Scientific公司制造])、6-TAMRA(货号C6123[Thermo Fisher Scientific公司制造])、ATTO655(货号AD 655-31[ATTO-TEC公司制造])、ATTO680(货号AD 680-31[ATTO-TEC公司制造])、ATTO700(货号AD 700-31[ATTO-TEC公司制造])等。其中，作为优选的荧光染料可列举：FITC、EDANS、6-joe、TMR、Alexa 488、Alexa 532、BODIPY FL/C3(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPY FL/C6(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、Pacific Blue(货号P10163[Thermo Fisher公司制造])、ATTO465(货号AD465-31[ATTO-TEC公司制造])、5-CR 6G(货号C6127[Thermo Fisher Scientific公司制造])、6-TAMRA(货号C6123[Thermo Fisher Scientific公司制造])、ATTO655(货号AD 655-31[ATTO-TEC公司制造])、ATTO680(货号AD 680-31[ATTO-TEC公司制造])、ATTO700(货号AD700-31[ATTO-TEC公司制造])等；另外，作为更加优选的荧光染料可列举：FITC、TMR、6-joe、BODIPY FL/C3(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、BODIPYFL/C6(商标名；Thermo Fisher Scientific(分子探针)公司制造，美国)、Pacific Blue(货号P10163[Thermo Fisher公司制造])、ATTO465(货号AD 465-31[ATTO-TEC公司制造])、5-CR 6G(货号C6127[Thermo Fisher Scientific公司制造])、6-TAMRA(货号C6123[ThermoFisher Scientific公司制造])、ATTO655(货号AD 655-31[ATTO-TEC公司制造])、ATTO680(货号AD 680-31[ATTO-TEC公司制造])、ATTO700(货号AD 700-31[ATTO-TEC公司制造])等。
与靶核酸杂交的核酸探针可以由寡脱氧核糖核苷酸也可以由寡核糖核苷酸构成。另外，也可以是***有这两者的嵌合寡核苷酸(chemiric oligonucleodite)。另外，也可以使用2′-o-甲基寡核糖核苷酸(2′-o-Methyl oligoribonucleotides)(其在寡核糖核苷酸的5′末端的核苷部分为胞苷，且该胞苷的2′-位OH基被甲基(methyl)修饰)。或者，为了提高对RNA的亲和性，可以将该2′-o-甲基寡核糖核苷酸***寡脱氧核糖核苷酸中。另外，也可以使用N-O键***联结构型人工核酸[2′，4′-BNANC]。
本发明的探针的碱基数为5至100，优选10至30，特别优选15至25。在超过100的情况下，则易于发生合成错误，包含带有目的以外的序列的探针的可能性增高，因而使本发明的应用范围缩小。在小于5的情况下，则易于引起非特异性杂交，从而测定误差变大。
该探针的碱基序列没有特别限制，只要其与靶核酸特异性杂交即可。优选地，该探针的碱基序列被设计为使得用荧光染料标记的核酸探针与靶核酸杂交时，(1)与该探针杂交的靶核酸的末端碱基部相距1至3个碱基的靶核酸的碱基序列中至少存在一个碱基以上的G(鸟嘌呤)；(2)在探针的末端部分中，探针-核酸杂交复合物的碱基对至少形成一对以上的G(鸟嘌呤)与C(胞嘧啶)配对。
