一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用
阅读说明：本技术 一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用 (Chitinase and AfChi18 gene as well as expression method and application thereof ) 是由 杨登峰 伍雅励 潘丽霞 阳丽艳 李红亮 于 2021-10-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用,属于基因工程技术领域。本发明提供的几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,编码所述几丁质酶的AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,本发明还提供了包含AfChi18基因的重组质粒以及用于表达所述重组质粒的重组菌株。本发明提供的几丁质酶为典型的几丁质内切酶,大小为40KDa,该几丁质酶的最适反应温度为45℃,在20℃～50℃范围内热稳定性好；最适pH为5.0,在pH4.0～6.0具有较高的酶活,表明本发明提供的几丁质酶具有较高的稳定性。(The invention provides chitinase and AfChi18 genes and an expression method and application thereof, belonging to the technical field of genetic engineering. The amino acid sequence of the chitinase is shown as SEQ ID No.1, the nucleotide sequence of the AfChi18 gene for coding the chitinase is shown as SEQ ID No.2, the invention also provides a recombinant plasmid containing the AfChi18 gene and a recombinant strain for expressing the recombinant plasmid. The chitinase provided by the invention is a typical chitinase endonuclease, the size of the chitinase is 40KDa, the optimal reaction temperature of the chitinase is 45 ℃, and the thermal stability is good within the range of 20-50 ℃; the optimum pH value is 5.0, and the chitinase has higher enzyme activity at the pH value of 4.0-6.0, which shows that the chitinase provided by the invention has higher stability.)
技术领域
本发明涉及基因工程的技术领域，尤其涉及一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用。
背景技术
几丁质又称壳多糖(chitin)，分子式为[C8H13O5N]n。为N-乙酰葡糖胺(N-acetyl-D-glcnac-glucosamine)通过β-1,4糖苷键连接聚合而成的结构同多糖，广泛存在于甲壳类动物的外壳、昆虫的甲壳和真菌的胞壁中，虾壳中的几丁质含量为25％左右，从虾壳中提取甲壳素的成本低、产量高。几丁质作为一种重要的生物资源，在地球上含量仅次于纤维素，年自然生产量为1011吨，是一种巨大的可再生资源。近些年来，几丁质的绿色应用已经成为科研热点。
几丁质的降解产物是高附加值的几丁质寡糖、几丁质单糖及其对应衍生物等，具有抗微生物、抗氧化、基因治疗、免疫细胞增殖和肿瘤生长抑制的作用，作为添加剂被广泛应用于饲料和食品中。几丁质寡糖在现阶段的制备方法有化学提取法，壳寡糖乙酰化法。化学提取法一般使用的是酸水解法，利用强酸降解几丁质为氨基葡萄糖，经乙酰化后获得N-乙酰氨基葡萄糖；或用稀酸直接降解几丁质生成几丁质寡糖。化学提取法反应剧烈，成本高，而且环境污染严重，几丁质寡糖产物聚合度低。为了迎合国家绿色可持续发展政策，生物酶法绿色降解几丁质现已成为科研热点。生物酶法降解几丁质制备几丁质寡糖，具有反应过程温和，生物活性好以及高效利用废弃物甲壳资源的优点。
几丁质酶按照糖苷键的切割方式可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶及N-乙酰葡萄糖苷酶。内切几丁质酶可随机作用于几丁质长链的任何一个糖苷键，并将它水解成几丁质寡糖。外切几丁质酶与内切几丁质酶不同，其可从几丁质糖链非还原末端将几丁质降解为(GlcNAc)2。然而N-乙酰葡萄糖苷酶不能直接作用于几丁质，只能将几丁质寡糖水解生成GlcNAc。几丁质酶将废弃物几丁质降解生成几丁质寡糖，反应条件温和，绿色环保及其原料低成本和高产出，完全符合工业生产要求。
