一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字pcr检测方法

文档序号：1731668 发布日期：2019-12-20 浏览：21次 >En<

阅读说明：本技术 一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字pcr检测方法 (High-precision specific digital PCR detection method for series mixed bacteria pollution mainly caused by acetobacter aceti in fermented milk ) 是由周巍史国华张岩李永波杨岚陈晨王赞于 2019-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法。本发明的方法首先对待测杂菌进行死菌去干扰处理,然后对细菌DNA进行低杂质高纯度的提取,研发设计待测菌的特异性引物探针,设定ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度,使得检测方法满足特异性、灵敏度和定量化的要求。本发明构建的方法特异性好,无非特异性扩增,具有良好的灵敏度及定量化优势。(The invention discloses a high-precision specific digital PCR detection method for series mixed bacteria pollution mainly caused by acetobacter aceti in fermented milk. According to the method, firstly, the to-be-detected mixed bacteria are subjected to dead bacteria interference removal treatment, then, the bacteria DNA is subjected to low-impurity high-purity extraction, a specific primer probe of the to-be-detected bacteria is researched and designed, and a ddPCR reaction system, a reaction program and an annealing temperature thereof are set, so that the detection method meets the requirements on specificity, sensitivity and quantification. The method constructed by the invention has good specificity, no non-specific amplification and good sensitivity and quantification advantages.)

一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及食品、饮品中有害菌和致病菌的检测检验方法。

背景技术

发酵乳中污染菌和致病菌的质量控制需要精准的检测技术体系作为支撑，发酵乳因其营养丰富的特性能够满足污染菌和致病菌的生长需求，单一的对终产品进行检测容易造成原辅料等生产资源的浪费，从而提高生产成本。因此，不同生产环节的污染菌和致病菌数量的精准检测是进行过程质控的关键。

数字PCR(dPCR)作为第三代PCR的技术代表，由Vogelstein等提出。dPCR是把一个样本的反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，独立地进行PCR扩增，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布以及荧光信号阳性的反应单元数量占所有反应单元的比例，来计算目的核酸序列的拷贝数，dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。目前，该技术已经在稀有突变检测、CNV分析和复杂样本基因表达检测等方面有着广泛的应用。

目前，在科研和实际应用上，均亟需将dPCR技术应用到发酵乳中常见污染菌和致病菌的检测体系构建中，开发出发酵乳中污染菌和致病菌的检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法，所述系列杂菌包括：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌，该方法首先对待测杂菌进行死菌去干扰处理，然后对细菌DNA进行低杂质高纯度的提取，研发设计待测菌的特异性引物探针，设定ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度，使得检测方法满足特异性、灵敏度和定量化的要求。

作为本发明的一种优选技术方案，对待测杂菌进行死菌去干扰处理的操作步骤为：

A-1、将传达三次的细菌培养液充分摇匀，吸取100μL增菌液加入到2mL的灭菌透明离心管中；

A-2、将Reagent D从-20℃取出，室温放置融化，取上述增菌液4倍体积的ReagentD溶液加入到A-1中，室温下避光培养5min；

A-3、将离心管放置于低温离心管架中，放在500W的卤素灯相距15cm-20cm的正下方，曝光培养5min后，8000r/min离心5min；

A-4、用移液器小心去除上清液，向离心管中加入100μL无菌去离子水充分混匀，此菌悬液直接用于基因组的提取。

作为本发明的一种优选技术方案，对细菌DNA进行低杂质高纯度提取的操作步骤为：

B-1、准备FoodProof磁珠提取仪，取1mL步骤A处理后的细菌培养液加入至2ml试管中，8000r/min离心5min，弃上清，添加700μL的Lysis Buffer以及80μL的蛋白酶K，65℃振荡水浴30min，12000×g离心力下离心5min，准备好上清用于下面DNA提取；

B-2、准备Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ、Elution plate，使用微量移液器或排式微量移液器将每种板子对应的Buffer添加至需要使用的样品孔；

B-3、Binding plate每个样品孔添加250μL的Binding buffer和20μL的磁珠颗粒且两种液体需吹打混匀；Washing plate I每个样品孔需添加600μL的Washing buffer I；Washing plate II每个样品孔需添加800μL的Washing buffer II；Elution plate每个样品孔需添加80μL的Elution buffer；

B-4、分别移取第一步前处理离心完毕500μL裂解液转移至已添加有Bindingbuffer和磁珠颗粒的Bind plate相应样品孔；

B-5、打开仪器电源开关，进行MPKⅣ提取程序；重复按STARRT按钮，根据屏幕指示分别将Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ、Elution plate放置到指定位置；所有平板装载完毕后，运行核酸自动提取程序；

B-6、程序运行完毕后，根据仪器屏幕指示开始逐步卸载已经完成核酸提取任务的Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ、Elution plate，此时DNA已经溶解于Elution plate可用于后续PCR实验，及时将已经完成核酸提取任务的Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ相应样品孔的废液使用微量移液器移除；