本发明中的核酸探针的寡核苷酸可以通过通常的一般的寡核苷酸制备方法来制备。例如，可以通过化学合成法、使用质粒载体、噬菌体载体的微生物法等来制备(Tetrahedron letters，第22卷，第1859-1862页，1981年；Nucleic Acids Research，第14卷，第6227-6245页，1986年)。另外，优选使用现在市售的核酸合成仪(例如，ABI394(PerkinElmer公司制造，美国)。
为了对寡核苷酸标记荧光染料，可以使用现有已知标记方法中的任何期望的方法(Nature Biotechnology，第14卷，第303-308页，1996年；Applied and EnvironmentalMicrobiology，第63卷，第1143-1147页，1997年；Nucleic acids Research，第24卷，第4532-4535页，1996年)。例如，在使荧光染料分子与5′端结合的情况下，首先，根据日本专利第4336820号的方法，将ssH氨基接头引入5′端的磷酸基中。可以通过将具有氨基反应性的荧光染料或其衍生物结合到该接头上来合成标记的寡核苷酸。可以通过诸如反相等色谱法纯化被上述合成的荧光染料标记的寡核苷酸，以获得用于本发明的核酸探针。
另外，也能够将荧光染料结合到寡核苷酸的3′末端。在这种情况下，将CA氨基接头引入核糖或脱氧核糖的3′-位C的OH基中。或者，将磷酸基引入并将CA氨基接头引入磷酸基的OH基中。可以通过将对氨基具有反应性的荧光染料或其衍生物结合到该接头上来合成标记的寡核苷酸。可以通过诸如反相等色谱法纯化被这样合成的荧光染料标记的寡核苷酸，以获得用于本发明的核酸探针。当引入该氨基时，可以根据日本特许第5808025号的方法将荧光染料分子结合至寡核糖核苷酸。也可以将荧光染料分子引入探针核酸的链中(ANALYTICAL BIOCHEMISTRY，第225卷，第32-38页(1998))。尽管可以如上所述制备本发明的核酸探针，但是优选的探针形式是其中3′或5′末端被荧光染料标记，并且该标记的末端的碱基是G或C的探针。当5′端被标记而3′端未被标记时，3′端的核糖或3′端的脱氧核糖的3′位置C的OH基可以被磷酸基等修饰、另外，3′端的核糖的2′位置C的OH基可以被磷酸基等修饰，没有特殊限制。
本发明的核酸探针不仅可以适用于核酸测定，还可以适用于靶核酸或基因的多态性(polymorphism)或/和基因突变的分析或测定方法。特别地，通过与下述DNA芯片一起使用，从而提供更方便的方法。即，在本发明的核酸探针与靶核酸或基因的杂交中，荧光强度根据是否形成GC对而变化。因此，可以通过将本发明的核酸探针与靶核酸或基因杂交并测定发光强度来分析或测定靶核酸或基因的多态性或/和基因突变。在这种情况下，靶核酸或基因可以是通过各种核酸或基因扩增方法之一而扩增的扩增产物、或者也可以是提取物。靶核酸可以是任何种类。能够应用本发明的靶核酸可以列举出：RNA、DNA、PNA、2′，4′-BNA、2′，4′-BNACOC、3′-Amino-2′，4′-BNA、2′，4′-BNANC、其他人工修饰的核酸等。但是，只要使链中或者末端存在有鸟嘌呤碱基即可。如果链中或末端没有鸟嘌呤碱基存在，则荧光强度不会降低。
因此，通过将本发明的核酸探针包括在用于分析或测定靶核酸或/和基因多态性和突变的测定试剂盒中，能够合适地用作分析或测定靶核酸或基因多态性或/和突变的测定试剂盒。