因此，挖掘具有高酶活的新型几丁质酶和高效利用生物质多糖具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种几丁质酶，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种编码所述几丁质酶的AfChi18基因，所述AfChi18基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供了一种重组质粒，所述重组质粒包括编码所述几丁质酶的AfChi18基因的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组菌株，所述重组菌株表达所述的重组质粒。
本发明还提供了一种所述几丁质酶的表达方法，包括如下步骤：
(1)将AfChi18基因与质粒载体连接，得到重组质粒；
(2)将所述重组质粒转化至克隆菌株，得到重组克隆菌株；
(3)提取所述重组克隆菌株中的质粒，转化至表达菌株，得到重组表达菌株；
(4)将重组表达菌株进行诱导培养，收集菌体破碎，得到几丁质酶。
优选的，所述AfChi18基因的扩增引物如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
优选的，所述质粒载体为pET28a，所述克隆菌株为E.coli DH5α，所述表达菌株为E.coli BL21 DE3 codonplus RIL。
优选的，步骤(5)中所述诱导培养是将重组表达菌株接入含有卡那霉素的第一LB培养基中在36～38℃下培养12～18h，再按照1％v/v的接种量接种至含卡那霉素的第二LB培养基中，在36～38℃下培养至OD600＝0.6～0.8，然后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于25～30℃，180～200rpm下诱导8～10h。
优选的，所述第一LB培养基和第二LB培养基中卡那霉素的浓度独立地为48～52mg/ml；所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷在第二LB培养基中的终浓度为0.0008～0.0012M。
本发明还提供了一种所述的几丁质酶在降解几丁质方面的应用。
本发明提供的几丁质酶酶解胶体几丁质的产物主要为(GlcNAc)2和(GlcNAc)3，伴有少量的GlcNAc，为典型的几丁质内切酶，大小为40KDa。该几丁质酶的最适反应温度为45℃，在20℃～50℃范围内热稳定性好；最适pH为5.0，在pH4.0～6.0具有较高的酶活，表明本发明提供的几丁质酶具有较高的稳定性。金属离子和化学试剂影响试验表明，Co2+、Na+、Mg2 +、NH4 +、Ca2+、Zn2+、K+、Tris、尿素对所述几丁质内切酶具有激活作用；Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、SDS、EDTA对几丁质内切酶具有抑制作用。
附图说明
图1为实施例2表达的几丁质酶的SDS-PAGE检测结果；图中，M：彩色预染色蛋白标记，1：离心前破胞总蛋白(终浓度4.5M)，2：几丁质粗酶液，3：破胞总蛋白经Ni-NTABeads6FF column上样过程中所接取的蛋白，4：破胞总蛋白经100ml浓度为50mM的咪唑洗脱后的杂蛋白，5：4中的杂蛋白经100ml浓度为500mM的咪唑洗脱后的纯化蛋白；
图2为N-乙酰葡萄糖标准曲线；
图3为本发明实施例4几丁质内切酶酶活的温度曲线；
图4为本发明实施例4几丁质内切酶酶活的温度稳定性曲线；
图5为本发明实施例4几丁质内切酶酶活的pH曲线；
图6为本发明实施例4几丁质内切酶酶活的pH稳定性曲线；
图7为本发明实施例4金属离子与化学试剂对几丁质内切酶酶活的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1重组质粒pET28a-Afchi18的构建
步骤1，设计PCR扩增引物
AfChi18-F-5’-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGATGTTCTCCGGATCCATCTTCC(SEQ ID No.3)
AfChi18-R-5’-CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTCACATATCATGCAAGGTCTTATACCC(SEQ IDNo.4)
步骤2，使用步骤1的引物扩增AfChi18基因
以AfChi18基因的核苷酸序列为模板(如SEQ ID No.2所示)，扩增AfChi18基因采用PCR法。
PCR扩增的反应体系为：模板0.5μl；上游引物(SEQ ID No.3)0.3μl；下游引物(SEQID No.4)0.3μl；2×Taq Master Mix 10μl；ddH2O 8.9μl；反应体系总体积20μl。
PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，65℃退火，20s；72℃延伸，2min，共35个循环；72℃后延伸，10min，最后16℃保温。
步骤3，PCR扩增结束，回收纯化扩增产物，得到纯化后的DNA产物。
步骤4，使用限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切载体pET28a，回收产物，得到酶切纯化后的载体pET28a(5304bp)。