B-7、使用微量移液器将Elution plate上提取的DNA分别转移至干净的离心管中定容至80μL，直接用于PCR实验或4-8℃短期保存或-20℃长期保存；

其中，待测菌的特异性引物探针为：

作为本发明的一种优选技术方案，ddPCR反应体系、反应程序及其退火温度设定为：

C、ddPCR反应体系为：2×ddPCR Super Mix 10μL，1.2μL上下游引物10μmol/L，0.4μL探针10μmol/L，4.4μL的模板，灭菌双蒸水补足20μL；

D、ddPCR的反应程序：95℃预变性，10min；94℃变性，1min；退火，45s；进行40个循环，98℃10min；

E、沙门氏菌退火温度为54℃；金黄色葡萄球菌退火温度为50.2℃；志贺氏菌退火温度为50.7℃；阪崎克罗诺杆菌退火温度为52.6℃；醋化醋杆菌退火温度为54.6℃。

作为本发明的一种优选技术方案，还包括如下后续步骤：ddPCR检测特异性验证：分别提取菌株的纯培养物过夜菌液的DNA，将提取的DNA分别稀释到浓度为103拷贝数，按照分别优化好的反应条件进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的单一菌株的特异性验证试验。

作为本发明的一种优选技术方案，还包括如下后续步骤：ddPCR检测灵敏度验证：发酵乳分别按照国标法检测证实没有被沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌；将污染菌分别人工添加到发酵乳中，保证样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的浓度依次为100CFU/g→108CFU/g，完成污染物中细菌的基因组DNA的提取工作，并用ddPCR方法检测各污染菌株污染酸奶的灵敏度。

作为本发明的一种优选技术方案，还包括如下后续步骤：ddPCR绝对定量的验证：依据各菌种特异基因的理论拷贝数，根据ddPCR得出菌株中每微升的实测拷贝数的结果，计算出20μL的体系中存在的拷贝数，依据公式计算实测灵敏度和偏差率，并进一步分析计数结果与ddPCR检测结果的线性关系。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明结合dPCR技术的精准定量，开发出了发酵乳中污染菌和致病菌的检测方法，为发酵乳生产企业的过程控制提供了必要的技术保障，也为dPCR技术在其它污染菌和致病菌的检测上的推广奠定了基础。

本发明根据待测菌的特异性基因设计引物探针，通过数字PCR基因扩增方法(ddPCR法)直接检测发酵乳中的污染菌和致病菌，通过Reagent D去除死菌、比较不同方法提取效果，优化反应条件，最终建立绝对定量检测发酵乳中的5种污染菌和致病菌的ddPCR方法。

本发明的核心之一在于ddPCR反应体系及反应程序的研发和确立，使得杂菌检测同时具有了良好的特异性、敏感度和定量化。ddPCR反应体系为：2×ddPCR Super Mix 10μL，1.2μL上下游引物(10μmol/L)，0.4μL探针(10μmol/L)，4.4μL的模板，灭菌双蒸水补足20μL。ddPCR的反应程序：95℃预变性，10min；94℃变性，1min；退火，45s；进行40个循环，98℃10min。

退化温度的设定亦构成本发明的核心技术之一：沙门氏菌较适退火温度为54℃；金黄色葡萄球菌较适退火温度为50.2℃；志贺氏菌较适退火温度为50.7℃；阪崎克罗诺杆菌较适退火温度为52.6℃；醋化醋杆菌较适退火温度为54.6℃。

参见下文的试验例，本发明构建的方法用于发酵乳中的污染菌和致病菌检测特异性好，无非特异性扩增。发酵乳经人工污染后，测定ddPCR方法的检测灵敏度。沙门氏菌检测灵敏度为61CFU/g；金黄色葡萄球菌检测灵敏度为33CFU/g；志贺氏菌检测灵敏度为9.5CFU/g；阪崎克罗诺杆菌检测灵敏度为81CFU/g；醋化醋杆菌检测灵敏度为72CFU/g。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的ddPCR检测拷贝数和计数菌落数的偏差均在25％以内，且104CFU/g以内与常规计数结果保持良好的线性关系(标准曲线R2均大于0.99)，证明ddPCR检测酸奶中污染菌和致病菌绝对定量的准确性。

附图说明

图1为沙门氏菌ddPCR法检测的温度优化结果。图中：1:50.0℃；2:50.2℃；3:50.7℃；4:51.6℃；5:52.7℃；6:54.0℃；7:55.4℃；8:56.8℃；9:58.1℃；10:59.2℃；11:60.0℃。

图2为金黄色葡萄球菌ddPCR法检测的温度优化结果。图中：1:50.0℃；2:50.2℃；3:50.7℃；4:51.6℃；5:52.7℃；6:54.0℃；7:55.4℃；8:56.8℃；9:58.1℃；10:59.2℃；11:60.0℃。

