阅读说明：本技术 一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21及其编码基因和应用 (Xylosidase Xyl21 with high-concentration xylose, alcohol and salt tolerance, and coding gene and application thereof ) 是由 李中媛 张同存 陈世恒 赵军旗 于 2019-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明木糖苷酶Xyl21的最适温度为45℃,该酶在45℃处理1h后的剩余酶活为80％,最适pH为5.5,在pH5.0-6.5范围内酶活都保持在80％以上的相对酶活性,具有良好的木糖耐受性,具有良好的乙醇耐受性,对高浓度盐离子具有很好的耐受性。本发明木糖苷酶Xyl21新颖、可耐受高浓度木糖、乙醇和盐,上述性质使木糖苷酶Xyl21作为一种新型的酶制剂,可以广泛的应用于能源、饲料和食品等工业。(The invention relates to xylosidase Xyl21 with high-concentration xylose, alcohol and salt tolerance, and the amino acid sequence of the xylosidase is SEQ ID NO. 1. The xylosidase Xyl21 has the optimum temperature of 45 ℃, the residual enzyme activity of 80 percent after being treated for 1 hour at 45 ℃, the optimum pH value of 5.5, the relative enzyme activity of more than 80 percent of the enzyme activity in the pH range of 5.0-6.5, good xylose tolerance, good ethanol tolerance and good tolerance to high-concentration salt ions. The xylosidase Xyl21 is novel and can tolerate high-concentration xylose, ethanol and salt, and the properties enable xylosidase Xyl21 to be used as a novel enzyme preparation and be widely applied to industries such as energy, feed, food and the like.)

一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21及其编 码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21及其编码基因和应用。

背景技术

半纤维素是植物的主要组成部分，通过生物酶系的降解可转化成为更有利用价值的产品。半纤维素的主要成分是木聚糖，木聚糖是一类由1，4-糖苷键连接起来并带有多重取代基的异质多糖。它的完全降解是一个复杂的过程，其中木糖苷酶是降解木聚糖的关键酶，它以外切的方式从非还原性末端水解木聚糖最终生产木糖。但是在工业反应过程中过量的木糖作为终产物，会对木糖苷酶的发生反馈抑制作用，从而抑制木糖苷酶的活性，最终导致其活力丧失。一般不同来源的木糖苷酶的木糖耐受性都很低，特别是真菌来源的木糖苷酶仅能耐受2-10mM的木糖。目前对于解除抑制作用的方法是通过添加酶的用量或超滤方法消除抑制物木糖的影响，但这无疑增加了工业生产的成本，因此具有高浓度木糖耐受性的木糖苷酶可以提高生产效率从而降低成本；同时，在实际工业应用中，具有耐受高浓度乙醇特性的木糖苷酶可以提高乙醇的生产效率，具有耐受高浓度盐离子特性的木糖苷酶可以应用在咸味饼干、面包、海产品等含盐量较高的食品加工行业以及污水的处理中，因此迫切需要发掘具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

一种高木糖耐受性的木糖苷酶Xyl43B及其基因和应用(CN103275955A)，提供了一种来源于腐质霉Humicola sp.L8的木糖苷酶Xyl43B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述木糖苷酶的编码基因xyl43B。其发明的木糖苷酶的具有以下性质：高木糖耐受性(Ki值292mM)，最适pH7.0，pH5.5-10.0保持稳定，最适温度50℃，在50℃具有很好的热稳定性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品、饲料、能源工业等。

通过对比，本发明木糖苷酶Xyl21除了耐木糖，还能耐乙醇和盐，从而具有更广泛的应用范围。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21及其编码基因和应用，该木糖苷酶Xyl21具有高浓度木糖、醇和盐耐受性，该酶能够作为一种新型的酶制剂，可以广泛的应用于能源、饲料和食品等工业中。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1。

而且，所述木糖苷酶Xyl21属于中温、中性偏酸的木糖苷酶，最适温度45℃，该酶在45℃处理1h后的剩余酶活为80％，最适pH 5.5，在pH 5.0-6.5范围内酶活都保持在80％以上的相对酶活性；有金属离子抗性以及木糖、乙醇和盐耐受性；成熟的木糖苷酶Xyl21的理论分子量为58.43kDa，等电点为5.72。

而且，所述木糖苷酶Xyl21从土壤环境中分离得到。

一种如权上所述的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

包含如上所述的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21的编码基因的重组载体。

包含如上所述的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21的编码基因的重组载体pET28a(+)-Xyl21。