步骤5，将步骤3得到的扩增产物用同样的限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ进行双酶切，然后和步骤4双酶切纯化后的产物用2×Taq PCR Master Mix DNA连接酶进行同源重组连接(采用PCR法)。
PCR同源重组连接反应体系为：纯化后的DNA产物1μl；酶切纯化后的载体pET28a3μl；Mix 5μl；ddH2O 1μl；反应体系总体积10μl。
PCR同源重组连接的反应程序为：同源重组连接反应体系混匀后，置于50℃水浴锅中反应5min，随后立即放于冰上(0℃)冷却。反应混合物于GeneJET PCR PurificationKit(thermo scientific)进行纯化，得到产物为重组质粒pET28a-Afchi18。
实施例2几丁质酶Afchi18基因的表达
步骤1，构建重组克隆菌株pET28a-AfChi18-E.coli DH5α
将重组质粒pET28a-Afchi18化学转化至E.coli DH5a，经菌落PCR筛选并测序，得到克隆菌株pET28a-AfChi18-E.coli DH5α。
步骤2，构建重组表达菌株pET28a-AfChi18-E.coli BL21 DE3 codon plus RIL
经TIANprep Mini Plasmid Kit(TIANGEN)提取重组克隆菌株pET28a-Afchi18-E.coli DH5a中的重组质粒，化学转化至表达菌株E.coli BL21DE3 codonplus RIL中，挑取单菌落直接在LB培养基中，37℃，220rpm过夜培养，得到重组表达菌株pET28a-Afchi18-E.coli BL21 DE3 codon plus RIL。
步骤3，重组表达菌株的表达
将重组表达菌株pET28a-Afchi18-E.coli BL21 DE3 codon plus RIL接入10ml含卡那霉素(50mg/ml)的LB培养基中，于37℃过夜培养16h后，按1％v/v的接种量接种到500ml含卡那霉素(50mg/ml)的LB培养基中，在37℃下培养至OD600＝0.7，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其在LB培养基中的终浓度为0.001M，于25～30℃，180～200rpm诱导10h。
步骤4，收集菌体破碎，获得几丁质酶粗酶液
表达结束后，将诱导培养的菌液于4℃，7400rpm离心25min，收集菌体，用柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液重悬菌体，于冰上超声破碎，每次超声1s，间隔2s，超声破碎20min；然后于4℃，1200rpm离心25min收集上清，即得到几丁质酶粗酶液。
步骤5，几丁质粗酶液的纯化
将步骤4的几丁质酶粗酶液利用His-TAG柱进行蛋白纯化，纯化后的重组蛋白溶液(即几丁质酶)进行SDS-PAGE后，得40kDa左右的蛋白条带(如图1所示)。
实施例3几丁质酶的酶学性质
一、酶活测定
利用铁氰化钾法(Schales法)制作标准曲线。
乙酰氨基葡萄糖标准曲线的绘制：准确称取一定量的N-乙酰氨基葡萄糖(N-GlcNAc)，溶于ddH2O，并配制成终浓度为10mM的标准试剂。按表1依次加入N-乙酰氨基葡萄糖标准试剂(10mM N-GlcNAc)、ddH2O、Schales试剂，混匀，得到系列浓度梯度为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM的标准溶液(每组做3个重复)，立即沸水浴中反应10min，冷却至室温(20℃)，然后每个反应取200μl反应液加入96孔板，于酶标仪上测420nm波长处的光吸收值，结果见表2。以ddH2O作为空白对照，以不同浓度N-乙酰氨基葡萄糖为横坐标，OD420吸光值为纵坐标，制作标准曲线，如图2。线性拟合N-乙酰葡萄糖胺标准曲线得相关系数为R2＝0.9972，直线回归方程为y＝0.6474-0.906x。
表1系列浓度梯度标准溶液配置表
1
2
3
4
5
6
7
10mMN-GlcNAc(mL)
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
ddH<sub>2</sub>O(mL)
0.99
0.98
0.97
0.96
0.95
0.94
0.93
Schales’reagent(mL)
2
2
2
2
2
2
2
表2还原糖含量与吸光值变化对应关系
1
2
3
4
5
6
7
N-GlcNAc(mM)
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
OD<sub>420</sub>
0.570
0.464
0.358
0.269
0.181
0.099
0.013
以50g/l的胶体几丁质为底物，测定实施例2的几丁质酶的酶活力。取800μl底物(pH5.0)，加入200μl的几丁质酶粗酶液，于45℃水浴锅，反应1h后，移至沸水浴中煮沸10min使酶失活。再加入1ml Schales试剂，100℃煮沸5min。于离心机4℃，12000rpm离心10min，以灭活等量的酶液为空白对照，取上清测定其在420nm下的吸光度。根据标准曲线(图2)计算还原糖含量。经计算酶的比活为0.254U/ml。
酶活力单位(U)的定义为：在上述条件下，每分钟释放1μmol还原糖所需的酶量。
经测定，酶解胶体几丁质的产物主要为(GlcNAc)2和(GlcNAc)3，伴有少量的GlcNAc，表明本发明的几丁质酶为典型的几丁质内切酶。
