阅读说明：本技术 一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法及应用 (A kind of method and application isolating and purifying prawn internal organ chitin excision enzyme ) 是由 谢晓兰 孙丽丹 王玲玲 吕凤娇 郑志福 于 2019-09-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物技术领域,具体公开了一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法及应用。本发明以对虾内脏为材料,研磨后用Tris-HCl缓冲液抽提得几丁质外切酶粗提液,再经过硫酸铵的分级分离、透析除盐、凝胶柱层析和阴离子交换柱层析纯化得到几丁质外切酶。本发明分离纯化所得的几丁质外切酶对大肠杆菌和金色葡萄球菌均具有一定的抑制作用,为进一步利用几丁质外切酶的研究、开发、生产工作奠定了基础。此外,本发明将对虾内脏中的几丁质外切酶加以开发利用,变废为宝,具有很好的推广应用前景。(The present invention relates to field of biotechnology, specifically disclose a kind of method and application for isolating and purifying prawn internal organ chitin excision enzyme.The present invention obtains the circumscribed enzyme extract of chitin with Tris-HCl buffer extractions after grinding using prawn internal organ as material, purifies to obtain chitin excision enzyme using the classification separation of ammonium sulfate, dialysis desalination, gel filtration chromatography and anion exchange chromatography.The present invention isolates and purifies resulting chitin excision enzyme and Escherichia coli and gold-coloured staphylococci is all had with certain inhibiting effect, further to be laid a good foundation using the research, exploitation, production work of chitin excision enzyme.In addition, the present invention is developed and used the chitin excision enzyme in prawn internal organ, turn waste into wealth, there is good popularization and application foreground.)

一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法及应用。

背景技术

几丁质酶是一种糖苷酶，能使几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺寡聚体或单体。狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个N-乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶，包括几丁内切酶和几丁外切酶。几丁质酶广泛分布在自然界中的微生物，以及昆虫、高等植物、甲壳动物甚至病毒中。几丁质酶能作用于甲壳素的分解过程，其作用在微生物、动物和植物中各不相同。几丁质酶在真菌、原生动物和非脊椎动物的生长和形态建成上有一定的作用。在部分细菌中，几丁质可作为碳源和能源，分解不溶的几丁质而将其作为营养物质。几丁质虽少量存在于酵母的细胞壁中，但几丁质酶是酵母细胞增殖细胞分离必须的物质。根据最新进展，几丁质酶在高等植物和脊椎动物中被认为是一种防卫蛋白。

几丁质酶催化几丁质水解后的产物有增强免疫力、抗肿瘤、降血压和降低胆固醇抗菌、调节机体免疫，抑制肿瘤细胞生长等生物特性，而在动物肠道中，氨基寡糖素和N-乙酰几丁寡糖还能调节微生物的代谢活动，改善肠道微生物种群分布，刺激有益菌群的生长，可开发成为乳酸菌的促进剂。这些降解产物的生物特性使得几丁质酶被大量用于环境保护、生物防治、食品加工等领域并表现出巨大的市场潜力。几丁质酶在保健中也具有重要作用，可用于增强抗真菌药物治疗真菌疾病的活性，因此可以添加在抗真菌乳膏和乳液中。

我国是虾养殖大国，其中对虾的养殖量占总量的一半以上。虽然各种各样的虾产品丰富了我们的餐桌，但是会产生大量的虾头、虾壳等副产物。如果不加以合理利用，会严重污染环境。虾头、虾壳等副产物含有丰富的几丁质外切酶，但是目前还未见分离纯化凡纳滨对虾内脏几丁质外切酶，并加以开发利用的相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法及其在抑菌方面的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法，包括如下步骤：

1)取新鲜的凡纳滨对虾，取其内脏，剪碎，加入石英砂研磨，研磨后加入预冷的缓冲液，放置于0-4℃环境中抽提，共抽提两次，得到几丁质外切酶粗提液；

2)于冰浴下，往几丁质外切酶粗提液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至35％饱和度，放置于0-4℃环境中抽提4h以上，离心，虹吸清液；