包含如上所述的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21的编码基因的重组菌株。

一种如上所述的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21的制备方法，步骤如下：

⑴通过利用Touch-down PCR和Tail-PCR从碱性土壤宏基因组中克隆得到一个新的GH39家族木糖苷酶基因Xyl21；将木糖苷酶基因Xyl21***到表达载体限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作地与表达调控序列相连接，得重组载体；将该重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

⑵培养重组菌株，诱导重组具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21编码基因表达；

⑶回收并纯化所表达的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21。

如上所述的具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21在作为酶制剂方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明木糖苷酶Xyl21的最适温度为45℃，该酶在45℃处理1h后的剩余酶活为80％，最适pH为5.5，在pH5.0-6.5范围内酶活都保持在80％以上的相对酶活性，具有良好的木糖耐受性，对木糖的抑制常数(K_i)为1100mmol/L；具有良好的乙醇耐受性，在10％和20％(v/v)浓度的乙醇条件下保持156.34％和32.14％的相对酶活性；对高浓度盐离子具有很好的耐受性，在1.2M和3.0M的NaCl条件下仍保持128.13％和83.45％的相对活性。相比于其他GH39木糖苷酶，Xyl21具有更好的木糖、乙醇和盐耐受性。本发明木糖苷酶Xyl21新颖、可耐受高浓度木糖、乙醇和盐，上述性质使木糖苷酶Xyl21作为一种新型的酶制剂，可以广泛的应用于能源、饲料和食品等工业。

2、本发明木糖苷酶Xyl21从盐碱性土壤宏基因组中克隆得到，该木糖苷酶Xyl21为一个新颖的GH39糖苷水解酶家族的木糖苷酶基因，其能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功进行异源表达。

附图说明

图1为本明中Xyl21重组蛋白的纯化图；其中，1为未纯化的蛋白，2为纯化后的重组蛋白Xyl21；

图2为本明中重组木糖苷酶Xyl21的最适pH图；

图3为本明中重组木糖苷酶Xyl21的pH稳定性图；

图4为本明中重组木糖苷酶Xyl21的最适温度图；

图5为本明中重组木糖苷酶Xyl21的热稳定性图；

图6为本明中金属离子及化学试剂对重组木糖苷酶Xyl21酶活性的影响图；

图7为本明中不同浓度盐离子对重组木糖苷酶Xyl21酶活性的影响图；

图8为本明中不同浓度单糖对重组木糖苷酶Xyl21酶活性的影响图；

图9为本明中不同浓度醇对重组木糖苷酶Xyl21酶活性的影响图；

图10为本明中重组木糖苷酶Xyl21的水解产物分析图；其中，1：1％榉木木聚糖；2：1％玉米芯；3:1％桦木木聚糖；4：1％小麦***木聚糖；X1：木糖标品；X2：木二糖标品；X3:木三糖标品；5：Xyl21水解榉木木聚糖；6：Xyl21水解玉米芯；7：Xyl21水解桦木木聚糖；8：Xyl21水解小麦***木聚糖；9：Xyl21水解木二糖；10：Xyl21水解木三糖，上述浓度均为质量浓度。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21，其氨基酸序列为SEQ IDNO.1：MEKIMISRDNNIPFNKHWKKCIGTGRLGLALQKEYVDHLERLQQDIGFDYIRGHGLFHEDIGIYKEVDVGGTPTPFYNFTYIDRIFDTFLQNNLRPFVELGFMPKKLASGTQTIFYWEGNVTPPAEEKKWEELIYHTVIHFVERYGVEEVLQWPFEVWNEPNLSNFWENADKQAYFQLYKITAKTIKSIHPDLNVGGPAICGGTDEWITDFLHFCHKEQVPVDFISRHAYTSKPPKKKTPDYYYQDLADPNDMLTQLTSVKKLIHDTPYPDLPFHITEYNTSYSPINPIHDTNYNAAYLGKILSHAGDIVSSFSYWTFSDVFEEFDIPRAPFHGGFGLMALHAIRKPTYHLFSFFNKLGDTCLYKDDTMIVTKHRDNTISIVAWNLIHDKGENHDKTITLSIPFSSDDVFLYREITNEHHANPWRVWKQMGRPRFPSKEQITLLKSCDIPFIQTDKLMTENKLLTYQLTMAKNEVTLLHFSDIIDETNTYIGLDDSLLTSY