在本发明中，通过使用上述核酸探针，可以简单且特异性地在短时间内测定靶核酸。测定方法如下所述。在本发明的测定方法中，首先，将上述核酸探针添加至测定系统，并与靶核酸杂交。该方法能够以通常已知的方法进行(Analytical Biochemistry，第183卷，第231-244页，1989年；Nature Biotechnology，第14卷，第303-308页，1996年；Applied andEnvironmental Microbiology，第63卷，第1143-1147页，1997年)。例如，杂交条件为：盐浓度为0至2摩尔浓度，优选0.1至1.0摩尔浓度，pH为6至8，优选6.5至7.5。
反应温度优选为处于使所述核酸探针与靶核酸的特定部位杂交所获得的杂交复合物的Tm值±10℃的范围内。通过这样做，可以防止非特异性杂交。当低于Tm-10℃时，发生非特异性杂交，当超过Tm+10℃时，不发生杂交。可以通过与设计用于本发明的核酸探针所需的实验相同的方式来确定Tm值。即，用所述的核酸合成仪等化学合成具有与该核酸探针杂交的互补碱基序列的寡核苷酸，并通过常规方法测定与该核酸探针的杂交产物的Tm值。
反应时间为1秒至180分钟，优选5秒至90分钟。当时间小于1秒时，在杂交时未反应的本发明的核酸探针增多。另外，反应时间太长也没有特殊意义。反应时间受核酸种类，即核酸的长度或碱基序列的影响很大。如上所述，在本发明中，核酸探针与靶核酸杂交。然后，在杂交之前和之后，用荧光光度计测定荧光染料的发光量，并计算发光减少量。由于减少的量与靶核酸的量成比例，因此可以求出靶核酸的量。
反应溶液中靶核酸的浓度优选为0.1至10.0nM。反应溶液中探针的浓度优选为1.0至25.0nM。当制备校准曲线时，期望相对于靶核酸以1.0至2.5的比例使用探针。
实际上，当测定样品中浓度未知的靶核酸时，首先在上述条件下制作校准曲线。然后，添加具有多种浓度的探针，并测定荧光强度值的减少。将使得测定的荧光强度减少值最大的探针浓度设为优选的探针浓度。利用优选浓度的探针测定的荧光强度的减少值，从校准曲线求出靶核酸的定量值。
当将本发明的测定方法的原理应用于PCR方法时，可以采用任何方法，只要是PCR方法即可，但是在将其应用于实时定量PCR方法的情况下，描述如下。即，在实时定量PCR方法中，使用本发明的特定的核酸探针进行PCR，并且实时测定反应前后的荧光染料的发光减少。本发明的PCR是指各种PCR方法。例如，还包括RT-PCR、RNA引物PCR、拉伸PCR、反向PCR、使用Alu序列的PCR、多重PCR、使用混合引物的PCR、使用PNA的PCR方法等。此外，术语“定量”不仅指通常的定量测定，而且还指检测程度的定量测定。
如上所述，靶核酸是指定量或定量检测其存在量或仅检测的核酸，与是否纯化无关。此外，对浓度的大小不作要求。可以混合各种核酸。例如，在复合微生物系统(多种微生物的RNA或基因DNA的混合系统)或共生微生物系统(多种动植物和/或多种微生物的RNA或基因DNA的混合系统)中以扩增为目的的特定核酸。当靶核酸需要纯化的情况下，可以通过常规已知的方法进行。例如，可以使用市售的纯化试剂盒进行。
常规已知的定量PCR方法为，使用dATP、dGTP、dCTP、dTTP或dUTP、靶核酸(DNA或RNA)、Taq聚合酶、引物以及用荧光染料标记的核酸探针或嵌入剂，在Mg离子存在下，重复进行低温和高温，扩增靶核酸，并实时监测扩增过程中荧光染料的发光增加量(实验医学(Experimental Medicine)，第15卷，第7期，第46-51页，1997年，羊土社)。
本发明的定量PCR方法的特征在于，使用本发明的核酸探针扩增靶核酸，并在扩增过程中测定荧光染料的发光减少量。在本发明的定量PCR中，本发明的优选探针的碱基数为5至100，优选为10至30，特别优选为15至25，只要是在PCR循环中与靶核酸的扩增产物杂交的探针即可，可以使用任何探针。另外，可以设计成正向(forward)类型或反向(reverse)类型。
例如，可以举出以下例子。
