阅读说明：本技术 一种提高梭热杆菌纤维素酶产量发酵方法 (Fermentation method for increasing yield of Thermobacteroides cellulase ) 是由 邓禹 毛银 陆春波 卫亚峰 李国辉 赵运英 周胜虎 于 2019-09-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高梭热杆菌纤维素酶产量发酵方法,属于发酵过程领域。本发明对梭热杆菌进行发酵工艺的优化,使纤维素酶的酶活由10.85U/mL提高到16.56U/mL,纤维素酶活比未优化前提高了52％。并根据菌体生长情况,进行补料添加碳源,大大提高了其纤维素酶活,并节省了成本,适合工业化生产。本发明制作的酶制剂具有极高的耐热性和耐湿性,且在保藏三个月之后,酶活力依然保持在90％以上,适合工业化生产。(The invention discloses a fermentation method for increasing yield of a clostridium cellulolytic enzyme, and belongs to the field of fermentation processes. The invention optimizes the fermentation process of the clostridium thermocellum, so that the enzyme activity of the cellulase is improved to 16.56U/mL from 10.85U/mL, and the cellulase activity is improved by 52 percent compared with that before the optimization. And according to the growth condition of the thalli, a carbon source is supplemented and added, so that the cellulase activity of the thalli is greatly improved, the cost is saved, and the method is suitable for industrial production. The enzyme preparation prepared by the invention has extremely high heat resistance and moisture resistance, and the enzyme activity is still kept above 90% after the enzyme preparation is stored for three months, so that the enzyme preparation is suitable for industrial production.)

一种提高梭热杆菌纤维素酶产量发酵方法

技术领域

本发明涉及一种提高梭热杆菌纤维素酶产量发酵方法，属于发酵工程领域。

背景技术

木质纤维素原料来源广泛，是储量丰富的可再生资源。纤维素酶是一类能够降解纤维素为葡萄糖的一组酶的总称，木质纤维素可以通过纤维素酶水解产生糖，可以直接用于微生物的发酵，能够将纤维素转化为有价值的初级代谢产物，纤维素酶常被应用于食品及饲料工业、造纸工业、医药方面、生物能源等行业，具有良好的应用前景。

生产纤维素酶的菌包括细菌、真菌、放线菌等，在这些微生物中有一种叫梭热杆菌的，以其高纤维素分解活性而闻名，纤维素降解速率与里氏木霉相当。具有可利用底物广泛，环境适应性强，不易污染等特点，其自身可以产生一种降解纤维素的复杂酶系，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、半纤维素酶等，是具有积极经济影响的最大潜力的菌株。

目前纤维素酶的应用常常受限于其高昂的生产成本，纤维素酶生产成本之所以高昂的原因主要集中在两个方面，首先产纤维素酶的菌株，它的酶活不高，远远达不到生产的要求，所以筛选出高纤维素酶活的菌株是一个关键点。第二点，目前经常使用的菌株为里氏木霉，产酶能力与梭热杆菌相当，但由于其特性和培养条件等因素，使得纤维素酶发酵时间很长，且效率低，导致其成本过高，目前采用液体发酵生产纤维素酶适合于大规模生产，但目前发酵液酶活低，导致液体法生产的纤维素酶产品价格偏高，限制了其在工业上的广泛应用。

发明内容

本发明提供了一种提高梭热杆菌的纤维素酶产量的发酵方法，所述方法是控制发酵温度50～60℃，初始pH6.5～8，发酵48～72h，并于发酵16h开始进行连续补料。

在本发明的一种实施方式中，所述补料是补加碳源。

在本发明的一种实施方式中，所述补料是补加纤维二糖。

在本发明的一种实施方式中，所述补料是控制流速为4～6mL/h，所述纤维二糖溶液浓度为180～250g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵按1～2％的接种量接种种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液是将菌种按照1～2％的接种量接种到种子培养基中，50～60℃活化培养2～3代，获得种子液。

在本发明的一种实施方式中，所述种子液在种子培养基中培养，所述种子培养基含有：纤维二糖10g/L，玉米浆12g/L，柠檬酸三钾盐2g/L，一水柠檬酸1.25g/L，硫酸钠lg/L，磷酸二氢钾lg/L，碳酸氢钠2.5g/L，氯化铵1.5g/L，尿素5g/L，酵母抽提物lg/L，六水氯化镁50g/L，四水氯化亚铁0.1g/L，二水氯化钙0.2g/L，一水半胱氨酸盐酸盐lg/L，二盐酸吡哆胺0.02g/L，对氨基苯甲酸0.004g/L，D-生物素0.002g/L，维生素B12 0.02g/L，维生素Bl0.002g/L。

在本发明的的一种实施方式中，用于发酵的发酵培养基含有：纤维二糖10g/L，10g/L的微晶纤维素，玉米浆12g/L，柠檬酸三钾盐2g/L，一水柠檬酸1.25g/L，硫酸钠lg/L，磷酸二氢钾lg/L，碳酸氢钠2.5g/L，氯化铵1.5g/L，尿素5g/L，酵母抽提物lg/L，六水氯化镁50g/L，四水氯化亚铁0.1g/L，二水氯化钙0.2g/L，一水半胱氨酸盐酸盐lg/L，二盐酸吡哆胺0.02g/L，对氨基苯甲酸0.004g/L，D-生物素0.002g/L，维生素B12 0.02g/L，维生素Bl0.002g/L。