其中，该酶基因编码501个氨基酸和一个终止密码子，该序列中无信号肽和内含子，因此，成熟的木糖苷酶Xyl21的理论分子量为58.43kDa，等电点为5.72。

本发明的木糖苷酶Xyl21属于中温、中性偏酸的木糖苷酶，最适温度45℃，该酶在45℃处理1h后的剩余酶活为80％，最适pH 5.5，在pH 5.0-6.5范围内酶活都保持在80％以上的相对酶活性；有较好的金属离子抗性以及非常好的木糖、乙醇和盐耐受性。

一种编码上述木糖苷酶Xyl21的编码基因，具体地，该基因的核酸序列如SEQ IDNO.2所示：

ATGGAGAAAATAATGATTTCTAGAGATAACAATATCCCGTTTAATAAACATTGGAAAAAGTGTATTGGAACCGGTCGACTAGGCTTAGCTTTACAAAAAGAGTATGTGGATCATCTTGAACGTCTACAACAAGATATTGGTTTTGATTATATTAGAGGACATGGACTCTTTCATGAAGACATCGGCATTTATAAAGAAGTAGACGTAGGTGGCACTCCTACTCCTTTCTATAATTTTACATATATTGATAGAATTTTCGATACGTTTCTTCAGAATAATTTACGTCCATTTGTTGAGTTAGGCTTTATGCCCAAAAAGCTTGCTTCCGGTACCCAAACTATCTTTTATTGGGAAGGTAATGTCACCCCTCCGGCTGAGGAAAAGAAGTGGGAAGAGCTCATCTATCATACAGTAATCCATTTTGTAGAAAGATACGGGGTTGAGGAAGTGTTACAGTGGCCGTTTGAAGTTTGGAATGAACCTAACCTATCCAACTTCTGGGAGAACGCTGATAAACAAGCTTATTTTCAACTCTACAAAATTACTGCAAAAACAATTAAATCTATTCATCCAGATTTAAACGTTGGGGGCCCAGCAATTTGTGGTGGTACTGATGAGTGGATAACTGATTTTCTCCACTTTTGTCACAAAGAGCAAGTACCCGTTGATTTTATAAGTCGACATGCTTATACGTCTAAGCCTCCAAAGAAAAAAACGCCTGACTATTATTATCAAGACTTGGCCGATCCTAACGACATGCTTACTCAACTTACGAGTGTAAAAAAATTAATTCATGACACACCTTATCCTGACCTTCCATTTCACATTACCGAATACAATACATCTTATAGCCCAATCAATCCTATTCATGATACGAACTATAATGCTGCGTACCTAGGCAAAATCTTAAGCCATGCTGGAGACATTGTGTCTTCTTTTTCCTATTGGACATTTAGTGACGTTTTTGAAGAGTTTGATATTCCACGTGCCCCTTTCCATGGAGGCTTCGGGTTAATGGCACTACACGCTATTCGGAAACCAACTTATCATTTGTTTTCATTCTTTAACAAATTAGGTGATACTTGTCTTTACAAAGACGATACAATGATCGTCACTAAGCATCGAGATAATACCATTTCCATTGTGGCTTGGAACTTAATACATGACAAAGGAGAAAATCATGACAAAACAATCACGCTCTCTATTCCGTTTTCTTCTGATGACGTCTTTTTGTACAGAGAGATTACTAACGAACATCATGCAAACCCTTGGCGTGTTTGGAAGCAGATGGGAAGACCACGCTTTCCATCGAAAGAACAAATAACACTATTAAAATCATGTGACATTCCTTTCATTCAAACAGATAAACTGATGACAGAAAATAAGCTTCTAACTTATCAATTGACGATGGCAAAAAATGAAGTTACTTTACTACATTTTTCAGACATTATAGATGAAACCAACACCTATATCGGGCTCGACGACAGTCTGCTCACATCTTATTAA。

本发明可以通过利用Touch-down PCR和Tail-PCR从天津滨海新区盐碱性土壤(39°11′67″N，117°73′43″E)的宏基因组DNA中克隆得到一个新的GH39家族木糖苷酶基因Xyl21，DNA全序列分析结果表明，木糖苷酶Xyl21结构基因全长1506bp。

将木糖苷酶Xyl21序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Alicyclobacillusferrooxydans的GH39家族木糖苷酶基因氨基酸序列一致性为63％，说明Xyl21是一个新颖的木糖苷酶。