图3为志贺氏菌ddPCR法检测的温度优化结果。图中：1:48.0℃；2:48.2℃；3:48.7℃；4:49.6℃；5:50.7℃；6:52.0℃；7:53.4℃；8:54.8℃；9:56.1℃；10:57.1℃；11:58.0℃。

图4为阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测的温度优化结果。图中：1:52.1℃；2:52.2℃；3:52.6℃；4:53.3℃；5:54.2℃；6:55.2℃；7:56.4℃；8:57.5℃；9:58.5℃；10:59.4℃；11:60.0℃。

图5为醋化醋杆菌ddPCR法检测的温度优化结果。图中：1:53.0℃；2:53.2℃；3:53.7℃；4:54.6℃；5:55.8℃；6:57.1℃；7:58.4℃；8:59.8℃；9:61.1℃；10:62.2℃；11:63.0℃。

图6为沙门氏菌ddPCR法检测特异性结果。图中：1：肠炎沙门氏菌(CICC21482)；2：鼠伤寒沙门氏菌(CICC10420)；3：乙型副伤寒沙门氏菌(CICC10437)；4：金黄色葡糖球菌(CICC10001)；5：福氏志贺氏菌(CICC21534)；6：单核增生李斯特氏菌(CICC22936)；7：阪崎克罗诺杆菌(CICC21560)；8：婴儿双歧杆菌(CICC6069)；9：大肠埃希氏菌(CICC10389)；10：嗜热链球菌(CICC6223)；11：小肠结肠炎耶尔森氏菌(CICC 21669)；12：德氏乳杆菌(CICC6077)；13：副溶血弧菌(CICC21617)；14：空肠弯曲菌(CICC22937)；15：蜡样芽胞杆菌(CICC10041)；16：氧化葡萄糖杆菌(CGMCC1.0637)；17：醋化醋杆菌(CICC22519)；18：汉氏葡糖醋杆菌(CGMCC1.811)。

图7为金黄色葡萄球菌ddPCR法检测特异性结果。图中：1：金黄色葡萄球菌(CICC10001)；2：金黄色葡萄球菌(CICC 10384)；3：金黄色葡萄球菌(CICC10201)；4：缓慢葡萄球菌(CICC 23471)；5：表皮葡萄球菌(CICC 10398)；6：腐生葡萄球菌(CICC 22941)；7：科氏葡萄球菌(CICC 23431)；8：乙型溶血性链球菌(CICC 10373)；9：蜡样芽胞杆菌(CICC 10041)；10：肠炎沙门氏菌(CICC 21482)；11：福氏志贺氏菌(CICC 21534)；12：氧化葡萄糖杆菌(CGMCC1.0637)；13：醋化醋杆菌(CICC22519)；14：汉氏葡糖醋杆菌(CGMCC1.811)；15：瑞士乳杆菌(CICC6024)；16：德氏乳杆菌(CICC6077)；17：嗜热链球菌(CICC6223)；18：植物乳杆菌(CICC6076)。

图8为志贺氏菌ddPCR法检测特异性结果。图中：1:鲍氏志贺氏菌(CICC21680)；2:鲍氏志贺氏菌(CICC21680)；3:福氏志贺氏菌(CICC21534)；4:宋内志贺氏菌(CICC21535)；5:蜡样芽孢杆菌(CICC10041)；6:阪崎克罗诺杆菌(CICC21560)；7:单核增生李斯特氏菌(CICC21633)；8:金黄色葡萄球菌(CICC10384)；9:小肠结肠炎耶尔森氏菌(CICC21669)；10:大肠埃希氏菌(CICC10389)；11:肠炎沙门氏菌(CICC 21482)；12:嗜热链球菌(CICC6223)；13:空肠弯曲菌(CICC22937)；14：醋化醋杆菌(CICC22519)；15：汉氏葡糖醋杆菌(CGMCC1.811)；16：植物乳杆菌(CICC6076)；16：瑞士乳杆菌(CICC6024)；17：德氏乳杆菌(CICC6077)；18：氧化葡萄糖杆菌(CGMCC1.0637)。

图9为阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测特异性结果。图中：1：阪崎克罗诺杆菌(CICC21560)；2：乙型副伤寒沙门氏菌(CICC 10437)；3：肠炎沙门氏菌(CICC 21482)；4：鼠伤寒沙门氏菌(CICC 10420)；5：宋氏志贺氏菌(CICC 21535)；6：福氏志贺氏菌(CICC 21534)；7：鲍氏志贺氏菌(CICC 21680)；8：副溶血弧菌(CICC21617)；9：大肠埃希氏菌(CICC 10389)；10：小肠结肠炎耶尔森氏菌(CICC 21669)；11：婴儿双歧杆菌(CICC 6069)；12：蜡样芽胞杆菌(CICC 10041)；13：醋化醋杆菌(CICC22519)；14：汉氏葡糖醋杆菌(CGMCC1.811)；15：嗜热链球菌(CICC6223)；16：植物乳杆菌(CICC6076)。

