具体实施方式

本发明提供了一种梨几丁质酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述几丁质酶的生物来源为汤山酥梨(Pyrus bretshneider Rehd)。所述几丁质酶的长度为316个氨基酸序列，其中N端包含由34个氨基酸组成的信号肽(SEQ ID NO:3：MAMEASEFMASKTQTLALTLSLLILISSCKSSQA)。

本发明还提供了一种编码所述梨几丁质酶的基因PbrChiA，核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。所述信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示(ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCATCCAAAACACAAACCCTAGCCCTAACTCTGTCCCTCTTGATCCTCATTTCTTCATGCAAGTCCTCCCAAGCC)。

本发明提供了一种植物重组表达载体，包含所述基因PbrChiA。所述植物重组表达载体优选以pCold-His为骨架载体。所述基因PbrChiA的插入多克隆位点优选为XbaI/XhoI。本发明对所述pCold-His的来源没有特殊限制采用本领域所熟知的pCold-His的来源即可。在本发明实施例中，所述pCold-His购自湖南丰晖生物科技有限公司。

在本发明中，所述植物重组表达载体的构建方法，优选包括以下步骤：

以砀山酥梨叶片cDNA为模板，采用P1和P2引物对进行PCR扩增，得到去除信号肽的PCR产物；

采用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切分别对去除信号肽的PCR产物和骨架载体进行双酶切，得到酶切后的PCR产物和线性骨架载体；

将所述酶切后的PCR产物和线性骨架载体进行连接，得到植物重组表达载体。

在本发明中，所述P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:5(5’-atggagctcggtaccctcgagGCCGGAATTGCGATC-3’)所示；所述P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6(5’-agcagagattacctatct agaCTACGATTCATCTGC-3’)所示；其中小写字母表示用于构建表达载体的同源臂序列。所述PCR扩增的反应体系优选为50μL：Phusion超保真PCR MasterMix 25μL，10μM浓度Primer1-P1 1.5μL、10μM浓度Primer 1-P2 1.5μL，砀山酥梨叶片cDNA模板1μg，ddH₂O补充至50μL。所述PCR扩增的反应程序优选：：94℃3min；94℃，15s；58℃，15s；72℃，1min；72℃，5min；循环29次；4℃保持。获得去除信号肽的PCR产物后，优选进行纯化。本发明对所述纯化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的纯化方法即可，例如采用DNA产物纯化试剂盒完成。

在本发明中，所述双酶切的反应体系优选如下：两种限制性内切酶XbaI和XhoI各1μL，酶切反应缓冲液mix 5μL，载体质粒1μg，ddH₂O补充至50μL。所述双酶切的反应条件优选如下：在37℃，3小时。所述双酶切优选在恒温金属浴中进行。所述连接优选采用重组酶完成。本发明对所述重组酶的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的重组酶的种类即可。在本发明实施例中，所述重组酶购自诺唯赞同源重组酶。所述重组酶进行连接的反应体系优选如下：克隆产物4μL，载体片段3μL，同源重组反应缓冲液mix 2μL，重组酶1μL。所述重组酶进行连接的反应条件优选如下：在37℃,30分钟。所述连接优选在恒温金属浴中进行。

本发明提供了所述梨几丁质酶、所述基因PbrChiA或所述植物重组表达载体在提高植物抗病性中的应用。

在本发明中，所述植物抗病性中的病优选包括由葡萄球菌属(Botryosphaeria)病原菌引起的植物病害。所述由葡萄座腔菌属病原菌引起的植物病害优选包括果树轮纹病。所述果树轮纹病优选包括梨轮纹病和苹果轮纹病。所述梨轮纹病的病原菌为Botryosphaeria berengeriana。所述苹果轮纹病的病原为葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)。

在本发明中，所述提高植物抗病性的方法优选将所述基因PbrChiA以植物重组表达载体的形式导入植物中，使梨几丁质酶在植物中过表达。由于梨几丁质酶基因PbrChiA的表达量与梨品种轮纹病抗病性呈正相关，因此，通过转基因技术获得该梨几丁质酶基因PbrChiA过表达的转基因植株，可提高植物的抗病能力。在本发明中，几丁质酶通过催化真菌细胞壁几丁质的水解，使其原生质外渗，从而抑制真菌的生长与繁殖；水解产物寡聚糖又可以作为诱导因子启动植物进一步的防御反应，更进一步提高植物的抗真菌能力。