一种包含上述木糖苷酶基因Xyl21的重组载体，命名为pET28a(+)-Xyl21。将本发明的木糖苷酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作地与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木糖苷酶基因***到质粒pET28a(+)上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET28a(+)-Xyl21。

一种包含上述木糖苷酶的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌，优选为重组菌株BL21/Xyl21。

一种制备木糖苷酶基因Xyl21的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶的表达；

3)回收并纯化所表达的木糖苷酶Xyl21。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21，得到重组菌株BL21/Xyl21。

上述具有高浓度木糖、乙醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21是从土壤环境中分离得到的。

具体地，相关步骤如下：

试验材料和试剂：

1、菌株及载体：本发明从来源于土壤环境中获得GH39家族(木糖苷酶)中分离得到一种新的木糖苷酶基因Xyl21。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)菌株均由本实验室保存，pET-28a(+)质粒由本实验室保存，pMD-19T购自宝生物工程(大连)股份有限公司。

2、酶类及其它生化试剂：LATaq购自TaKaRa公司；对硝基苯基-D-吡喃木糖苷(pNPX)、榉木木聚糖、桦木木聚糖、玉米芯、小麦***木聚糖均购自Sigma公司；其他化学试剂购于天津市江天化工技术有限公司，均为分析纯；异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)、质粒小提试剂盒购自北京索莱宝公司；细菌基因组提取试剂盒购自天根公司；EcoRⅠ、NotⅠ限制性内切酶和BCA蛋白定量试剂盒均购自Thermo Scientific公司。

3、培养基：

(1)LB培养基：1％NaCl，0.5％酵母提取物，1％蛋白胨；

(2)LB固体培养基：LB液体培养基中加入2％琼脂粉。

特别说明：以下步骤中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

一、木糖苷酶编码基因Xyl21的克隆

采用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)提取来源于天津滨海新区盐碱性土壤(39°11′67″N，117°73′43″E)的宏基因组DNA，具体操作参见说明书。

根据GH39家族木糖苷酶基因的保守区序列(EVWNEPN和SYWTFSD)设计合成了简并引物Xyl39F，Xyl39R。

以环境宏基因组DNA为模板，使用Touch-down PCR对保守区域进行扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，48-42℃退火30sec(每个循环降0.5度)，72℃延伸40sec 12个循环；94℃变性30sec，45℃退火30sec，72℃延伸40sec，28个循环后72℃保温10min。得到一约499bp片段，将该片段回收后与PMD-19T载体相连并测序。

根据Xyl21的保守区序列分别设计上游和下游的特异性引物(表1)，采用3次Tail-PCR获得基因序列全长。设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为21-1u1,21-1u2,21-1u3，21-2u1，21-2u2，21-2u3(上游特异性引物),21-1d1,21-1d2,21-1d3，21-2d1，21-2d2，21-2d3，21-3d1，21-3d2，21-3d1(下游特异性引物)。

表1.木糖苷酶Xyl21TAIL-PCR特异性引物

以扩增得到的保守区序列为模板，通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，克隆得到的上下游片段分别纯化回收后连接pMD-19T进行测序，将测序正确的上下游片段通过VectorNTI软件与保守区序列进行序列拼接。拼接后最终获得了GH39家族的木糖苷酶基因全长。Xyl21木糖苷酶基因全长1506bp，编码501个氨基酸和一个终止密码子，无信号肽和内含子。预测其成熟蛋白分子量为58.43KDa，等电点为5.72。Xyl21基因序列已提交NCBI数据库(KU353562)。

二、重组木糖苷酶Xyl21的制备

将表达载体pET28a(+)进行双酶切(EcoR I+NotI)，同时将编码木糖苷酶的基因Xyl21双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码成熟木糖苷酶的基因片段与表达载体pET28a(+)连接，获得含有木糖苷酶基因Xyl21的重组质粒pET28a(+)-Xyl21，并将其转化到大肠杆菌DH5α，获得重组大肠杆菌菌株DH5α/Xyl21。将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌菌株BL21/Xyl21。