图10为醋化醋杆菌ddPCR法检测特异性结果。图中：1：醋化醋杆菌(CICC 21682)；2：醋化醋杆菌(CICC22519)；3：醋化醋杆菌(CICC 21684)；4：葡萄糖杆菌(CICC 10357)；5：肠炎沙门氏菌(CICC 21482)；6：鼠伤寒沙门氏菌(CICC 10420)；7：阪崎克罗诺杆菌(CICC21560)；8：福氏志贺氏菌(CICC 21534)；9：德氏乳杆菌(CICC6077)；10：婴儿双歧杆菌(CICC6069)；11：单核增生李斯特氏菌(CICC21633)；12：副溶血弧菌(CICC21617)；13：空肠弯曲菌(CICC22937)；14：蜡样芽胞杆菌(CICC10041)；15：汉氏葡糖醋杆菌(CGMCC1.811)；16：嗜热链球菌(CICC6223)；17：植物乳杆菌(CICC6076)。

图11为沙门氏菌ddPCR法检测灵敏度结果。图中：1:6.1×10⁶；2:6.1×10⁵；3:6.1×10⁴；4:6.1×10³；5:6.1×10²；6:6.1×10¹。

图12为金黄色葡萄球菌ddPCR法检测灵敏度结果。图中：1:3.3×10⁶；2:3.3×10⁵；3:3.3×10⁴；4:3.3×10³；5:3.3×10²；6:3.3×10¹。

图13为志贺氏菌ddPCR法检测灵敏度结果。图中：1:9.5×10⁶；2:9.5×10⁵；3:9.5×10⁴；4:9.5×10³；5:9.5×10²；6:9.5×10¹；7:9.5×10⁰。

图14为阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测灵敏度结果。图中：1:8.1×10⁷；2:8.1×10⁶；3:8.1×10⁵；4:8.1×10⁴；5:8.1×10³；6:8.1×10²；7:8.1×10¹。

图15为醋化醋杆菌ddPCR法检测灵敏度结果。图中：1:7.2×10⁷；2:7.2×10⁶；3:7.2×10⁵；4:7.2×10⁴；5:7.2×10³；6:7.2×10²；7:7.2×10¹。

图16为沙门氏菌ddPCR法检测灵敏度的线性关系。

图17为金黄色葡萄球菌ddPCR法检测灵敏度的线性关系。

图18为志贺氏菌ddPCR法检测灵敏度的线性关系。

图19为阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测灵敏度的线性关系。

图20为醋化醋杆菌ddPCR法检测灵敏度的线性关系。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

实施例1、试剂和仪器。

试验试剂包括：2×ddPCR Super Mix for Probes(Bio-Rad，Gemany)，DropletGeneration Oil(Bio-Rad，Gemany)；Droplet Reader Oil(Bio-Rad,Gemany)；Reagent D(Biotecon Diagnostics)；引物(正向引物，反向引物)由上海生物工程公司合成。；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自天根生物有限公司；磁珠法提取细菌DNA试剂盒：FoodProof Magnetic preparation Kit Ⅳ(Biotecon Diagnostics)。

培养基包括：(1)醋酸菌液体培养基：葡萄糖10％，酵母提取物1％，CaCO32％，蒸馏水1.0L，pH6.8，121℃灭菌15min。(2)醋酸菌基础固体培养基：葡萄糖50g/L，牛肉膏5g/L，酵母粉10g/L，乙醇10mL/L，琼脂15g/L，pH值6.8。(3)营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉3.0g/L，氯化钠5.0g/L，加热搅拌溶解后调节pH值为7.2，121℃高压加热灭菌15min。(4)MRS培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉粉5.0g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温801.0mL/L，磷酸氢二钾(7H₂O)2.0g/L，乙酸钠(3H₂O)5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁(7H₂O)0.2g/L，硫酸锰(4H₂O)0.05g/L，加热搅拌溶解后调节pH值为6.2，121℃高压加热灭菌15min。如果用于双歧杆菌计数，冷却至50℃后，每100mL基础培养基中加入P-109莫匹罗星锂盐一支，混匀后备用。

试验仪器包括：QX200Droplet Reader：伯乐生命医学产品有限公司；Nanodrop2000超微量紫外分光光度计：美国Thermo公司；DG8cartridge微滴生成卡：伯乐生命医学产品有限公司；Holder微滴发生器：伯乐生命医学产品有限公司；Whatman T Gradient PCR基因扩增仪：德国耶拿公司；全自动DNA提取仪：(美国Thermo公司)；电热恒温水浴锅：余姚市东方电工仪器厂；超净工作台：江苏苏州净化设备公司；3K15台式高速离心机：SIGMA；MIR254型低温恒温培养箱：日本三洋株式会社；MS3涡旋混匀器：IKA公司；高压灭菌锅：日本Hirayama公司；PH计：METTLER TOLEDO；卤素灯(500W)；低温离心管架；微量移液器(0.1～2.5μL；1～10μL，10～100μL，CE生产)及其它辅助设备。