(1)一种核酸探针，其5′末端部，优选5′末端被在本发明的实施中有用的荧光染料标记，该核酸探针的碱基序列被设计为使得靶核酸在该末端部杂交时，在该探针与靶核酸杂交的5′末端部分相距1至3个碱基的5′侧的靶核酸的碱基序列中存在一个碱基以上的G(鸟嘌呤)。
(2)所述(1)的探针，其中3′末端被荧光染料标记。
(3)所述(1)的探针，其中3′末端例如3′末端核糖或脱氧核糖的3′位置C的OH基被磷酸基等修饰、或者3′末端核糖的2′位置C的OH基被磷酸基等修饰。
(4)一种核酸探针，其3′末端部，优选3′末端被本发明的荧光染料标记，且3′末端碱基是G或C、或者其3′末端核糖2′位置的OH基被磷酸基等修饰。
(5)所述(1)的探针，其中5′末端部，优选5′末端被本发明的荧光染料标记。
(6)一种核酸探针，其5′末端部，优选5′末端被在本发明的实施中有用的荧光染料标记，且5′末端碱基是G或C。
在所述(4)、(6)的情况下，如果不能将靶核酸的碱基序列的5′端设计为G或C，则通过在根据靶核酸的碱基序列而设计的引物寡核苷酸的5′末端添加5′-鸟苷酸或5′-胞苷酸，也能够合适地实现本发明的目的。因此，在本发明中，3′或5′末端碱基设计为G或C的核酸探针定义为：除了根据靶核酸的碱基序列设计的探针以外，还包括通过在该探针的3′或5′末端添加5′-鸟苷酸或5′-胞苷酸而形成的探针。
特别地，上述(1)、(2)、(3)或(4)的探针被设计为不用作引物。代替在利用FRET现象的实时定量PCR方法中使用的(用荧光染料标记)两种探针，而使用本发明的一种探针进行PCR。将该探针添加到PCR反应系统中进行PCR。在核酸延伸反应期间，已与靶核酸或扩增的靶核酸杂交的该探针被聚合酶分解，并从杂交产物中分解并除去。测定此时的反应系统或已完成核酸变性反应的反应系统的荧光强度值。另外，测定靶核酸或扩增后的扩增靶核酸与该探针杂交进行中的反应系统(通过退火反应或聚合酶直至将该探针从杂交产物中除去为止的核酸延伸反应时的反应系统)的荧光强度值。然后，通过计算相比前者的荧光强度值的减少率来测定被扩增的核酸。当该探针通过核酸变性反应而与靶核酸或扩增的靶核酸完全解离，或者，当该探针在核酸延伸时被聚合酶分解而从该探针与靶核酸或扩增的靶核酸的杂交产物中分解并去除时，荧光强度较大。然而，该探针与靶核酸或扩增的靶核酸充分杂交的退火反应完成的反应系统的荧光强度值，或者核酸延伸反应时通过聚合酶而从该探针与靶核酸或扩增的靶核酸的杂交产物种分解并除去为止的反应系统的荧光强度值与前者相比减少了。荧光强度值的减少与扩增的核酸量成比例。在这种情况下，优选如下方式设计(2)、(3)和(4)探针的碱基序列：使该探针与靶核酸杂交时的杂交产物的Tm为引物的杂交产物的Tm值的±15℃的范围内，优选在±5℃的范围内。当探针的Tm值小于引物Tm值-5℃，尤其是小于引物Tm值-15℃时，探针不进行杂交，因此荧光染料的发光不会降低。相反，当超过引物的Tm值+5℃，特别是+15℃时，探针将与非目标的靶核酸杂交而失去其特异性。
上述探针(5)和(6)作为引物被添加到PCR反应系统中。除了本发明以外，尚未有使用荧光染料标记的引物的PCR方法。随着PCR反应的进行，扩增的核酸被本发明的荧光染料标记。因此，尽管已完成核酸变性反应的反应系统的荧光强度值较大，但在已完成退火反应或在核酸延伸反应期间的反应系统中，反应系统的荧光强度比前者的荧光强度减少。
PCR反应可以在与通常的PCR方法相同的反应条件下进行。因此，可以在Mg离子浓度低(1-2mM)的反应系统中扩增靶核酸。当然，本发明也可以在常规已知的定量PCR中使用的高浓度(2至4mM)的Mg离子存在下的反应系统中进行。