取含有重组质粒的BL21菌株，接种于5mL含抗生素(100μg/ml)的LB液体培养基中，37℃培养12h，按照1％的接种量将培养12h的菌液接种于100mL含抗生素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG于25℃进行诱导表达20h，4℃，8000r/min离心10min，收集菌体，倒掉培养基，按照每1.5g湿菌体加入50mLPBS(pH7.4)的标准重悬菌体，并进行超声破碎，将超声破碎后的菌体于12000r/min离心15min。将上清的粗酶液用镍亲和柱进行纯化，使用不同浓度的咪唑(10mmol/L-500mmol/L)洗脱目的蛋白，收集不同浓度梯度的洗脱液，将洗脱液分别进行酶活测定以及SDS-PAGE蛋白电泳检测纯度。通过镍柱纯化后，SDS-PAGE结果表明，重组木糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达。结果表明达到电泳纯，纯化后的蛋白大小约为58.43kDa(图1)。

三、木糖苷酶的活性分析

具体方法如下：250μL 2mM的pNPX底物与150μL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液混匀，加入100μL酶液(2U/ml)，于37℃反应10min，加入1.5mL，1M的Na₂CO₃终止反应，使用分光光度计测定OD₄₀₅值，以计算产物对硝基苯酚的量。1个木糖苷酶活性单位(U)定义为在给定的相应反应条件下，每分钟分解对硝基苯基-β-D-木糖苷(pNPX)底物生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需要的酶量。

四、木糖苷酶Xyl21的性质测定

1、重组木糖苷酶Xyl21的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将步骤二纯化的重组木糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。以pNPX为底物，终浓度为2mM，取250μL底物并加入150μL相应的缓冲液。缓冲溶液的缓冲梯度不同：100mM柠檬酸-Na₂HPO₄(pH 3.0–8.0)，100mM甘氨酸-NaOH(pH 9.0–12.0)。底物与缓冲液的混合溶液在37℃的反应条件下先预热5min，加入100μL的酶液(2U/ml)，混匀并准确反应10min，加入1.5ml Na₂CO₃终止反应，冷却至室温后测定OD₄₀₅值。如图2所示，结果表明，重组酶在以pNPX为底物时的最适pH为5.5，在pH5.0-6.5范围内，酶活都保持在80％以上。

为了研究酶的pH稳定性，将纯化后的酶先用不同pH的缓冲液稀释，37℃处理1h，再用最适pH的缓冲液稀释10倍，在最适pH的缓冲液及最适温度下测定剩余酶活。如图3所示，结果表明，测得其木糖苷酶活性在pH5～7.0之间都很稳定，相对剩余酶活均在70％以上。

2、重组木糖苷酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系下，测定纯化后的酶在不同温度下(10℃-70℃)的酶活。酶反应最适温度测定结果如图4所示，表明重组酶活性最适温度为45℃，属于中温酶，但Xyl21在低温条件下仍然具有活性，10℃和20℃时的相对酶活分别为19％和32％，高温条件下，如在60℃相对酶活为25％，说明该酶的反应温度范围较为宽泛。

热稳定性测定为在pH5.5的缓冲液中将稀释后的重组酶液(2U/ml)分别置于45℃、50℃和55℃条件下预处理1h，在不同时间点取样(0、1、2、5、10、20、30、60min)，并在最适温度和最适pH条件下测定剩余酶活，未做任何处理的酶作为对照，冷却至室温测定OD405的吸光值。酶的热稳定性性试验表明，Xyl21在45℃处理1h后，剩余酶活为80％以上，相对稳定。但在50℃和55℃的热稳定性较45℃更低一些，50℃处理5min，55℃处理2min酶活几乎全部丧失，结果如图5所示。

3、重组木糖苷酶的K_m值测定方法如下：

动力学常数测定：配制浓度为0.2mmol/L到2mmol/L的pNPX，分别用不同浓度的pNPX为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH5.5)缓冲液体系中，45℃下测定在不同浓度pNPX下的酶活，根据米氏方程计算K_m和V_max,每个实验测定三次平行。经测定，重组酶Xyl21的K_m、V_max和K_cat值分别为1.71mmol/L、17.6μmol/min/mg和19.04s^-1。

4、不同金属离子和化学试剂对Xyl21酶活的影响测定如下：

在标准反应体系中加入终浓度为5mmol/L的不同金属离子、化学试剂(Mn²⁺、K⁺、Ca^{2 +}、Cu²⁺、Fe³⁺、Ni⁺、Mg²⁺、Li⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、SDS、EDTA-Na₂、巯基乙醇)以及终浓度不同的NaCl(0.6mol/L，1.2mol/L，1.8mol/L，2.4mol/L，3.0mol/L，3.6mol/L，4.0mol/L)，研究其对酶活性的影响。在45℃、pH5.5条件下测定酶活性，以只加入对应的金属离子、化学试剂和盐离子而不加入适当稀释的酶液作为对照。