实施例2、菌株。

本项实验中所采用的菌株详见表3.1。所有菌株采购到货后首先用各自的指示培养基进行活化，在适宜的温度下培养，转接传代三次以后备用。

表3.1试验用菌株

实施例3、去除死菌的最优方法。

(1)将传达三次的细菌培养液充分摇匀，吸取100μL增菌液加入到2mL的灭菌透明离心管中；

(2)将Reagent D从-20℃取出，室温放置融化，取上述增菌液4倍体积的Reagent D溶液加入到(1)中，室温下避光培养5min；

(3)将离心管放置于低温离心管架中，放在500W的卤素灯相距15cm-20cm的正下方，曝光培养5min后，8000r/min离心5min；

(4)用移液器小心去除上清液，向离心管中加入100μL无菌去离子水充分混匀，此菌悬液即可直接用于基因组的提取。

实施例4、活性污染菌和致病菌基因组DNA提取方法比较。

(1)试剂盒法

a向2mL离心管中加入1mLReagent D处理后细菌培养液，10000r/min离心1min，尽量吸净上清。

b向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，震荡混匀至菌体彻底悬浮。

C向混悬液中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

d加入220μL缓冲液GB，震荡15s，70℃保温10min，溶液应呈现清亮状态，短时间离心以去除管盖内壁上附着的水珠。

e加220μL无水乙醇，充分震荡混匀15s，此时可能出现絮状的沉淀物，短时间离心以去除管盖内壁上附着的水珠。

f将上述全部溶液和絮状沉淀物转移至吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管内)，静置2min，12000rpm离心时间为30s，弃滤液，将吸附柱CB3放入收集管中。

g向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，弃滤液，将吸附柱CB3放入收集管中。

h向吸附柱CB3中加入600μL缓冲液PW，12000rpm离心30s，弃滤液，将吸附柱CB3放入收集管中。

I重复上述步骤。

J将吸附柱CB3放入收集管中，转速为12000r/min下空甩吸附管2min，弃滤液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

k将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加80μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，洗脱DNA溶液。

(2)热裂解法

a向1.5mL容量的离心管中加入1mLReagent D处理后细菌培养液，13000r/min高速离心1min，收集沉淀。

b用ddH₂O溶解沉淀，涡旋震荡至菌体彻底悬浮，10000r/min离心1min，收集沉淀

c重复上述步骤两次，洗涤菌体。

d将洗涤后的菌体用80μL灭菌双蒸水重新溶解，将离心管煮沸8min，10000r/min离心1min后收集上清液，-20℃保存。

(3)FoodProof磁珠提取仪法

a取1mLReagent D处理后细菌培养液加入至2ml试管中，8000r/min离心5min，弃上清，添加700μL的Lysis Buffer以及80μL的蛋白酶K，65℃振荡水浴30min，12000×g离心力下离心5min，准备好上清用于下面DNA提取。

b准备仪器需要的Tip plate、Binding plate、Washing plate I、Washing plateII、Washing plateⅢ、Elution plate，并根据需要使用微量移液器或排式微量移液器将每种板子对应的Buffer添加至需要使用的样品孔。

c其中Binding plate每个样品孔需添加250μL的Binding buffer和20μL的磁珠颗粒且两种液体需吹打混匀；Washing plate I每个样品孔需添加600μL的Washing bufferI；Washing plate II每个样品孔需添加800μL的Washing buffer II；Elution plate每个样品孔需添加80μL的Elution buffer。

d分别移取第一步前处理离心完毕500μL裂解液转移至已添加有Binding buffer和磁珠颗粒的Bind plate相应样品孔。

e打开仪器电源开关，选择所需的应用程序(细菌提取选择MPKⅣ程序)。

f重复按STARRT按钮，根据屏幕指示分别将Tip plate、Binding plate、Washingplate I、Washing plate II、Washing plateⅢ、Elution plate放置到指定位置。

g当所有平板装载完毕后，点击START按钮仪器开始运行核酸自动提取程序大约需要35～40分钟。

h程序运行完毕后，根据仪器屏幕指示开始逐步卸载已经完成核酸提取任务的Tipplate、Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ、Elutionplate，注意此时DNA已经溶解于Elution plate可用于后续PCR实验，及时将已经完成核酸提取任务的Binding plate、Washing plate I、Washing plate II、Washing plateⅢ相应样品孔的废液使用微量移液器移除。