3)于冰浴下，往步骤2)得到的清液中，缓慢加入固体硫酸铵粉末至75％饱和度，放置于0-4℃环境中抽提4h以上，离心，弃去上清液，收集沉淀；

4)将上述沉淀溶于预冷的缓冲液中，使沉淀恰好溶解后，将其装入透析袋中，进行透析，浓缩透析后的酶液，得到浓缩的几丁质外切酶粗酶液；

5)取浓缩的几丁质外切酶粗酶液上平衡好的Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，用缓冲液洗脱，流速控制在0.4-0.6mL/min，收集洗脱液，每管收集2-3mL，在280nm波长下测定洗脱液的吸光度值，根据吸光度值选取管号测定酶活力，收集有酶活力的样品并混合得到混合酶液；

6)将上述混合酶液上平衡好的DEAE-52阴离子交换柱，用含2mol/L NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，流速控制在0.2-0.3mL/min，收集洗脱液，每管收集2-3mL，在280nm波长下测定洗脱液吸光度值，根据吸光度值选取管号测定酶活力，收集有酶活力的样品并混合，得到几丁质外切酶。

进一步的，步骤1)、步骤4)-步骤6)中，所述的缓冲液为0.01mol/L Tris-HCl缓冲液，其pH为7.5。

步骤1)所述抽提具体如下：按1g:3mL的比例往研磨后的对虾内脏中加入预冷的缓冲液，放置于0-4℃环境中进行一次抽提1h以上，离心，虹吸清液，再将离心后的沉淀按1g:1.5mL的比例加入预冷的缓冲液，放置于0-4℃环境中进行二次抽提1h以上，离心，虹吸清液，混合两次抽提所得清液，浓缩透析后的酶液，得到几丁质外切酶粗提液。

步骤4)所述透析具体如下：将透析袋置于装有同种缓冲液的烧杯中，在磁力搅拌条件下进行透析，每隔1-8h更换新的同种缓冲液直至无SO₄ ^2-被检出为止，得到浓缩的几丁质外切酶粗酶液。

步骤1)-步骤3)中，所述离心是在0-4℃、转速12000-15000r/min下离心30-35min

本发明以对虾内脏为材料，研磨后用Tris-HCl缓冲液抽提得几丁质外切酶粗提液，再经过硫酸铵的分级分离、透析除盐、凝胶柱层析和阴离子交换柱层析纯化得到几丁质外切酶。本发明的有益效果：本发明分离纯化所得的几丁质外切酶对大肠杆菌和金色葡萄球菌均具有一定的抑制作用，为进一步利用几丁质外切酶的研究、开发、生产工作奠定了基础。此外，本发明将对虾内脏中的几丁质外切酶加以开发利用，变废为宝，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱图谱；

图2为DEAE-52阴离子交换柱层析的洗脱图谱；

图3为几丁质外切酶蛋白吸收峰；

图4为几丁质外切酶激发光谱；

图5为几丁质外切酶发射光谱；

图6为几丁质外切酶电泳成像；

图7为蛋白质分子量标准曲线；

图8为几丁质外切酶对大肠杆菌的抑菌效果，(a)为未加酶液的培养基，(b)为加几丁质外切酶液的培养基；

图9为几丁质外切酶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，(a)为未加酶液的培养基，(b)为加几丁质外切酶液的培养基。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步详细说明本发明的实质内容和有益效果，这些实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。此外，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