结果如图6所示，以pNPX为底物时，当反应体系中加入终浓度为5mmol/L的不同金属离子时，Fe²⁺对其酶活有一定抑制作用，剩余酶活为74％，当加入其他金属离子时，Xyl21的酶活几乎不受影响，均保持有85％以上的剩余酶活，说明Xyl21对大多数金属离子均有较好的抗性。在SDS存在的情况下，酶活全部丧失。但是，Co²⁺、Li⁺、K⁺、Ca²⁺、EDTA-Na₂、巯基乙醇等金属离子和试剂对酶活性均有不同程度的促进作用，其中Ca²⁺的激活作用最为显著为124.29％。推测其原因可能是Ca²⁺能够激活木糖苷酶的催化活性位点并且能够防止其在高温条件下因变性失活。

盐离子耐受性实验结果如图7所示，低浓度的盐离子可以增强酶的相对稳定性。Xyl21在3M的盐离子条件下，依然保留有80％以上的酶活。在3.6mol/L盐离子存在的情况下，剩余酶活为40％以上。

5、重组木糖苷酶的单糖耐受性

向标准反应体系中加入终浓度为0.6、1.2和2.25M的单糖，在最适反应条件下和底物(pNPX)进行反应。单糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)对Xyl21活性的影响如图8所示，当酶处于低浓度的单糖环境时，酶的相对活性受到不同程度的影响，其中葡萄糖对酶的活性提高最为明显，为281.32％，果糖对酶的相对活性也有提高，为111.77％，但是半乳糖对其酶活有一定抑制作用，剩余酶活为86.47％。随着单糖浓度的升高，葡萄糖对酶的激活作用得到降低，其余两种果糖和半乳糖对酶的活性影响几乎保持不变。

低浓度的木糖对酶有一定的激活作用，随着木糖终浓度的提高，酶的活性得到相应的抑制，当木糖的终浓度为1.5M时，酶的相对活性为50％以上。向标准反应体系中加入终浓度为0.5、0.8、1、1.25和1.6M的木糖溶液，分别以终浓度为2mmol/L和3mmol/L的pNPX为底物，在最适反应条件下(45℃，pH5.5)测定Xyl21的酶活力，并计算其Ki值。实验结果表明Xyl21的Ki值为1100mmol/L，如此高的木糖耐受性能保证Xyl21在反应过程中不会因为木糖的过量积累而导致其失活，从而降低生产成本。

6、重组木糖苷酶的醇耐受性

低级醇对β-木糖苷酶活性的影响如图9所示，结果表明当酶处于低浓度的醇(甲醇、乙醇、异丙醇、异戊醇)条件时酶的活性得到相应提高，当低级醇的添加量为20％(v/v)时，除了异戊醇和甲醇以外其余的醇都对酶的活性起到抑制作用，相对酶活剩余在40％以下；当异戊醇的添加量为30％(v/v)时，Xyl21酶的活性并没有得到显著的影响。表明重组β-木糖苷酶Xyl21对低级醇有较好的耐受性。

乙醇对Xyl21活性的影响如图9所示，乙醇耐受性表明，当酶处于低浓度的乙醇条件时酶的活性得到相应提高，在10％(v/v)浓度的乙醇条件下保持154.18％的相对酶活性。随着乙醇浓度的提高酶的相对活性得到下降，当乙醇的添加量为15％(v/v)时，酶的活性被抑制，为原始酶活的87.20％，在20％(v/v)浓度的乙醇条件下仍然保持32.36％的相对酶活性，说明重组β-木糖苷酶Xyl21对乙醇有较好的耐受性。