i使用微量移液器将Elution plate上提取的DNA分别转移至干净的离心管中定容至80μL，可直接用于PCR实验或4-8℃保存几天，或-20℃长期保存。

比较结果：用三种方法分别提取沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的基因组DNA，用Nanodrop 2000超微量紫外分光光度计测试所提取的基因组DNA的浓度和质量，测定结果见表3.3。结果显示，试剂盒法提取的细菌DNA的浓度在这三种方法中是最低的而且提取的DNA的质量参差不齐，相差较大；热裂解法虽然提取的DNA的浓度最高，但是由于细菌破裂后残留的杂质较多，无法去除杂质导致提取的DNA质量不高，其中的杂质可能会影响后续PCR的扩增效率；FoodProof磁珠法提取的DNA的浓度较高，而且DNA的质量最好，所含杂质最少纯度最高，所以，对于这八种细菌来说FoodProof磁珠法是提取细菌DNA的最佳方法。

表3.3 DNA提取的质量和浓度

实施例5、单一污染菌和致病菌数字PCR检测方法中的引物设计。

针对发酵乳中常见污染菌和致病菌选择了：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌。为研究的目标菌株，通过分析上述菌株的基因序列，研究设计引物探针，经试验验证，最终确定上述菌株的引物探针如下表。

3.2引物探针序列

实施例6、单一污染菌和致病菌ddPCR检测方法。

微滴式数字PCR检测方法分为以下4个步骤：

a.配制PddCR反应体系，所有样品进行数字PCR反应的体系为：2×ddPCR SuperMix for Probes 10μL，将引物稀释到10μmol/L，取1.2μL上下游引物和0.4μL探针加入体系，加入4.4μL的模板，最后用灭菌双蒸水补足20μL。

b.将充分混匀的PCR反应体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入70μLDroplet Genera-tion Oil，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应。随后将生成的微滴转移到ddPCR的96孔中，用封膜仪对96孔板封膜，准备进行PCR反应。

c.ddPCR的反应程序：95℃预变性，10min；94℃变性，1min；56℃退火，45s；进行40个循环，98℃10min。

d.ddPCR反应结束后将96孔板放入QX200Droplet Reader，依次录入样品信息，检测开始后仪器会按顺序自动识别每个样品的微滴，在微滴读取油的配合下微滴依次通过双色检测器，根据微滴发出的荧光信号的强度判定阳性和阴性结果，并记录下每个样品的阳性和阴性的微滴数。信号采集完毕后，软件Quantasoft将计算出最终结果并以图像的形式给出。

实施例7、单一污染菌和致病菌ddPCR检测方法的温度优化。

在设计ddPCR扩增的反应程序时，对ddPCR的退火温度进行优化。分别对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌这5株菌设置退火温度约为52-63℃的温度梯度ddPCR反应。根据微滴检测仪生成的结果筛选出最佳反应温度。

优化结果如下：

(1)沙门氏菌ddPCR法检测的温度优化结果：对沙门氏菌的普通PCR反应程序中的退火温度进行优化，设置退火温度为55℃，梯度差异为5℃，扩增反应结束后，将96孔板转移到微滴检测仪中进行检测，结果如图1所示，从50℃～56.8℃的扩增反应效率差距不大，54℃时微滴数量较多，且微滴比较密集，特异性较好，所以沙门氏菌ddPCR反应的最佳退火温度为54℃。

(2)金黄色葡萄球菌ddPCR法检测的温度优化结果：设置金黄色葡萄球菌的PCR反应程序的退火温度为55℃，梯度差异为5℃，扩增反应结束后，将96孔板转移到微滴检测仪中进行检测，结果如图2所示，50.2℃时微滴数量和质量都较好，所以金黄色葡萄球菌ddPCR反应的最佳退火温度为50.2℃。

(3)志贺氏菌ddPCR法检测的温度优化结果：对志贺氏菌的PCR反应程序设置退火温度为53℃，梯度差异为5℃，扩增反应结束后，将96孔板转移到微滴检测仪中进行检测，结果如图3所示，最终选取50.7℃为志贺氏菌ddPCR反应的最佳退火温度。

(4)阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测的温度优化结果：设置阪崎克罗诺杆菌的PCR反应程序的退火温度为56℃，梯度差异为4℃，扩增反应结束后，微滴检测仪的检测结果如图4所示，温度为52.6℃时，微滴数量较多且相对集中，所以，最终选取52.6℃为阪崎克罗诺杆菌ddPCR反应的最佳退火温度。

(5)醋化醋杆菌ddPCR法检测的温度优化结果：对醋化醋杆菌的PCR反应程序设置退火温度为58℃，梯度差异为5℃，扩增反应结束后，将96孔板转移到微滴检测仪中进行检测，结果如图5所示，最终选取54.6℃为醋化醋杆菌ddPCR反应的最佳退火温度。