本发明的第二个目的是提供一种制备纤维素酶制剂的方法，所述方法应用所述发酵方法制备纤维素酶，再将酶液进行浓缩，加入保护剂。

在本发明的一种实施方式中，所述保护剂乳糖、脱脂乳。

在本发明的一种实施方式中，将纤维素酶与终浓度为3～5％乳糖、3～5％脱脂乳混合，冷冻干燥后制备获得纤维素酶制剂。

本发明有益效果：本发明对梭热杆菌进行发酵工艺的优化，本发明对发酵培养条件进行了优化，大大提高了其纤维素酶活，从原来的10.85U/mL提高到16.56U/mL，根据菌体生长情况，适时对其进行补料添加，大大提高了其纤维素酶活，并节省了成本，适合工业化生产。本发明制作的酶制剂具有极高的耐热性和耐湿性，且在保藏三个月之后，酶活力依然保持在90％以上，适合工业化生产。

附图说明

图1梭热杆菌酶生长曲线；

具体实施方式

1、种子培养基：纤维二糖10g/L，玉米浆12g/L，柠檬酸三钾盐2g/L，一水柠檬酸1.25g/L，硫酸钠lg/L，磷酸二氢钾lg/L，碳酸氢钠2.5g/L，氯化铵1.5g/L，尿素5g/L，酵母抽提物lg/L，六水氯化镁50g/L，四水氯化亚铁0.1g/L，二水氯化钙0.2g/L，一水半胱氨酸盐酸盐lg/L，二盐酸吡哆胺0.02g/L，对氨基苯甲酸0.004g/L，D-生物素0.002g/L，维生素B₁₂0.02g/L，维生素B_l 0.002g/L，pH值自然。

2、菌株活化：将菌种按照1％的接种量接种到种子培养基中，60℃活化培养，按照同样的方式活化2-3代，继续于种子培养基中培养，得到梭热杆菌的菌液。

3、发酵培养基：在种子培养基的基础条件下，添加10g/L的微晶纤维素。

4、将种子液按照2％的接种量接种到发酵培养基中，60℃发酵培养72h，发酵结束测定酶活。测定酶活为3.41U/mL。

5、酶活测定(滤纸酶活)：取50mg滤纸，加1ml pH 6 0.1mol/L柠檬酸缓冲液，加入适当稀释酶液0.5ml，50℃反应1h，加入3ml DNS试剂测糖。以上酶活均扣除发酵液中的还原糖后计算酶活力，酶活采用国际单位，其定义为每min水解生成1μmol葡萄糖的酶量为1个活力单位。

实施例1不同发酵温度下制备纤维素酶

设置不同的发酵温度，分别为30、40、50、55、60℃，发酵72h，发酵结束后测定纤维素酶活。结果如表1所示，发现该菌在50～60℃的条件下相对酶活可达90％以上。

表1不同发酵温度对酶活影响

实施例2不同发酵时间下制备纤维素酶

设置不同的培养时间，分别为24h、48h、60h、72h、84h、96h，60℃培养，发酵结束后测定纤维素酶活。结果如表2所示，随着发酵时间的增加，酶活力呈上升趋势，发酵至60h酶活力达到峰值，96h酶活开始下降。所以发酵进行60h后停止，可以大大节约发酵成本。

表2不同发酵时间对酶活影响

实施例3不同初始pH下制备纤维素酶

控制其他条件不变，设置不同的培养基初始pH，分别为5.5、6、6.5、7、7.5、8，60℃发酵72h，发酵结束测定纤维素酶活。结果如表3所示，当培养基初始pH为6.5～8时，相对酶活可达90％以上。

表3不同培养基初始pH对酶活影响

实施例4发酵制备纤维素酶

按照上述优化条件即在55℃，初始培养基pH为7的条件下发酵60h，测得酶活为5.12U/mL，为未优化的1.5倍

实施例5放大工艺下的纤维素酶发酵法

吸取200μL的甘油管保藏菌株，转接到25mL的种子培养基，55℃恒温培养，活化菌株，将活化的菌株按照2％的接种量转接到50mL发酵培养基，55℃恒温培养24h，得到一级种子液。

发酵培养基：纤维二糖10g/L，微晶纤维素10g/L，玉米浆12g/L，柠檬酸三钾盐2g/L，一水柠檬酸1.25g/L，硫酸钠lg/L，磷酸二氢钾lg/L，碳酸氢钠2.5g/L，氯化铵1.5g/L，尿素5g/L，酵母抽提物lg/L，六水氯化镁50g/L，四水氯化亚铁0.1g/L，二水氯化钙0.2g/L，一水半胱氨酸盐酸盐lg/L，二盐酸吡哆胺0.02g/L，对氨基苯甲酸0.004g/L，D-生物素0.002g/L，维生素B₁₂ 0.02g/L，维生素B_l 0.002g/L，pH值自然。115℃湿热灭菌。