8、重组木糖苷酶的水解产物分析

由于Xyl21具有水解pNPX的活性，因此进一步分析Xyl21对天然聚糖以及寡糖的降解活性。配制质量浓度为1％的榉木木聚糖、桦木木聚糖、玉米芯和小麦***木聚糖底物并加入40U/mL的纯化后酶液，于45℃反应12h后，水浴煮沸10min灭活，12000rpm离心5min，取上清进行薄层色谱分析，于展开剂(正丁醇:水:乙酸(V:V:V)＝2:1:1)中展开两次，展开后置于显色剂(丙酮:二苯胺:苯胺:磷酸＝50mL:1g:1mL:5mL)中浸泡数秒后立即于90℃烘箱烘干显色。结果如图10所示，Xyl21对所有聚糖底物及寡糖底物都有降解作用，说明Xyl21具有广泛的底物特异性，但是对于不同的底物其降解能力有一定的差异。水解后的产物以木糖为主，从木糖的生成量明显看出，Xyl21对玉米芯，木二糖和木三糖的降解能力较强；其中以玉米芯作为底物时候降解效果最为明显，木糖的含量在重组酶Xyl21作用于底物后明显增加，而木二糖和木三糖则全部被降解为单糖。此外，Xyl21对木二糖、木三糖等低聚木糖的降解活性高于对天然聚糖的降解活性。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种具有高浓度木糖、醇和盐耐受性的木糖苷酶Xyl21及其编码基因和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> PRT

<213> 木糖苷酶Xyl21的氨基酸序列(Unknown)

<400> 1

Met Glu Lys Ile Met Ile Ser Arg Asp Asn Asn Ile Pro Phe Asn Lys

1 5 10 15

His Trp Lys Lys Cys Ile Gly Thr Gly Arg Leu Gly Leu Ala Leu Gln

20 25 30

Lys Glu Tyr Val Asp His Leu Glu Arg Leu Gln Gln Asp Ile Gly Phe

35 40 45

Asp Tyr Ile Arg Gly His Gly Leu Phe His Glu Asp Ile Gly Ile Tyr

50 55 60

Lys Glu Val Asp Val Gly Gly Thr Pro Thr Pro Phe Tyr Asn Phe Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Asp Arg Ile Phe Asp Thr Phe Leu Gln Asn Asn Leu Arg Pro

85 90 95

Phe Val Glu Leu Gly Phe Met Pro Lys Lys Leu Ala Ser Gly Thr Gln

100 105 110

Thr Ile Phe Tyr Trp Glu Gly Asn Val Thr Pro Pro Ala Glu Glu Lys

115 120 125

Lys Trp Glu Glu Leu Ile Tyr His Thr Val Ile His Phe Val Glu Arg

130 135 140

Tyr Gly Val Glu Glu Val Leu Gln Trp Pro Phe Glu Val Trp Asn Glu

145 150 155 160

Pro Asn Leu Ser Asn Phe Trp Glu Asn Ala Asp Lys Gln Ala Tyr Phe

165 170 175

Gln Leu Tyr Lys Ile Thr Ala Lys Thr Ile Lys Ser Ile His Pro Asp

180 185 190

Leu Asn Val Gly Gly Pro Ala Ile Cys Gly Gly Thr Asp Glu Trp Ile

195 200 205

Thr Asp Phe Leu His Phe Cys His Lys Glu Gln Val Pro Val Asp Phe

210 215 220

Ile Ser Arg His Ala Tyr Thr Ser Lys Pro Pro Lys Lys Lys Thr Pro

225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Tyr Gln Asp Leu Ala Asp Pro Asn Asp Met Leu Thr Gln

