一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
阅读说明：本技术 一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用 (Beta-glucosidase mutant and application thereof ) 是由 杨峰 张振雷 王晓军 李文娟 庞金蕙 于 2019-11-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用,通过全质粒PCR对原有野生型Bacillus cereus W23Q 的β-葡萄糖苷酶进行定点突变,制备单突变体库；采用PCR体系和程序进行全质粒PCR,结束后采用Dpn I酶消除模板,再将质粒转化到大肠杆菌Top10中,培养提取质粒保存并送测序；确定突变成功后,将质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21中,培养、诱导表达,即得到β-葡萄糖苷酶突变体。该突变体较野生酶能大幅度提高催化Rg3转化Rh2的效率。应用该菌种生产Rh2,能降低成本,便于工业化应用。(the invention relates to a beta-glucosidase mutant and application thereof, wherein a single mutant library is prepared by carrying out site-directed mutagenesis on beta-glucosidase of original wild type Bacillus cereus W23Q through whole plasmid PCR; carrying out whole plasmid PCR by adopting a PCR system and a PCR program, eliminating a template by adopting Dpn I enzyme after the completion, then transforming the plasmid into escherichia coli Top10, culturing, extracting the plasmid, storing and sequencing; and after the success of mutation is determined, the plasmid is transformed into an expression host escherichia coli BL21, and the beta-glucosidase mutant is obtained after culture and induced expression. Compared with wild enzyme, the mutant can greatly improve the efficiency of catalyzing Rg3 to convert Rh 2. The Rh2 produced by the strain can reduce the cost and is convenient for industrial application.)
技术领域
本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
背景技术
人参是一种名贵药材，也是传统中药，具有良好的药用价值。人参的主要活性成分是人参皂苷，其主要成分有Rb1、Rb2、Rc、Rd及Rg3等，其中Rh2的含量十分稀少，因此也被称为“稀有皂苷”，Rh2具有多种功效，其具有与化疗药物联用增效减毒，在***的过程中，发现临床化疗失败常与肿瘤细胞对化疗药物产生耐药性有关，人参皂苷Rh2可以作为肿瘤耐药逆转剂，可提高化疗药物的抗肿瘤活性。因此，天然产物Rh2具有广泛的市场。
人参皂苷Rh2虽然具有优越的抗癌性能，但由于它本身是一个天然产物，分子十分复杂，直接合成有不小的困难。在天然产物中其含量极低，所以价格昂贵，水溶性差不易吸收也限制了它的大量使用。目前，提取和合成人参皂苷Rh2有全细胞催化、酸水解等的方式，然而其效率很低，副产物多，不适宜工业化放大生产。
从近年来β-葡萄糖苷酶的应用可以发现，目前为止其水解活性被广泛研究，能够水解人参皂甙与橄榄苦苷等天然产物，同时具备合成烷基糖苷的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，以及将该突变体用于合成人参皂苷Rh2的方法。
实现本发明目的的技术方案是：
一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶来源于野生型的Bacillus cereusW23Q，β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，或者为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：
将第197位的丙氨酸A突变为天冬氨酸D，简称A197D；
或/和将第246位的缬氨酸V突变为天冬氨酸D，简称V246D；
或/和将第295位的天冬氨酸D突变为天冬酰胺N，简称D295N；
或/和将第304位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，简称Y304F；
或/和将第360位的天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，简称N360D；
或/和将第489位的异亮氨酸I突变为缬氨酸V，简称I489V。
所述的β-葡萄糖苷酶突变体的制备方法，包括以下步骤：
（1）通过反向PCR对原有野生型Bacillus cereus W23Q 的β-葡萄糖苷酶进行定点突变，制备单突变体库；