灭菌结束后，向发酵罐通入氮气，除去培养基及罐内氧气。调节培养pH恒定为7，罐温控制为55℃，然后接入一级种子液，停止通气，间歇式搅拌以防止菌体沉淀。发酵结束后测得酶活为12.37U/mL，是未控制pH状态酶活的1.14倍。

实施例6分批发酵制备纤维素酶

由于连续流加发酵易污染杂菌，退化高，且应用范围小，所以对分批和补料分批发酵的方法进行的研究。

分批发酵：将保藏的菌株接种到种子培养基中，然后以2％的接种量接种到发酵培养基中，得到一级种子液，将种子液以5％的接种量接种到装有2L发酵培养基的5L发酵罐中，厌氧培养，罐温控制为55℃，调节pH为7，间歇式搅拌。发酵60h酶活为12.37U/mL。

实施例7不同补料时间下补料分批发酵制备纤维素酶

将菌株接种到种子培养基中，然后以2％的接种量接种到发酵培养基中，得到一级种子液，将种子液以5％的接种量接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，厌氧培养，罐温控制为55℃，调节pH为7，间歇式搅拌。根据菌体生长情况和糖耗情况，分别在发酵开始后的16h、20h、24h时间点开始向发酵体系中缓慢添加纤维二糖溶液，流速为6mL/h，上述纤维二糖溶液浓度为200g/L。比较产酶情况，0～12h糖耗和生长情况较缓慢，进入16h后，菌体快速生长和糖耗进入快速消耗阶段，所以选择16h、20h、24h作为补料点。通过比较了不同补料时间点的产酶情况，发现从16h的点开始补料，酶活最高，另外发酵48h后，菌体到达稳定期，糖耗变缓，此时补料意义不大，所以补料至48h。确定补料时间为16～48h。

表5不同补料时间点对酶活影响

实施例8补料不同碳源条件下补料分批发酵制备纤维素酶

将保藏的菌株接种到种子培养基中，然后以2％的接种量接种到发酵培养基中，得到一级种子液，将种子液以5％的接种量接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，厌氧培养，罐温控制为55℃，调节pH为7，间歇式搅拌。发酵第16h～48h时间段内，分别添加纤维二糖、微晶纤维素、木聚糖溶液，流速为6mL/L，上述碳源溶液浓度为200g/L，发酵至60h。比较产酶情况，具体见表5，结果显示纤维二糖为最佳补料碳源。

表5不同培养基初始pH对酶活影响

实施例9补料分批发酵制备纤维素酶

将菌株接种到种子培养基中，然后以2％的接种量接种到发酵培养基中，得到一级种子液，将种子液以5％的接种量接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，厌氧培养，罐温控制为55℃，调节pH为7，间歇式搅拌。在发酵开始后的16h-48h时间段内向发酵体系中缓慢添加纤维二糖溶液，流速为6mL/h，上述纤维二糖溶液浓度为200g/L，发酵至60h。发酵结束后测定发酵液酶活，测得酶活为16.56U/mL，以发酵过程中不进行任何控制的情况作为对照，经过比较，采用本发明发酵工艺测得的酶活相对于对照提高了52.62％。

实施例10不同菌株在补料分批发酵条件下制备纤维素酶

将购得的梭热杆菌ATCC 27405，BNCC 134251，BNCC 340971，按照上述所述方式进行上罐发酵，55℃，恒定pH控制为7，16～48h缓慢添加纤维二糖溶液，流速为6mL/h，上述纤维二糖溶液浓度为200g/L，发酵至60h，与发酵过程不做任何控制进行对比，酶活情况见表6，由表可知经过上述工艺，酶活分别提高了52.1％，50.9％，53.4％。

表6不同菌株发酵优化后酶活情况

实施例11酶制剂的制备

酶制剂的制备：将发酵液进行固液分离，去除菌体，将滤液通过旋转蒸发仪在常温条件下进行浓缩至原体积的30％～40％，例如浓缩至原体积的20％，然后进行硫酸铵沉淀，先加入30％饱和硫酸铵静置3h，去沉淀，再加入60％饱和度硫酸铵，静置6h，去上清得到纤维素酶粗品，然后对它进行凝胶层析进行纯化，先用蒸馏水平衡，再将上一步得到的酶液过柱，用0.2mol/L磷酸缓冲液洗脱出来，加入5％乳糖，5％脱脂乳(按质量计)作为保护剂，-80℃预冷后，进行冷冻干燥后得到纤维素酶制剂，酶活为2100000U/g。

酶制剂作为生物活性物质，其活性发挥作用是关键点，所以对其热稳定性实验和耐湿热性实验，实验参考王斐英等发表的《饲料添加剂烟酸稳定性试验研究》实验方案进行。结果见表7，8，9可以看出该酶制剂有着极佳的耐热性和耐湿性，且在储藏三个月后酶活依然保持在90％以上。

表7酶制剂的耐热性测试

表8酶制剂的耐湿性测试

表9酶制剂的保藏实验

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。