另外，在本发明的PCR方法中，可以通过进行本发明的PCR并分析其扩增产物的核酸的解链曲线来求出Tm值。该方法是分析核酸的解链曲线的新方法。在该方法中，可以合适地使用在本发明的PCR方法中使用的核酸探针或用作引物的核酸探针。在这种情况下，通过使本发明的探针的碱基序列与含有SNP(单碱基置换多态性)的区域互补，在PCR完成后，通过分析从该核酸的本发明的探针的解链曲线，从而可以根据解链曲线的差异来检测SNP。作为本发明的探针的序列，只要使用与含有SNP的序列互补的碱基序列，则从探针序列与含有SNP的序列的解链曲线获得的Tm值比探针序列与不含SNP的序列的解链曲线所得到的Tm值高。
实施例
接下来，将以实施例为例更具体地描述本发明。
实施例1
实验概要
通过使用烷基链(其将寡DNA和荧光染料连接)长度各异的现有的氨基接头以及荧光染料(BODIPY FL)，合成多个具有不同烷基链长度的QProbes，研究烷基链长度对QProbe荧光淬灭率的影响。图4示出了在该实施例中准备的QProbe的结构。使用具有不同烷基链长度的三种的氨基接头(烷基链碳原子数为3、6或12的氨基接头)和两种具有不同烷基链长度的荧光染料：BODIPY FL(烷基链的碳原子数为2或4的BODIPY FL)，共计合成了烷基链(其将寡DNA和荧光染料连接)长度不同的6种QProbe。6种QProbe的序列共通，并且5′端的胞嘧啶(C)用BODIPY FL进行了荧光标记。
表1、研究所使用的Qprobe的概要
QProbe序列(5’→3’)：CCTACGGGAGGCAGCAG(序列号1)
互补链序列(5’→3’)：CTGCTGCCTCCCGTAGG(序列号2)
荧光标记部位：5’末端的胞嘧啶
表2、实施例1中的反应溶液量及其组成
添加了QProbe与互补链这两者的系统
仅添加了QProbe的系统
总量：
20μl
同左
QProbe：
50nM
同左
互补链：
1.600nM
0nM(未添加)
KCl：
50mM
同左
Tris-HCl：
10mM(pH8.7，25℃)
同左
MgCl<sub>2</sub>：
1.5mM
同左
实验中，对于6种QProbe的每一个，分别准备了两个反应系统：添加了QProbe和互补链这两者的系统、仅添加了QProbe的系统。利用实时PCR仪器(LightCycler 480[RocheLife Sciences公司制造])进行解链曲线分析。解链曲线分析的荧光测定在40至95℃的温度范围内进行，并且荧光测定的频率为约0.2℃/测定。使用所获得的荧光强度数据，通过以下计算公式获得各测定温度下的荧光淬灭率，将最高值设为最大荧光淬灭率，并在6种QProbes之间比较该测定值。
荧光淬灭率(％)＝{(F1-[F2×F195/F295])/F1}×100
F1：[仅QProbe]的荧光强度
F2：[QProbe+互补链]荧光强度
F195：[仅QProbe]在95℃(解链时的)荧光强度
F295：[QProbe+互补链]在95℃(解链时的)荧光强度
其结果在图5中示出。从该结果可以看出，当烷基链长度为8个碳原子时，荧光淬灭(约82％)最高。另外，碳原子为7的QProbe比碳原子数为8的QProbe仅短了一个碳原子，其荧光淬灭率约为59％，远低于碳原子数为8的QProbe。另一方面，碳原子数为10的QProbe比碳原子为8的QProbe仅长了两个碳原子，其荧光淬灭率约为54％，与碳原子为8的QProbe相比，荧光淬灭率也显著下降。
从以上结果可以看出，烷基链长度的微小差异对QProbe的荧光淬灭率产生很大影响。另外，由于使用QProbe检测靶基因时的灵敏度和准确性很大程度上取决于荧光淬灭率，因此该结果也表明烷基链的选择是影响QProbe性能的重要因素。
实施例2
实施例1表明，连接寡DNA和荧光染料的烷基链的结构对与QProbe性能直接相关的荧光淬灭率有很大影响。