（2）采用PCR体系和程序进行全质粒PCR，结束后采用Dpn I酶消除模板，再将质粒转化到大肠杆菌Top10中，培养提取质粒保存并送测序；
（3）确定突变成功后，将质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21中，培养、诱导表达，即得到β-葡萄糖苷酶突变体。
本发明的另一个目的是，提供了所述β-葡萄糖苷酶突变体在合成人参皂苷Rh2中的应用。
应用所述β-葡萄糖苷酶突变体合成人参皂苷Rh2的方法是以人参皂苷Rg3为底物，在β-葡萄糖苷酶突变体的催化下，反应生成人参皂苷Rh2；催化反应温度为20～50℃；催化反应体系中人参皂苷Rg3的浓度为1％ ～10％w/v，β-葡萄糖苷酶突变体用量为底物人参皂苷Rg3重量的0.01～0.06倍，余量为水或磷酸缓冲液，以及用于溶解人参皂苷Rg3的助溶剂；
催化反应体系的pH值5.0～9.0。
上述合成反应温和，操作简单，副产物少，酶法生产属于绿色合成，有利于酶法生产人参皂苷Rh2的工业化应用。
本发明β-葡萄糖苷酶来源于Bacillus cereus W23Q，所述的β-葡萄糖苷酶突变体基因较原基因发了6处定点突变，可进行单点或多点组合突变对野生型酶人工改造、进化。经过突变后，酶催化Rg3的效率更高，在20~50℃均展现出良好的活性，为工业化生产操作上提供了更多的简便性，同时该反应所需温度与室温相差不大，也减少了工业化生产的能耗，降低了其生产成本。
本发明所述的β-葡萄糖苷酶突变体，通过定点突变，酶突变体对底物Rg3的催化活性高，底物Rg3转化成Rh2的转化率达91％以上，转化率高，副产物少，制得的Rh2含量高。
附图说明
图1为重组质粒pET28a-bgl。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1：
β-葡萄糖苷酶的来源及其突变体的获得
构建重组质粒，将目的基因构建到pET-28a质粒，酶切位点为BamH1和Hind III。
所述β-葡萄糖苷酶来源于野生型的Bacillus cereus W23Q，β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，或者为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：
将第197位的丙氨酸A突变为天冬氨酸D、谷氨酸E，简称A197D；
或/和将第246位的缬氨酸V突变为天冬氨酸D，简称V246D；
或/和将第295位的天冬氨酸D突变为天冬酰胺N，简称D295N；
或/和将第304位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F，简称Y304F；
或/和将第360位的天冬酰胺N突变为天冬氨酸D，简称N360D；
或/和将第489位的异亮氨酸I突变为缬氨酸V，简称I489V。
实施例2：
β-葡萄糖苷酶突变体的制备，包括以下步骤：
（1）通过反向PCR对β-葡萄糖苷酶进行定点突变，制备单突变体库；
（2）采用PCR体系和程序进行全质粒PCR，结束后采用Dpn I酶消除模板，再将质粒转化到大肠杆菌DH5α中，培养提取质粒保存并送测序；
（3）确定突变成功后，将质粒转化到表达宿主大肠杆菌BL21中，培养、诱导表达，即得到β-葡萄糖苷酶突变体。
制备方法中，步骤（2）所述PCR体系为：
Takara PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.25μL
质粒pET-28a-bgl 1μL
10 X Buffer 5μL
dNTPs 4μL
上游引物 1μL
下游引物 1μL
无菌水 至50μL；
所述PCR反应程序为：
①变性：98℃ 4min；
②98℃ 10s，50-65℃ 30s，72℃ 7min，25个循环；
③充分延伸72℃ 10min；
④4℃ 30min。
重组质粒pET28a-bgl如图1所示。
所述上、下游引物名称及序列如下：
实施例3：
应用实施例2制得的β-葡萄糖苷酶突变体合成人参皂苷Rh2，在100ml三口瓶中加入5g底物人参皂苷Rg3，再用15mL DMSO溶解，继续加入pH=7.0的磷酸缓冲溶液85mL，继续加入酶0.05g，搅拌，40℃水浴，检测pH，采用HCl/NaOH调节pH在7.0左右。反应4h后，即可检测Rh2产量，检测结果见下表。
从表中可知，野生型的Bacillus cereus W23Q酶对底物Rg3转化成Rh2的转化率为85.51％，而其酶突变体对底物Rg3转化成Rh2的转化率达91％以上，最高达99.63％，证明制得的β-葡萄糖苷酶突变体能大幅度提高催化效率。
序列表
<110> 广西师范大学
<120> 一种β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
<141> 2019-11-01
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1560
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
atgattgtta aacgtttatt aatgatatgt tgtatcgtca tcttttttat tcctttcact 60
ttcatttccc ctcactctac ttatgctgaa gctaatacta cgtataaaaa acatgaatta 120
cgtgctgtat ggatcgcatc tgttcttaat attgattggc cctcaaaaac cggcttaccc 180
atcgaaaatc aaaaacaaga gtttattaga ttattagacg atgtaaaaaa caccggtatg 240
aatgcagtcg ttgtacaaat caaaccaacc gctgatgctt tctatccttc aaattacggt 300
ccttggtctg aatacattac gggcacacaa ggaaaagatc ctggttatga cccactcgca 360