实施例4几丁质内切酶酶学性质的研究
对实施例2的几丁质内切酶的酶学性质进行测定，包括最适温度、最适pH，温度稳定性、pH稳定性，金属离子和化学试剂对酶活的影响，以胶体几丁质(50g/l)为底物进行酶活的测定。
1、最适反应温度
反应体系中包括800μl胶体几丁质(50g/l)和200μl几丁质内切酶粗酶液。pH值为5.0(柠檬酸-磷酸二氢钠，100mM)。分别在25℃，30℃、40℃、45℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃温度梯度范围内反应1h，以灭活的粗酶液为空白，反应结束后，立刻向反应体系中加入1mlSchales试剂，于沸水浴中煮沸灭活10min，然后在酶标仪OD540下测定吸光度，确定不同温度下对几丁质内切酶的酶活。根据酶在不同温度下的相对酶活性绘制曲线，如图3，确定几丁质内切酶的最适反应温度。由图3可以看出，几丁质内切酶的最适反应温度为45℃。
2、温度稳定性研究
将几丁质内切酶粗酶液分别置于不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)分别孵育30min，60min，90min，冰浴15min，然后检测残余酶活，并和未处理的酶活进行比较，计算相对酶活。结果如图4所示。结果表明几丁质酶对温度具有一定的耐受性，在20～50℃内热稳定性良好。
3、最适反应pH
底物为50g/l的胶体几丁质，在pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0(pH2.0～8.0为柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液)，8.0、9.0、10.、11.0(pH8.0～11.0为甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的100M的缓冲液中测定酶活。反应体系与最适反应温度试验的反应体系相同，反应温度为45℃。根据酶在不同的pH值下的相对活性绘制曲线，如图5。确定最适反应pH值为5.0。
4、pH稳定性研究
将几丁质粗酶液分别置于100M不同pH的缓冲液中(pH2.0～8.0柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液，pH8.0～12.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液，间隔1.0)，4℃下放置90min，然后在最适反应温度(45℃)下检测残余酶活，以未处理的酶活性为空白对照，计算相对酶活，如图6所示。几丁质内切酶在pH4.0～6.0之间酶活性最高，在pH5.0时活力最佳。pH稳定性实验表明几丁质内切酶在pH值范围为4.0～6.0时，孵育90min后酶活力维持在90％以上，具有较高的pH耐受性。
5、金属离子对几丁质内切酶Afchi18的影响
向反应体系(同最适反应温度试验反应体系)中分别加入终浓度为0.01M的CoCl2、NaCl、MgCl2、CuCl2、FeCl3、NH4OH、CaCl2、ZnCl2、MnCl2、KCl、BaCl2、Tris、SDS、EDTA、尿素，然后在标准条件下(45℃，pH＝5.0)测定酶活，并以未处理的几丁质酶粗酶液为空白对照，计算酶相对酶活，结果如图7。以未处理的几丁质酶粗酶液的酶活为100％，计算出金属离子对几丁质内切酶的影响，结果如图7。由图7可知，Co2+、Na+、Mg2+、NH4 +、Ca2+、Zn2+、K+、Tris、尿素对几丁质内切酶具有激活作用；Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、SDS、EDTA对几丁质内切酶具有抑制作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西科学院
<120> 一种几丁质酶、AfChi18基因及其表达方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 300
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala His Tyr His Asn Asn Tyr Lys Lys Asn Asp Glu Val Glu Phe
1 5 10 15
Val Arg Thr Gly Tyr Gly Lys Glu Met Val Lys Val Leu His Ile Gln
20 25 30
Arg Asp Gly Lys Tyr His Ser Ile Lys Glu Val Ala Thr Ser Val Gln
35 40 45
Leu Thr Leu Ser Ser Lys Lys Asp Tyr Leu His Gly Asp Asn Ser Asp
50 55 60
Ile Ile Pro Thr Asp Thr Ile Lys Asn Thr Val His Val Leu Ala Lys
65 70 75 80
Phe Lys Glu Ile Lys Ser Ile Glu Ala Phe Gly Val Asn Ile Cys Glu
85 90 95
His Phe Leu Ser Ser Phe Asn His Val Ile Arg Ala Gln Val Tyr Met
100 105 110