一种分离纯化对虾内脏几丁质外切酶的方法，包括如下步骤：

1)取新鲜的凡纳滨对虾，取其内脏，剪碎，加入石英砂研磨，然后按1g:3mL的比例往研磨后的对虾内脏中加入预冷的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，放置于0-4℃环境中进行一次抽提1h以上，于0-4℃、转速12000-15000r/min下离心30-35min，虹吸清液，再将离心后的沉淀按1g:1.5mL的比例加入预冷的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，放置于0-4℃环境中进行二次抽提1h以上，于0-4℃、转速12000-15000r/min下离心30-35min，虹吸清液，混合两次抽提所得清液，得到几丁质外切酶粗提液；

2)于冰浴下，往几丁质外切酶粗提液中缓慢加入固体硫酸铵粉末至35％饱和度，放置于0-4℃环境中抽提4h以上，离心，虹吸清液；

3)于冰浴下，往步骤2)得到的清液中，缓慢加入固体硫酸铵粉末至75％饱和度，放置于0-4℃环境中抽提4h以上，离心，弃去上清液，收集沉淀；

4)将上述沉淀溶于预冷的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，使沉淀恰好溶解后，将其装入透析袋中，将透析袋置于装有同种缓冲液的烧杯中，在磁力搅拌条件下进行透析，每隔1-8h更换新的同种缓冲液直至无SO₄ ^2-被检出为止(用BaCl₂溶液检验)，浓缩透析后的酶液，得到浓缩的几丁质外切酶粗酶液；

5)取浓缩的几丁质外切酶粗酶液上平衡好的Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗脱，流速控制在0.4-0.6mL/min，收集洗脱液，每管收集2-3mL，在280nm波长下测定洗脱液的吸光度值，根据吸光度值选取管号测定酶活力，收集有酶活力的样品并混合得到混合酶液；

6)将上述混合酶液上平衡好的DEAE-52阴离子交换柱，用含2mol/L NaCl的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)进行梯度洗脱，流速控制在0.2-0.3mL/min，收集洗脱液，每管收集2-3mL，在280nm波长下测定洗脱液吸光度值，根据吸光度值选取管号测定酶活力，收集有酶活力的样品并混合，得到几丁质外切酶。

实施例1几丁质外切酶粗酶液的制备

从新华都超市购买新鲜的对虾，取其内脏，剪碎，加入适量石英砂研磨。按1g:3mL(质量:体积)加入预冷的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，放置冰箱(4℃)中抽提1h以上，于4℃、转速12000r/min下离心30min，虹吸清液。再将离心后的沉淀进行二次抽提，即按1g:1.5mL(质量:体积)加入预冷的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，放置冰箱(4℃)中抽提1h以上，于4℃、转速12000r/min下离心30min，虹吸清液。混合两次抽提所得清液，得到几丁质外切酶粗提液。

实施例2几丁质外切酶粗酶液的分离纯化

2-1硫酸铵的分级分离

于冰浴下，边搅拌边往几丁质外切酶粗提液中缓慢加入研细的固体硫酸铵粉末至35％饱和度(按0℃下，每100mL加固体硫酸铵粉末19.4g)，放置冰箱(4℃)中抽提4h以上，于4℃、转速12000r/min下离心30min，虹吸清液。于冰浴下，往清液中，边搅拌边缓慢加入研细的固体硫酸铵粉末至75％饱和度(按0℃，每100mL加固体硫酸铵25.4g)，放置冰箱(4℃)中抽提4h以上，于4℃、转速12000r/min下离心30min，弃去上清液，收集沉淀。

2-2(除盐)

将上述沉淀溶于适量预冷的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，使沉淀恰好溶解后，将其装入透析袋中，置于装有大量同种缓冲液的烧杯中，在磁力搅拌条件下进行透析，隔适当时间(1-8h)更换新的同种缓冲液直至无SO₄ ^2-被检出为止(用BaCl₂溶液检验)。浓缩透析后的酶液，得到浓缩的几丁质外切酶粗酶液。