245 250 255

Leu Thr Ser Val Lys Lys Leu Ile His Asp Thr Pro Tyr Pro Asp Leu

260 265 270

Pro Phe His Ile Thr Glu Tyr Asn Thr Ser Tyr Ser Pro Ile Asn Pro

275 280 285

Ile His Asp Thr Asn Tyr Asn Ala Ala Tyr Leu Gly Lys Ile Leu Ser

290 295 300

His Ala Gly Asp Ile Val Ser Ser Phe Ser Tyr Trp Thr Phe Ser Asp

305 310 315 320

Val Phe Glu Glu Phe Asp Ile Pro Arg Ala Pro Phe His Gly Gly Phe

325 330 335

Gly Leu Met Ala Leu His Ala Ile Arg Lys Pro Thr Tyr His Leu Phe

340 345 350

Ser Phe Phe Asn Lys Leu Gly Asp Thr Cys Leu Tyr Lys Asp Asp Thr

355 360 365

Met Ile Val Thr Lys His Arg Asp Asn Thr Ile Ser Ile Val Ala Trp

370 375 380

Asn Leu Ile His Asp Lys Gly Glu Asn His Asp Lys Thr Ile Thr Leu

385 390 395 400

Ser Ile Pro Phe Ser Ser Asp Asp Val Phe Leu Tyr Arg Glu Ile Thr

405 410 415

Asn Glu His His Ala Asn Pro Trp Arg Val Trp Lys Gln Met Gly Arg

420 425 430

Pro Arg Phe Pro Ser Lys Glu Gln Ile Thr Leu Leu Lys Ser Cys Asp

435 440 445

Ile Pro Phe Ile Gln Thr Asp Lys Leu Met Thr Glu Asn Lys Leu Leu

450 455 460

Thr Tyr Gln Leu Thr Met Ala Lys Asn Glu Val Thr Leu Leu His Phe

465 470 475 480

Ser Asp Ile Ile Asp Glu Thr Asn Thr Tyr Ile Gly Leu Asp Asp Ser

485 490 495

Leu Leu Thr Ser Tyr

500

<210> 2

<211> 1506

<212> DNA/RNA

<213> 木糖苷酶Xyl21的编码基因的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

atggagaaaa taatgatttc tagagataac aatatcccgt ttaataaaca ttggaaaaag 60

tgtattggaa ccggtcgact aggcttagct ttacaaaaag agtatgtgga tcatcttgaa 120

cgtctacaac aagatattgg ttttgattat attagaggac atggactctt tcatgaagac 180

atcggcattt ataaagaagt agacgtaggt ggcactccta ctcctttcta taattttaca 240

tatattgata gaattttcga tacgtttctt cagaataatt tacgtccatt tgttgagtta 300

ggctttatgc ccaaaaagct tgcttccggt acccaaacta tcttttattg ggaaggtaat 360

gtcacccctc cggctgagga aaagaagtgg gaagagctca tctatcatac agtaatccat 420

tttgtagaaa gatacggggt tgaggaagtg ttacagtggc cgtttgaagt ttggaatgaa 480

cctaacctat ccaacttctg ggagaacgct gataaacaag cttattttca actctacaaa 540

attactgcaa aaacaattaa atctattcat ccagatttaa acgttggggg cccagcaatt 600

tgtggtggta ctgatgagtg gataactgat tttctccact tttgtcacaa agagcaagta 660

cccgttgatt ttataagtcg acatgcttat acgtctaagc ctccaaagaa aaaaacgcct 720

gactattatt atcaagactt ggccgatcct aacgacatgc ttactcaact tacgagtgta 780

aaaaaattaa ttcatgacac accttatcct gaccttccat ttcacattac cgaatacaat 840

acatcttata gcccaatcaa tcctattcat gatacgaact ataatgctgc gtacctaggc 900

aaaatcttaa gccatgctgg agacattgtg tcttcttttt cctattggac atttagtgac 960

gtttttgaag agtttgatat tccacgtgcc cctttccatg gaggcttcgg gttaatggca 1020

ctacacgcta ttcggaaacc aacttatcat ttgttttcat tctttaacaa attaggtgat 1080

acttgtcttt acaaagacga tacaatgatc gtcactaagc atcgagataa taccatttcc 1140

attgtggctt ggaacttaat acatgacaaa ggagaaaatc atgacaaaac aatcacgctc 1200

tctattccgt tttcttctga tgacgtcttt ttgtacagag agattactaa cgaacatcat 1260

gcaaaccctt ggcgtgtttg gaagcagatg ggaagaccac gctttccatc gaaagaacaa 1320

ataacactat taaaatcatg tgacattcct ttcattcaaa cagataaact gatgacagaa 1380

aataagcttc taacttatca attgacgatg gcaaaaaatg aagttacttt actacatttt 1440

tcagacatta tagatgaaac caacacctat atcgggctcg acgacagtct gctcacatct 1500

tattaa 1506

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> Xyl39F(Unknown)

<400> 3

gaagtntgga aygarccnaa 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Xyl39R(Unknown)

<400> 4

gacgtcrctr aangtccart a 21

<210> 5

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 21-1u1(Unknown)

<400> 5

gcatggctta agattttgcc taggtacgc 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 21-1u2(Unknown)

<400> 6

gtgaaatgga aggtcaggat aaggtgtgtc 30

<210> 7

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 21-1u3(Unknown)

<400> 7

gtaccaccac aaattgctgg gcccc 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 21-1d1(Unknown)

<400> 8

cgttgggggc ccagcaattt gtgg 24

<210> 9

<211> 29

<212> DNA/RNA

<213> 21-1d2(Unknown)

<400> 9

gcccagcaat ttgtggtggt actgatgag 29

<210> 10

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 21-1d3(Unknown)

<400> 10

caagacttgg ccgatcctaa cgacatgc 28