本发明提供了所述基因PbrChiA或所述植物重组表达载体在生产几丁质酶中的应用。

在本发明中，所述生产几丁质酶的方法，优选包括以下步骤：

将上述制备的植物重组表达载体导入原核表达系统中，得到重组菌；

将所述重组菌经过筛选培养和扩大培养得到菌液；

将所述菌液进行诱导培养，分离上清，经过纯化，得到重组表达的几丁质酶。

本发明对导入原核表达系统的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可，例如氯化钙热激法。

在本发明中，所述筛选培养采用含100μg/mL的卡那霉素5mL LB培养基进行振荡培养。所述振荡培养的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm。所述振荡培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述扩大培养优选采用将菌液进行倍比稀释后进行振荡培养。所述振荡培养优选培养至菌液的OD₆₀₀为0.6～0.8，更优选为0.7时结束。所述诱导培养优选在浓度为1mmol/L IPTG下进行。所述诱导培养的时间优选为18～22h，更优选为20h。所述诱导培养的温度优选为18～22℃，更优选为20℃。所述诱导培养的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm。

在本发明中，所述分离上清包括分离菌体、菌体破碎以及上清液的分离。

所述分离菌体的方法优选为在3～5℃、5500～6500rpm下离心8～12min，更优选为在4℃、6000rpm下离心10min。本发明对所述菌体破碎的方法没有特殊限制采用本领域所熟知的菌体破碎方法即可。在本发明实施例中，采用超声破碎菌体的方法进行，所述超声的功率优选为280～320W，更优选为300W。所述超声的间隔时间优选为超声处理4s/间隔6s。所述超声的时间优选持续20min。所述上清液的分离方法优选在4℃、12000rpm离心20min。

在本发明中，所述上清液优选采用AKTA蛋白纯化系统和HIS-TAG柱对重组蛋白进行蛋白纯化。结果表明，纯化后的重组蛋白溶液进行SDS-PAGE，获得85.7kDa的蛋白条带。

在本发明中，对生产的几丁质酶的酶解条件进行摸索，结果表明生产的几丁质酶优选在35℃、pH为8条件下比活力不低于14.85U/mg。因此，重组表达的几丁质酶可在食品、细胞等工业中应用。

下面结合实施例对本发明提供的一种梨几丁质酶、其编码基因及其在提高植物抗病中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；如果没有特别指出，本发明实施中的技术手段为本研究领域的常用技术，所用原料为市场所购。

实施例1

梨cDNA的制备

(1)梨总RNA的提取

取100mg梨叶片液氮研磨，按照天根RNA提取试剂盒说明书上的方法进行提取，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其完整度，微量分光光度计测量RNA含量与纯度。

(2)梨几丁质酶cDNA第一链的制备

反转录采用由全式金公司生产的反转录酶，反应体系为：1μg RNA，1μl Oligo(dT)，10μl 2xTS Reaction Mix，1μl RT/RI Enzyme Mix，1μl gDNA Remover，以RNase-free Water补齐反应体系至20μl。

反应条件为：42℃温浴30min；85℃加热5s终止反应，冷冻保存。

通过对比分析抗病、感病品种在轮纹病侵染前后的转录组数据，筛选得到一个受轮纹病侵染诱导而显著上调表达且在抗病品种中上调倍数更高的几丁质酶基因序列，命名为基因PbrChiA。

梨几丁质酶基因PbrChiA的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)，以下划线标记信号肽区域对应核苷酸序列：

ATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGCATCCAAAACACAAACCCTAGCCCTAACTCTGTCCCTCTT GATCCTCATTTCTTCATGCAAGTCCTCCCAAGCCGCCGGAATTGCGATCTATTGGGGCCAAAACGGTAACGAAGGAACCTTAGCGGATGCTTGCAACTCAGGCAACTACCAGTTTGTTAACATAGCTTTCCTCATTACTTTCGGAAACAACCAAACCCCTGTCCTAAACCTCGCCGGCCACTGCGACCCCGCCAGTGGTACTTGCACGGGGCTGAGTGCCGACATCAGAACCTGCCAATCAAAAAACATAAAAGTCCTCCTCTCGATTGGAGGGGCCTCCGGAAGTTACTCTCTCACTTCAGCTGATGATGCAAGGCAAGTTGCTGATTACATCTGGAACAACTTCTTAGGTGGTCAGTCAGCTTCGCGCCCGCTTGGGGACGCGGTTTTGGACGGCGTTGATTTCGACATTGAGGCGGGTGGTGGGCAATTCTATGATGAGCTCGCCAGGTCACTCAACGGACACAACGGACAGGCAAAAACGGTCTATTTAGCCGCAGCTCCACAATGTCCGATCCCGGATGCTCACCTAGACGGCGCTATCCAAACCGGTTTATTTGACTACGTTTGGGTTCAGTTCTACAACAACCCCCCATGCCAGTATGCTGACGGTAATGCCAACGCTCTTTTGAACAGTTGGAGCCAATGGGCCTCGGTTCCGGCCACCCAGGTATTCATGGGGTTACCGGCGTCCACTGATGCCGCGGGCAGCGGATTTATTCCTGCTGATGCTCTCAAGTCACAAGTCCTTCCAACAATTAAGAATTCGGCGAAGTATGGAGGAGTTATGCTTTGGAGCAGGTGGTATGACATTAACAGCGGTTATAGTGCATCCATTAAGGACAGCAGGATCCATCGAGCTCGAGCTGCAGATGAATCGTAG。

梨几丁质酶PbrChiA的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)，以下划线标记信号肽区域对应氨基酸序列：

MAMEASEFMASKTQTLALTLSLLILISSCKSSQAAGIAIYWGQNGNEGTLADACNSGNYQFVNIAFLITFGNNQTPVLNLAGHCDPASGTCTGLSADIRTCQSKNIKVLLSIGGASGSYSLTSADDARQVADYIWNNFLGGQSASRPLGDAVLDGVDFDIEAGGGQFYDELARSLNGHNGQAKTVYLAAAPQCPIPDAHLDGAIQTGLFDYVWVQFYNNPPCQYADGNANALLNSWSQWASVPATQVFMGLPASTDAAGSGFIPADALKSQVLPTIKNSAKYGGVMLWSRWYDINSGYSASIKDSRIHRARAADES。

实施例2

梨几丁质酶基因PbrChiA的引物设计

使用软件Primer 5.0进行引物设计，根据转录组文库筛选的几丁质酶基因PbrChiA序列设计引物，其中Primer 1用于扩增除信号肽对应区域外的基因全长及构建蛋白表达载体，小写字母表示用于构建表达载体的同源臂序列；Primer 2用于实时荧光定量PCR分析，以检测梨几丁质酶基因PbrChiA在不同抗性梨品种中的相对表达量：

Primer 1

P1:5’-atggagctcggtaccctcgagGCCGGAATTGCGATC-3’(SEQ ID NO:5)；

P2:5’-agcagagattacctatctagaCTACGATTCATCTGC-3’(SEQ ID NO:6)；

Primer 2

P1:5’-TGGGGCCAAAACGGTAAC-3’(SEQ ID NO:7)

P2:5’-TTTATGTTTTTTGATTGG-3’(SEQ ID NO:8)。

上述引物由上海生工生物工程有限公司合成。

实施例3

梨几丁质酶基因PbrChiA克隆与构建蛋白表达载体

(1)梨几丁质酶基因PbrChiA的PCR扩增

PCR扩增的反应体系为50μL：Phusion超保真PCR Master Mix 25μL，10μM浓度Primer 1-P1 1.5μL、10μM浓度Primer 1-P2 1.5μL，砀山酥梨叶片cDNA模板1μL，ddH₂O补充至50μL。

反应条件为：94℃3min；94℃，15s；58℃，15s；72℃，1min；72℃，5min；循环29次；4℃保持，电泳检测结果(见图1)。

(2)扩增产物回收

使用普通DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收。

(3)载体双酶切及回收

用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切载体pCold-His，回收载体骨架(约5700bp)。

(4)蛋白表达载体构建

对上述步骤(2)的克隆产物和步骤(3)的载体骨架利用诺唯赞同源重组酶进行连接，得到重组质粒pCold-PbrChiA。

实施例4

梨几丁质酶PbrChiA的表达与纯化

第一步，将重组质粒pCold-PbrChiA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pCold-PbrChiA的大肠杆菌，命名为重组菌；