实施例8、单一污染菌和致病菌ddPCR检测特异性验证。

分别提取实施例2中所列菌株的纯培养物过夜菌液的DNA，将提取的DNA分别稀释到浓度为10³拷贝数，按照分别优化好的反应条件进行沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的单一菌株的特异性验证试验。

检测特异性结果如下：

(1)沙门氏菌ddPCR法检测特异性结果。将表3.1所列的供试菌株提取DNA后，用沙门氏菌的引物进行PCR扩增，随后用微滴检测仪进行检测。结果如图6，三株沙门氏菌可以检测出阳性微滴信号，而阴性和其他非沙门氏菌均未出现扩增，表明此实验设计的沙门氏菌的引物特异性较强。

(2)金黄色葡萄球菌ddPCR法检测特异性结果

将表3.1所列的供试菌株提取DNA后，用金黄色葡萄球菌的引物进行PCR扩增，随后用微滴检测仪进行检测。结果如图7，三株金黄色葡萄球菌被检测为阳性微滴信号，而阴性和其他非金黄色葡萄球菌均未出现扩增，表明此实验设计的金黄色葡萄球菌的引物特异性较强。

(3)志贺氏菌ddPCR法检测特异性结果。用志贺氏菌的引物对表3.1所列的供试菌株进行PCR扩增，随后用微滴检测仪进行检测。结果如图8，志贺氏菌属的四种菌株都可以检测出阳性微滴信号，而阴性和其他菌株均未出现扩增，表明此实验设计的志贺氏菌的引物特异性较强。

(4)阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测特异性结果。用阪崎克罗诺杆菌的引物对表3.1所列的供试菌株进行PCR扩增，随后用微滴检测仪进行检测。结果如图9，阪崎克罗诺杆菌被判定为阳性，而阴性和其他菌柱均未出现扩增，表明此实验设计的阪崎克罗诺杆菌的引物特异性较强。

(5)醋化醋杆菌ddPCR法检测特异性结果。用醋化醋杆菌的引物对表3.1所列的供试菌株进行PCR扩增，随后用微滴检测仪进行检测。结果如图10，醋化醋杆菌属的菌株的被判定为阳性，阴性对照和其他菌柱均被判定为阴性，表明此实验设计的醋化醋杆菌的引物特异性较强。

实施例9、单一污染菌和致病菌ddPCR检测灵敏度验证。

发酵乳购自当地超市，分别按照国标法检测证实没有被沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌污染。将这5种污染菌分别人工添加到发酵乳中，保证样品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的浓度依次为10℃FU/g→10⁸CFU/g，随后完成污染物中细菌的基因组DNA的提取工作，并用ddPCR方法检测各污染菌株污染酸奶的灵敏度。

分别提取沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的DNA作为模板，用灭菌双蒸水做为阴性对照的模板，进行ddPCR检测，确定每株菌的ddPCR检测方法的灵敏度。

(1)沙门氏菌ddPCR法检测灵敏度结果。沙门氏菌的活菌培养物的平板计数浓度为6.1×10⁷CFU/g，灵敏度检测结果如图11，第一个反应的DNA模板浓度为6.1×10⁶CFU/g，由于模板浓度太高，微滴数量全部为阳性，不符合泊松分布条件，因此，此反应不做为有效数据来统计。当模板浓度为6.1×10¹CFU/g时，阳性微滴数量极少，微滴检测仪分析出的拷贝数为0.35cpies/μL，所以，ddPCR方法检测沙门氏菌的计数灵敏度为6.1×10¹CFU/g。

(2)金黄色葡萄球菌ddPCR法检测灵敏度结果。金黄色葡萄球菌的活菌培养物的平板计数浓度为3.3×10⁷CFU/g，灵敏度检测结果如图12所示，反应一的原始模板浓度太高，无阴性微滴，数据无效。当原始模板浓度为3.3×10¹CFU/g时，检测出的拷贝数为0.20cpies/μL，所以，ddPCR方法检测金黄色葡萄球菌的计数灵敏度为3.3×10¹CFU/g。

(3)志贺氏菌ddPCR法检测灵敏度结果。志贺氏菌的活菌培养物的平板计数浓度为9.5×10⁷CFU/g，灵敏度检测结果如图13，1号和2号反应由于模板浓度太高，不做分析。7号反应的原始模板浓度为9.5×10℃FU/g，最后分析出的拷贝数为0.15cpies/μL，所以，ddPCR方法检测志贺氏菌的计数灵敏度为9.5×10℃FU/g。

(4)阪崎克罗诺杆菌ddPCR法检测灵敏度结果。阪崎克罗诺杆菌的活菌培养物的平板计数浓度为8.1×10⁸CFU/g，ddPCR检测灵敏度结果如图14所示，将原始菌液的DNA模板连续稀释3次以后，可以检测出阳性和阴性微滴数，当浓度为8.1×10℃FU/g时，检测结果为阴性，无法检测到模板的拷贝数，最后分析出的拷贝数为0.27cpies/μL，所以，ddPCR方法检测阪崎克罗诺杆菌的计数灵敏度为8.1×10¹CFU/g。