tttatggtcg atgaagcaca taaaagaaat atagaattcc acgcatggat taacccatac 420
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catcccgatt ggattgtacc ttatggcggg aagctatatt acaatcccgg tattccagaa 540
gtgaaaaaat ttataactga aggtgcttta gaaattgtgc aaaattatgc cattgatgcg 600
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aatgtaaatg aacttgtaaa agatttaaat actgctataa aacaagaaaa atcatacgta 780
aagtttggca taagtccgtt cggcgtatgg cgaaatatag ctgacgatcc aactggctct 840
aacacaactg caggtcaaag gaactatgat gacctttacg ctgatacacg tgagtggata 900
caaaaaggat atattgacta cattacaccg caaatctatt ggaatattgg tttcacacca 960
gctgcatatg acatcttagt agattggtgg gtaaaagaaa caaataataa accgattcac 1020
ctatacatcg gtcaggcggc ctataaaatt aataataatt ctgtcccagc ttggtctaat 1080
ccagaagaat acccaagaca aattgaatta aatcggttat atcctgaaat aaaaggtagt 1140
atgcatttta gcttaaaaga tattaataac aatccactag gaataaaaga tagactctca 1200
aaagacatat ataaatatcc tccattaatc ccctctatgc cttggcttga tcatgatcca 1260
ccaaaacaac cgactttaaa aggtgctatt ccaagagatg aaggtattgc tataggcatt 1320
attgacgata gagagaatga ttctgcttat tacaccattt accgcgcgaa tggaaaaaat 1380
gaagtggata tacaaaaccc aaaaaattta cttactactg taaggaaaac aaaacttgga 1440
gaaatttatg tagataaaac agctatctct ggagaaacgt atacgtatgt agtaactgca 1500
gttgatcgat tgcataatga aagcgttgca tctagtcatg ctaccgttaa agcaaaataa 1560
<210> 2
<211> 519
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 2
Met Ile Val Lys Arg Leu Leu Met Ile Cys Cys Ile Val Ile Phe Phe
1 5 10 15
Ile Pro Phe Thr Phe Ile Ser Pro His Ser Thr Tyr Ala Glu Ala Asn
20 25 30
Thr Thr Tyr Lys Lys His Glu Leu Arg Ala Val Trp Ile Ala Ser Val
35 40 45
Leu Asn Ile Asp Trp Pro Ser Lys Thr Gly Leu Pro Ile Glu Asn Gln
50 55 60
Lys Gln Glu Phe Ile Arg Leu Leu Asp Asp Val Lys Asn Thr Gly Met
65 70 75 80
Asn Ala Val Val Val Gln Ile Lys Pro Thr Ala Asp Ala Phe Tyr Pro
85 90 95
Ser Asn Tyr Gly Pro Trp Ser Glu Tyr Ile Thr Gly Thr Gln Gly Lys
100 105 110
Asp Pro Gly Tyr Asp Pro Leu Ala Phe Met Val Asp Glu Ala His Lys
115 120 125
Arg Asn Ile Glu Phe His Ala Trp Ile Asn Pro Tyr Arg Ile Thr Met
130 135 140
Asn His Thr Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asn Asn His Pro Ala Lys Gln
145 150 155 160
His Pro Asp Trp Ile Val Pro Tyr Gly Gly Lys Leu Tyr Tyr Asn Pro
165 170 175
Gly Ile Pro Glu Val Lys Lys Phe Ile Thr Glu Gly Ala Leu Glu Ile
180 185 190
Val Gln Asn Tyr Ala Ile Asp Ala Leu His Met Asp Asp Tyr Phe Tyr
195 200 205
Pro Tyr Lys Leu Ala Gly Glu Gln Phe Pro Asp Gln Lys Thr Tyr Glu
210 215 220
Thr Tyr Asn Asn Gly Arg Phe Thr Asn Ile Glu Asp Trp Arg Arg Asn
225 230 235 240
Asn Val Asn Glu Leu Val Lys Asp Leu Asn Thr Ala Ile Lys Gln Glu