另一方面，比较图3中所示的与现有氨基接头合成的QProbe和与新型氨基接头合成的QProbe的化学结构后发现，后一种接头更长，荧光染料与寡DNA之间的距离更宽。基于这一点以及实施例1的结果来看，若将利用现有的最佳氨基接头合成的QProbe(BODIPY FL[D6140]的情况下，为C6氨基接头)的荧光淬灭率与利用原子数相同的新型氨基接头合成的QProbe的荧光淬灭率进行比较，则预期后者的荧光淬灭率会显著降低。
为了验证上述预想，用现有的最佳氨基接头合成了QProbe(合成委托给TSUKUBAOLIGO SERVICE公司)，用与现有的最佳氨基接头的烷基链长度相同的新型氨基接头合成了QProbe(合成委托给GeneDesign公司)，并比较了它们的最大荧光淬灭率。
表3-1、实施例2中使用的QProbe的概要(5′末端荧光标记)
QProbe名称
荧光色素
氨基接头
PB-5’-S
Pacific Blue
现有氨基接头
PB-5’-N
同上
新型氨基接头
A46-5’-S
ATTO 465
现有氨基接头
A46-5’-N
同上
新型氨基接头
BF-5’-S
BODIPY FL
现有氨基接头
BF-5’-N
同上
新型氨基接头
CR-5’-S
5-CR 6G
现有氨基接头
CR-5’-N
同上
新型氨基接头
TR-5’-S
6-TAMRA
现有氨基接头
TR-5’-N
同上
新型氨基接头
A65-5’-S
ATTO 655
现有氨基接头
A65-5’-N
同上
新型氨基接头
A68-5’-S
ATTO 680
现有氨基接头
A68-5’-N
同上
新型氨基接头
A70-5’-S
ATTO 700
现有氨基接头
A70-5’-N
同上
新型氨基接头
表3-2、实施例2中使用的QProbe的概要(3′末端荧光标记序列(5′-3′)：)
QProbe名称
荧光色素
氨基接头
PB-3’-S
Pacific Blue
现有氨基接头
PB-3’-N
同上
新型氨基接头
A46-3’-S
ATTO 465
现有氨基接头
A46-3’-N
同上
新型氨基接头
BF-3’-S
BODIPY FL
现有氨基接头
BF-3’-N
同上
新型氨基接头
CR-3’-S
5-CR 6G
现有氨基接头
CR-3’-N
同上
新型氨基接头
TR-3’-S
6-TAMRA
现有氨基接头
TR-3’-N
同上
新型氨基接头
A65-3’-S
ATTO 655
现有氨基接头
A65-3’-N
同上
新型氨基接头
A68-3’-S
ATTO 680
现有氨基接头
A68-3’-N
同上
新型氨基接头
A70-3’-S
ATTO 700
现有氨基接头
A70-3’-N
同上
新型氨基接头
<表3的追加说明>
QProbe的序列：5′末端荧光标记QProbe：5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′(SEQ ID NO：1)
3′末端荧光标记QProbe：5′AAGGAGGTGATCCAGCC 3′(SEQ ID NO：3)
QProbe名称：以○○○-△’-□表示
○○○；荧光色素的略称
△；被荧光标记的末端。由此，△为“5”或“3”。
□；表示使用的接头。“S”表示使用的是现有接头、“N”表示使用的是新型接头。
接头烷基链长度：碳原子数为6(对实施例2中使用的全部的QProbe而言相同)
现有氨基接头：5′末端；5′-Amino-Modifier C6(货号10-1906-90[格伦研究公司制造])
3′末端；3′-PT-Amino-Modifier C6 CPG(货号20-2956-01[格伦研究公司制造])
新型氨基接头：5′末端；ssH氨基接头；(货号CLP-1132[ChemGene公司制造])
3′末端；3′-Amino CALinker(使用该接头的Qprobe的合成委托给GeneDesign公司)