Glu Glu Ile Pro Trp Lys His Leu Gly Lys Ile Gly Val Lys His Val
115 120 125
His Ala Phe Ile Glu Thr Pro Thr Gly Thr His Phe Cys Glu Val Glu
130 135 140
Gln Leu Arg Ser Gly Pro Gln Val Ile His Ser Gly Ile Lys Asp Leu
145 150 155 160
Lys Val Leu Lys Thr Thr Gln Ser Gly Phe Glu Gly Phe Ile Lys Asp
165 170 175
Gln Phe Thr Thr Leu Pro Glu Val Lys Asp Arg Cys Phe Ala Thr Gln
180 185 190
Val Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr His Gln Cys Arg Asp Val Asp Phe Lys
195 200 205
Ala Thr Trp Asp Thr Ile Arg Asp Leu Val Met Glu Lys Phe Ala Gly
210 215 220
Pro Tyr Asp Lys Gly Glu Tyr Ser Thr Ser Val Gln Lys Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Asp Ile Gln Val Leu Ser Leu Ser Arg Val Pro Ala Ile Glu Asp Met
245 250 255
Glu Ile Ser Leu Pro Asn Ile His Tyr Phe Asn Ile Asp Met Ser Lys
260 265 270
Met Gly Leu Ile Asn Lys Glu Glu Val Leu Leu Pro Leu Asp Asn Pro
275 280 285
Tyr Gly Lys Ile Thr Gly Thr Val Lys Arg Lys Leu
290 295 300
<210> 2
<211> 915
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcccatt atcacaacaa ctacaaaaaa aacgacgaag tggaatttgt gcgtaccggt 60
tatggtaaag aaatggttaa agtgctgcat attcagcgcg acggtaaata tcatagcatt 120
aaagaagttg caaccagcgt tcagctgacc ctgagcagca aaaaagatta tctgcatggt 180
gataacagcg atattattcc gaccgatacc attaaaaaca ccgttcatgt tctggccaag 240
tttaaagaga tcaaaagcat tgaagccttc ggcgtgaata tctgtgaaca ttttctgagc 300
agcttcaacc atgttattcg tgcacaggtt tatatggaag aaatcccgtg gaaacatctg 360
ggtaaaattg gtgttaaaca cgtgcatgcc tttattgaaa ccccgaccgg tacacatttt 420
tgtgaagttg aacagctgcg tagcggtccg caggttattc atagcggtat taaagatctg 480
aaggtgctga aaaccacaca gagcggtttt gaaggtttta tcaaagatca gtttaccaca 540
ctgccggaag ttaaagatcg ttgttttgca acccaggtgt attgcaaatg gcgttatcat 600
cagtgtcgtg atgttgattt taaagcaacc tgggatacca ttcgtgatct ggtgatggaa 660
aaatttgcag gtccgtatga taaaggcgaa tatagcacca gcgtgcagaa aaccctgtat 720
gatattcagg ttctgagcct gagccgtgtt ccggcaattg aagatatgga aattagcctg 780
ccgaacatcc actatttcaa catcgatatg agcaaaatgg gcctgatcaa caaagaagaa 840
gttctgctgc cgctggataa tccgtatggt aaaatcaccg gcaccgttaa acgtaaactg 900
agcagccgtc tgtaa 915
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgccgcgcg gcagccatat gatgttctcc ggatccatct tcc 43
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgagtgcg gccgcaagct ttcacatatc atgcaaggtc ttataccc 48
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