2-3Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱层析

Sephadex G-100葡萄糖凝胶预处理：根据柱(规格为40×2.6cm)体积，取一定量Sephadex G-100粉末浸泡在适量去离子水中，于沸水浴下煮5h，使其充分溶胀。小心倾去凝胶上层水和细小颗粒，用蒸馏水反复洗几次至pH至中性，再用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗2-3次。

上样、洗脱和收集(4℃)：取浓缩的几丁质外切酶粗酶液上事先用0.01mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的Sephadex G-100柱，用同种缓冲液洗脱，流速控制在0.4-0.6mL/min，收集洗脱液，每管2-3mL，在280nm波长下测定吸光度值。根据280nm波长下的吸光度值选取管号测定酶活力(有峰的位置每隔2-3管取一管，其它每隔5管取一管)。收集有酶活力的样品并混合，得到混合酶液。Sephadex G-100凝胶柱层析的洗脱图谱如图1所示。

2-4DEAE-52阴离子交换柱层析(梯度洗脱)

DEAE-52(已预处理)活化：根据柱(规格为30.5×1.6cm)体积，取一定量已经预处理的DEAE-52，用蒸馏水洗几次至pH为中性，再用0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗2-3次。

上样、洗脱和收集(4℃)：将收集的有酶活力的混合酶液上事先用0.01mol/LTris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的DEAE-52柱，先用同种缓冲液淋洗，再用含2mol/L NaCl的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)缓冲液进行梯度洗脱，流速控制在0.2-0.3mL/min，收集洗脱液，每管2-3mL，在280nm波长下测定吸光度值。根据280nm波长下的吸光度值选取管号测定酶活力(有峰的位置每隔2-3管取一管，其它每隔5管取一管)。收集有酶活力的样品并混合，得到几丁质外切酶。DEAE-52阴离子交换柱层析的洗脱图谱如图2所示。

实施例3几丁质外切酶活力和比活力的测定

3-1几丁质外切酶蛋白浓度测定

采用BCA法测定酶浓度。将标准蛋白溶液按0、1、2、4、6、8、10μL于96孔板中，加蒸馏水补足到10μL，将样品稀释适当倍数，取10μL稀释过的样品加入96孔板，每个测定做2个平行。向待测样品孔和蛋白标准品中加入200μL配制好的BCA工作液混匀。于37℃下保温30min。用全波段酶标仪测562nm处的波长，测得标准曲线后，分别将样品所测的波长平均值代入，得到酶蛋白含量，如表1所示。

表1凡纳滨对虾内脏几丁质酶的纯化结果

3-2 1％胶体几丁质的制备

用剪刀将片状几丁质边缘较硬的部分剪掉，再将其剪成小片。称取5.0g剪碎的几丁质，置于50mL磷酸溶液(85％)中，在室温下放置2d后，用去离子水进行多次冲洗，直至pH大于5.0。用高速组织捣碎机将其捣碎，再用去离子水定容，使它的浓度为1％。

3-3还原糖标准曲线的绘制

配制1.0mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖标准液，将100mg分析纯N-乙酰氨基葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重)，溶于去离子水中，然后定容至100mL容量瓶，配制成浓度为1.0mg/mL。按表2方案，往试管中加入相应量试剂(做2组平行试验)，将各管摇匀后，在沸水浴中加热5min，取出后迅速用冷水冷却至室温，再向每管加入21.5mL去离子水，摇匀。用0号试管作为参比，于500nm波长下测定吸光度。以N-乙酰氨基葡萄糖相当量(mg)为横坐标，吸光度值A_500nm为纵坐标，绘制标准曲线。得标准曲线回归方程Y＝0.5683X，R²＝0.9938。