荧光色素：Pacific Blue(货号P10163[Thermo Fisher公司制造])
ATTO465(货号AD 465-31[ATTO-TEC公司制造])
BODIPY FL(货号D6140 Thermo Fisher Scientific公司制造)
5-CR 6G(货号C6127[Thermo Fisher Scientific公司制造])
6-TAMRA(货号C6123[Thermo Fisher Scientific公司制造])
ATTO655(货号AD 655-31[ATTO-TEC公司制造D
ATTO680(赁号AD 680-31[ATTO-TEC公司制造D
ATTO700(货号AD 700-31[ATTO-TEC公司制造D
互补链：具有与QProbe链长相同且完全互补的序列的寡DNA(合成商：TSUKUBAOLIGO SERVICE公司)
在本实施例中，准备了16种使用现有的氨基接头制备的QProbes，对于其中每个QProbes，制备了相同数量的、仅将接头更改为新型氨基接头的QProbes。
对于上述全部32种QProbes，以与实施例1中相同的方式求出最大荧光淬灭率，并比较该测定值以研究新型氨基接头对荧光淬灭率的影响。
图6-1示出了5′末端的胞嘧啶被荧光标记的QProbe的结果。根据该结果，对于标记的任一荧光染料，使用新型氨基接头的QProbe的荧光淬灭率都等于或高于使用现有氨基接头的QProbe的荧光淬灭率。
图6-2示出了3′末端的胞嘧啶被荧光标记的QProbe的结果。根据该结果，与5′端标记的QProbe同样，对于任一荧光染料，使用新型氨基接头的QProbe的荧光淬灭率都等于或高于使用现有氨基接头的QProbe的荧光淬灭率。
因此，使用新型氨基接头的QProbe在性能方面等同于或优于使用现有的氨基接头的QProbe，并且如上所述，能够大幅降低制造成本，因此使用新型氨基接头的QProbe对于产业利用方面非常有用。
实施例1表明，接头长度的微小差异对荧光淬灭率有很大的影响，另外，用新型氨基接头合成的QProbe的接头长度远大于(至少2个以上的碳原子数)用现有的最佳氨基接头合成的QProbe的接头长度，因此，预期用新型氨基接头合成的QProbe的荧光淬灭率大幅低于现有氨基接头的荧光淬灭率。然而，如上所述，用新型氨基接头合成的QProbe的荧光淬灭率等于或高于用现有氨基接头合成的QProbe的荧光淬灭率的结果。由于该结果是没有实际验证就难以预测的事件，因此可以认识到该专利也具有创造性。
实施例3
与荧光染料反应性的比较
在本实施例中，首先，准备以下四种类型的胺化寡DNA。
具体来说，准备了：
[1]在由SEQ ID NO：1表示的寡DNA的5′末端引入了现有氨基接头的胺化寡DNA。
[2]在由SEQ ID NO：1表示的寡DNA的5′末端引入了新型氨基接头的胺化寡DNA。
[3]在由SEQ ID NO：3表示的寡DNA的3′末端引入了现有氨基接头的胺化寡DNA。
[4]在由SEQ ID NO：3表示的寡DNA的3′末端引入了新型氨基接头的胺化寡DNA。
的上述4种胺化寡DNA。
通过使这4种胺化寡DNA与可用于QProbe的荧光染料(8种)反应，测定并比较所得的反应产物的量，从而比较了现有氨基接头与新型氨基接头对上述荧光染料的反应性的差异。引入了现有氨基接头的胺化寡DNA(上述[1]、[3])委托给TSUKUBA OLIGO SERVICE公司进行合成，引入了新型氨基接头的胺化寡DNA(上述[2]、[4])委托给GeneDesign公司进行合成。