第二步，挑选重组菌(表达含有His标签pCold-PbrChiA)的单克隆，接至含100μg/mL的卡那霉素5mL LB培养基在37℃、200rpm的振荡摇床中过夜培养；

第三步，将上述菌液以1:100的体积比接种至100mL LB含100μg/mL卡那霉素的液体培养基，37℃、200rpm的振荡培养至OD600达到0.6～0.8；

第四步，加入IPTG(诱导剂)至浓度为1mmol/L，20℃、200rpm振荡培养20h；

第五步，收集上述菌液到离心管中，4℃、6000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀；

第六步，向细菌沉淀中加入10mL 1X PBS缓冲液重悬菌体；

第七步，冰上超声破碎细菌，超声功率为300W，每次超声处理4s/间隔6s，共超声处理20min；

第八步，4℃、12000rpm离心20min，收集细菌裂解液上清，并置于冰上；

第九步，收集的上清液用AKTA蛋白纯化系统和该公司的HIS-TAG柱对重组蛋白进行蛋白纯化，纯化后的重组蛋白溶液进行SDS-PAGE，获得85.7kDa的蛋白条带(结果如图2所示)。

实施例5

梨几丁质酶PbrChiA酶学活性及性质研究

(1)蛋白含量测定

以牛血清白蛋白(BSA)为标准品绘制标准曲线，采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

(2)梨几丁质酶PbrChiA的酶活及最适反应温度测定

按照西格玛公司生产的几丁质酶活性测定试剂盒说明书的标准步骤对纯化后的梨几丁质酶PbrChiA进行酶学活性测定，其中反应时间均为1小时，反应温度设置如下梯度：15℃、25℃、35℃、45℃及55℃。结果如图3中(a)所示，梨几丁质酶PbrChiA的最适反应温度为35℃。

(3)梨几丁质酶PbrChiA的最适反应pH值测定

在与步骤(2)其他条件相同的条件下，反应温度设置为35℃，调整反应体系pH值为4至12的整数数值，并对梨几丁质酶PbrChiA进行没活测定。结果如图3中(b)所示，梨几丁质酶PbrChiA的最适反应pH值为8。

实施例6

梨几丁质酶基因PbrChiA在抗、感品种中表达分析

实验材料：抗病品种：砀山酥梨；感病品种为丰水梨^[1]；采用实施例1的方法提取样品材料RNA，经反转录，得到cDNA。

实时荧光定量PCR选Tubulin为内参，引物为实施例2中设计的Primer2；生物重复和技术重复各3个，根据Takara的SYBR Premix Plus说明书配制反应液，严格控制加样，采用2^-ΔΔCт法计算其相对表达量。

反应体系20μL，反应条件为：94℃，5min；循环反应是94℃，3秒；60℃，10秒；72℃，30秒；共45个循环。

如图4所示，实验结果表明，梨几丁质酶PbrChiA具有典型的几丁质酶活性，在反应温度为35℃、pH为8的条件下，梨几丁质酶的比活力为14.85U/mg。

梨几丁质酶基因PbrChiA的表达量与梨品种轮纹病抗病性呈正相关，抗性品种砀山酥梨中的表达量是感病品种丰水梨中表达量的4.5倍。由此可见，通过转基因技术获得该梨几丁质酶基因PbrChiA过表达的转基因植株，可提高植物的抗病能力，也可将其用于利用基因工程技术制备该几丁质酶应用到产业化中。

参考文献

1张璐,刘奇志,张国珍.6种梨果实对轮纹病的抗性差异及4种杀菌剂对轮纹病菌的抑菌作用[J].植物保护,2019,45(04):224-228.

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种梨几丁质酶、其编码基因及其在提高植物抗病中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 316

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Met Glu Ala Ser Glu Phe Met Ala Ser Lys Thr Gln Thr Leu

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Ser Leu Leu Ile Leu Ile Ser Ser Cys Lys Ser Ser

20 25 30

Gln Ala Ala Gly Ile Ala Ile Tyr Trp Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly

35 40 45

Thr Leu Ala Asp Ala Cys Asn Ser Gly Asn Tyr Gln Phe Val Asn Ile

50 55 60

Ala Phe Leu Ile Thr Phe Gly Asn Asn Gln Thr Pro Val Leu Asn Leu

65 70 75 80

Ala Gly His Cys Asp Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Gly Leu Ser Ala