245 250 255
Lys Ser Tyr Val Lys Phe Gly Ile Ser Pro Phe Gly Val Trp Arg Asn
260 265 270
Ile Ala Asp Asp Pro Thr Gly Ser Asn Thr Thr Ala Gly Gln Arg Asn
275 280 285
Tyr Asp Asp Leu Tyr Ala Asp Thr Arg Glu Trp Ile Gln Lys Gly Tyr
290 295 300
Ile Asp Tyr Ile Thr Pro Gln Ile Tyr Trp Asn Ile Gly Phe Thr Pro
305 310 315 320
Ala Ala Tyr Asp Ile Leu Val Asp Trp Trp Val Lys Glu Thr Asn Asn
325 330 335
Lys Pro Ile His Leu Tyr Ile Gly Gln Ala Ala Tyr Lys Ile Asn Asn
340 345 350
Asn Ser Val Pro Ala Trp Ser Asn Pro Glu Glu Tyr Pro Arg Gln Ile
355 360 365
Glu Leu Asn Arg Leu Tyr Pro Glu Ile Lys Gly Ser Met His Phe Ser
370 375 380
Leu Lys Asp Ile Asn Asn Asn Pro Leu Gly Ile Lys Asp Arg Leu Ser
385 390 395 400
Lys Asp Ile Tyr Lys Tyr Pro Pro Leu Ile Pro Ser Met Pro Trp Leu
405 410 415
Asp His Asp Pro Pro Lys Gln Pro Thr Leu Lys Gly Ala Ile Pro Arg
420 425 430
Asp Glu Gly Ile Ala Ile Gly Ile Ile Asp Asp Arg Glu Asn Asp Ser
435 440 445
Ala Tyr Tyr Thr Ile Tyr Arg Ala Asn Gly Lys Asn Glu Val Asp Ile
450 455 460
Gln Asn Pro Lys Asn Leu Leu Thr Thr Val Arg Lys Thr Lys Leu Gly
465 470 475 480
Glu Ile Tyr Val Asp Lys Thr Ala Ile Ser Gly Glu Thr Tyr Thr Tyr
485 490 495
Val Val Thr Ala Val Asp Arg Leu His Asn Glu Ser Val Ala Ser Ser
500 505 510
His Ala Thr Val Lys Ala Lys
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Ala Thr Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Ala
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Thr Gly Thr Cys Ala Thr Ala Ala
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Cys Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Ala
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Ala Thr Cys Gly Thr Thr Thr Gly Thr Cys Ala Ala Gly
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Cys Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Gly Thr Gly Thr
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<213> 蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
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Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly
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Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Gly
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Gly Ala Thr Cys Ala Gly Ala Ala
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<400> 8
Gly Thr Ala Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly
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Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Gly Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Ala
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