将上述[1]至[4]的胺化寡DNA(1nmol)和荧光染料(500nmol)溶解在10％(V/V)二甲基甲酰胺、250mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，总体积设为100μl。将该溶液在40℃下在避光条件下开始进行胺化的寡DNA与荧光染料之间的反应。在反应开始后30分钟收集15μl，用NAP5(Pharmacia公司制造)脱盐，然后，通过反相HPLC求出该样品中所含的荧光染料、未反应的胺化寡DNA和反应的胺化寡DNA的量。
<其他详细条件>
QProbe的序列：5′末端荧光标记QProbe：5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′(SEQ ID NO：1)
3′末端荧光标记QProbe：5′AAGGAGGTGATCCAGCC 3′(SEQ ID NO：3)
接头烷基链长度：碳原子数为6(对实施例3中使用的全部的QProbe而言相同)
现有氨基接头：5′末端；5′-Amino-Modifier C6(货号10-1906-90[格伦研究公司制造])
3′末端；3′-PT-Amino-Modifier C6 CPG(货号20-2956-01[格伦研究公司制造])
新型氨基接头：5′末端；ssH氨基接头；(货号CLP-1132[ChemGene公司制造])
3′末端；3′-Amino CA接头(使用该接头的Qprobe的合成委托给GeneDesign公司)
荧光色素：Pacific Blue(货号P10163[Thermo Fisher公司制造])
ATTO465(货号AD 465-31[ATTO-TEC公司制造])
BODIPYFL(货号D6140 Thermo Fisher Scientific公司制造)
5-CR 6G(货号C6127[Thermo Fisher Scientific公司制造])
6-TAMRA(赁号C6123[Thermo Fisher Scientific公司制造])
ATTO655(货号AD 655-31[ATTO-TEC公司制造])
ATTO680(赁号AD 680-31[ATTO-TEC公司制造])
ATTO700(货号AD 700-31[ATTO-TEC公司制造])
HPLC条件：流动相；A溶液 5％乙腈/100nM TEAA(pH70)
B溶液 50％乙腈/100nM TEAA(pH70)
柱温；50℃
梯度；B溶液的％0→70％/30分钟
通过上述方法求出的与荧光染料反应的胺化寡DNA的比例如图7-1、图7-2所示。
此外，图7-1是表示5′末端荧光标记情况下的与荧光染料反应的胺化寡DNA的比例的图，图7-2是表示3′末端荧光标记情况下的与荧光染料反应的胺化寡DNA的比例的图。
根据该结果，与荧光修饰位置和荧光染料的类型无关，新型氨基接头的情形下，与荧光染料反应的胺化寡DNA的比例明显高于现有氨基接头的情形。由以上可知，通过使用新型氨基接头，可以容易地获得大量的QProbe。
进一步，该实施例和实施例2的结果表明，通过使用新型氨基接头能够低成本地制造品质优异的QProbe。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请以参考的形式直接并入本说明书中。
工业实用性
本发明能够用于靶基因的定性和定量分析。
<SEQ ID NO：1>
SEQ ID NO：1示出了5′末端荧光标记的QProbe的序列。
5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′
<SEQ ID NO：2>
SEQ ID NO：2示出了SEQ ID NO：1中描述的QProbe的互补链序列。
5′CTGCTGCCTCCCGTAGG 3′
<SEQ ID NO：3>
SEQ ID NO：3示出了3′末端荧光标记的QProbe的序列。
5′AAGGAGGTGATCCAGCC 3′。