85 90 95

Asp Ile Arg Thr Cys Gln Ser Lys Asn Ile Lys Val Leu Leu Ser Ile

100 105 110

Gly Gly Ala Ser Gly Ser Tyr Ser Leu Thr Ser Ala Asp Asp Ala Arg

115 120 125

Gln Val Ala Asp Tyr Ile Trp Asn Asn Phe Leu Gly Gly Gln Ser Ala

130 135 140

Ser Arg Pro Leu Gly Asp Ala Val Leu Asp Gly Val Asp Phe Asp Ile

145 150 155 160

Glu Ala Gly Gly Gly Gln Phe Tyr Asp Glu Leu Ala Arg Ser Leu Asn

165 170 175

Gly His Asn Gly Gln Ala Lys Thr Val Tyr Leu Ala Ala Ala Pro Gln

180 185 190

Cys Pro Ile Pro Asp Ala His Leu Asp Gly Ala Ile Gln Thr Gly Leu

195 200 205

Phe Asp Tyr Val Trp Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro Pro Cys Gln Tyr

210 215 220

Ala Asp Gly Asn Ala Asn Ala Leu Leu Asn Ser Trp Ser Gln Trp Ala

225 230 235 240

Ser Val Pro Ala Thr Gln Val Phe Met Gly Leu Pro Ala Ser Thr Asp

245 250 255

Ala Ala Gly Ser Gly Phe Ile Pro Ala Asp Ala Leu Lys Ser Gln Val

260 265 270

Leu Pro Thr Ile Lys Asn Ser Ala Lys Tyr Gly Gly Val Met Leu Trp

275 280 285

Ser Arg Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Gly Tyr Ser Ala Ser Ile Lys Asp

290 295 300

Ser Arg Ile His Arg Ala Arg Ala Ala Asp Glu Ser

305 310 315

<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggccatgg aggccagtga attcatggca tccaaaacac aaaccctagc cctaactctg 60

tccctcttga tcctcatttc ttcatgcaag tcctcccaag ccgccggaat tgcgatctat 120

tggggccaaa acggtaacga aggaacctta gcggatgctt gcaactcagg caactaccag 180

tttgttaaca tagctttcct cattactttc ggaaacaacc aaacccctgt cctaaacctc 240

gccggccact gcgaccccgc cagtggtact tgcacggggc tgagtgccga catcagaacc 300

tgccaatcaa aaaacataaa agtcctcctc tcgattggag gggcctccgg aagttactct 360

ctcacttcag ctgatgatgc aaggcaagtt gctgattaca tctggaacaa cttcttaggt 420

ggtcagtcag cttcgcgccc gcttggggac gcggttttgg acggcgttga tttcgacatt 480

gaggcgggtg gtgggcaatt ctatgatgag ctcgccaggt cactcaacgg acacaacgga 540

caggcaaaaa cggtctattt agccgcagct ccacaatgtc cgatcccgga tgctcaccta 600

gacggcgcta tccaaaccgg tttatttgac tacgtttggg ttcagttcta caacaacccc 660

ccatgccagt atgctgacgg taatgccaac gctcttttga acagttggag ccaatgggcc 720

tcggttccgg ccacccaggt attcatgggg ttaccggcgt ccactgatgc cgcgggcagc 780

ggatttattc ctgctgatgc tctcaagtca caagtccttc caacaattaa gaattcggcg 840

aagtatggag gagttatgct ttggagcagg tggtatgaca ttaacagcgg ttatagtgca 900

tccattaagg acagcaggat ccatcgagct cgagctgcag atgaatcgta g 951

<210> 3

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Met Glu Ala Ser Glu Phe Met Ala Ser Lys Thr Gln Thr Leu

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Ser Leu Leu Ile Leu Ile Ser Ser Cys Lys Ser Ser

20 25 30

Gln Ala

<210> 4

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggccatgg aggccagtga attcatggca tccaaaacac aaaccctagc cctaactctg 60

tccctcttga tcctcatttc ttcatgcaag tcctcccaag cc 102

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagctcg gtaccctcga ggccggaatt gcgatc 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agcagagatt acctatctag actacgattc atctgc 36

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggggccaaa acggtaac 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttatgtttt ttgattgg 18