表2各试管加溶液和试剂的量

3-4几丁质外切酶活力的测定

几丁质外切酶与胶体几丁质反应生成N-乙酰氨基葡萄糖(还原糖)。分别取1％胶体几丁质200μL和0.1mol/L pH 6.0磷酸缓冲液200μL于试管中混合，在45℃水浴下预热10min，再加入200μL几丁质外切酶液，在45℃水浴中恒温反应1h后，转移至沸水浴中反应20min后将其放置在冰块中使其迅速冷却，冷却几分钟后再加入600μL的DNS试剂，再转移至沸水浴中反应20min，取出试管，静置至其冷却到室温，再用水定容到10mL，摇匀后，于转速10000r/min离心10min，取上清液，用玻璃比色皿在500nm波长下测定其吸光度值，空白对照为不加几丁质外切酶。以还原糖的生成速度来测定酶活性大小。还原糖含量根据3-3的实验方法测定。最终得到提纯约8.23倍，比活力为14.15U/mg的几丁质外切酶液。

实施例4紫外光谱分析

取适量已分离纯化的几丁质外切酶液，用紫外分光光度计，在200-400nm波长下扫蛋白吸收峰。结果见图3。由图3可知，280nm波长为几丁质外切酶的蛋白吸收峰。

实施例5荧光光谱分析

4-1激发光谱测定

固定发射波长为343nm，使用荧光分光光度计，在200-330nm波长扫描激发光谱。结果见图4。由图可知，在280nm处，有最大荧光强度。

4-2内源荧光发射光谱测定

固定激发波长为270nm，使用荧光分光光度计，在280-500nm波长扫描内源荧光发射光谱。结果见图5。由图可知，在344nm处，有最大荧光强度。

实施例6SDS-PAGE电泳分析几丁质外切酶分子组成

采用考马斯亮蓝染色法分析几丁质外切酶的分子组成，具体操作流程如下：

(1)制分离胶：按照表3配制10％分离胶，将分离胶用移液枪打入制胶器中，预留出1-2cm，注入蒸馏水液封，在室温下放置40-60min，待其凝固。

表3制浓度为10％分离胶所需各成分的体积

(2)制浓缩胶：按照表4配制5％浓缩胶。先将制胶器中的蒸馏水倒出，再用移液枪打入浓缩胶，并***树脂道，在室温下放置15-30min，待其凝固。

表4配置浓度为5％浓缩胶所需各成分的体积

(3)上样：先拔下树脂道，再分别往泳道加入marker 2.5μL及已配好的样品(已纯化的几丁质外切酶)20μL(样品：5×Loading Buffer＝4:1)。

(4)电泳：在电压为80V，电流为无限大下工作15min。之后调节电压为100V，电流为无限大下工作1.5小时。当凝胶内的溴酚兰距离凝胶底部1cm时即可结束电泳，进行考马斯亮蓝染色30min，之后将考马斯亮蓝染色液回收，使用脱色液(乙酸：甲醇：蒸馏水＝1:1:8)洗凝胶块直至其变透明后，于成像仪成像。

取经DEAE-52阴离子交换柱纯化后酶活力较高的两管样品，根据上述实验方法进行电泳分析。结果见图6和图7。图7中lgMr-Rf直线(Y＝-1.3354X+2.2514，R²＝0.9760)，根据条带的迁移率计算出该酶由分子量分别约为33.1kDa和43.9kDa的两个不同亚基组成。

实施例7几丁质外切酶的抑菌效应

点燃酒精灯，使整个操作过程在火源旁进行，避免污染，且整个过程在洁净工作台进行。将固体培养基分别倒入培养皿中，往装有生理盐水的试管中分别移入1mL大肠杆菌菌液和金色葡萄球菌菌液，再分别将菌液稀释到一定倍数后，分别移入2mL 17.068mg/mL分离纯化所得的几丁质外切酶(已无菌处理)，将其与菌液混匀后(终体积为10mL)，取100μL于培养皿上，用涂布棒将其涂匀，使其均匀分布在固体培养基上，将其倒扣置于恒温培养箱(37℃)中培养20h后观察现象，并用菌落计数仪计数，每组做三个平行实验。

结果如图8和图9所示：几丁质外切酶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌效果。