(5)醋化醋杆菌ddPCR法检测灵敏度结果。醋化醋杆菌的活菌培养物的平板计数浓度为7.2×10⁷CFU/g，ddPCR法检测灵敏度结果如图15，1号和2号反应由于模板浓度太高，不做分析。当醋化醋杆菌的模板浓度为7.2×10¹CFU/g时，微滴分析仪报出的拷贝数为0.49cpies/μL，所以，ddPCR方法检测醋化醋杆菌的计数灵敏度为7.2×10¹CFU/g。

实施例10、单一污染菌和致病菌ddPCR绝对定量的研究。

基于沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc、志贺氏菌ipaH、阪崎克罗诺杆菌Seq、醋化醋杆菌AB111902.1相应的靶基因在该菌的全基因组中存在的理论拷贝数，根据ddPCR得出的这八种污染菌株中每微升的实测拷贝数的结果，可计算出20μL的体系中存在的拷贝数，最终的实测灵敏度和偏差率的计算公式如下：

实测灵敏度＝20μL拷贝数×18.18(即：提取DNA的体积/体系中模板体积)÷理论拷贝数；

偏差率＝实测灵敏度-计数灵敏度/计数灵敏度×100％。

为了验证ddPCR检测方法的可行性，将不同浓度的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌进行ddPCR检测，分析计数结果与ddPCR检测结果的线性关系。

绝对定量的研究结果如下：

根据沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌的理论拷贝数和实际检测结果拷贝数计算出实测灵敏度，见表3.4。比较实测灵敏度和计数灵敏度的差值，当实测灵敏度大于计数灵敏度时，偏差率为正偏差；当实测灵敏度小于计数灵敏度时，偏差率为负偏差，结果见表3.5。

结果显示，所有细菌的实测灵敏度均略高于计数灵敏度，且经过偏差率计算，ddPCR的实测灵敏度与计数灵敏度偏差率均低于25％，保证了ddPCR的进行绝对定量检测实际应用的可行性。

为了验证ddPCR检测方法的可行性，将不同浓度的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、阪崎克罗诺杆菌、醋化醋杆菌进行ddPCR检测，分析计数结果与ddPCR检测结果的线性关系。如图16-20所示，根据菌株的拷贝数和菌落数的对应关系所生成的标准曲线显示R²均大于0.99，说明ddPCR检测酸奶中污染菌的灵敏度线性关系良好，也为ddPCR的进行绝对定量检测实际应用的范围进行了保障。

表3.4拷贝数和实测灵敏度关系

表3.5灵敏度的偏差率

综上10个实施例可见，本发明可以有选择性的渗透进入死菌的细胞中，在卤素灯的照射下使Reagent D的光敏集团转化为自由基，并能和DNA分子发生共价交联反应，从而阻断死菌的DNA分子发生PCR扩增。本研究用Reagent D处理细菌的培养液，和ddPCR技术相结合从一定程度上排除了死菌对检测方法的影响，实现了定量检测活菌的ddPCR检测。本发明的ddPCR方法的结果判定是根据反应结束后微滴检测仪收集的发出荧光信号的微滴数量，阳性为荧光信号值高于阈值的反应，阴性为荧光信号值低于阈值的反应，然后将阳性微滴数和阴性微滴数用泊松分布公式计算出DNA分子的拷贝数。所以微滴检测仪最后收集到的荧光信号的强弱直接反应出ddPCR的准确性和PCR的扩增效率。影响PCR扩增效率的因素很多，例如引物和探针的浓度，引物的扩增效率，合适的退火温度等。本研究对这些影响因素都进行了优化，最终筛选出每一株菌的最佳反应条件。本发明的微滴发生器将配置好的PCR反应混合液打散并被包裹在Droplet Generation Oil中形成微滴，进行PCR扩增反应。模板DNA的浓度对ddPCR的检测结果有很大的影响。如果模板中的拷贝数低于所生成的微滴数量，每一个微滴中有一个或没有含有目标模板的DNA分子，在PCR反应完成后，含有目标模板的微滴发生扩增被微滴检测仪检测为阳性，不含目标模板的微滴没有扩增被检测为阴性，根据这两种微滴的比例通过泊松分布可以准确的实现绝对定量。如果模板中的拷贝数高于或者接近拷贝数，该浓度下所有的微滴处于饱和状态，无阴性微滴或者阴性微滴的数量太少，则不能满足泊松分布的条件，绝对定量的结果与真实值相差太大，则无法准确的实现ddPCR的绝对定量。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室）

<120> 一种针对发酵乳中以醋化醋杆菌为主的系列杂菌污染的高精度特异性数字PCR检测方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tgcggtactg ttaattacca cgc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA