阅读说明：本技术 一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法 (A kind of method that 22 kinds of sugar, sugar alcohol and alcohols detect simultaneously in fruit juice ) 是由 宋卫得 高尧华 许美玲 叶佳宇 李林杰 林令海 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法,属于分析化学领域,本发明采用积分脉冲安培-离子色谱法,通过优化前处理方法,研究影响组分分离的实验因素,建立了一次性同时检测果汁中22种糖类、糖醇、醇类(2,3-丁二醇、丙二醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、鼠李糖、阿拉伯糖醇、山梨醇、海藻糖、半乳糖醇、甘露醇、2-脱氧-D-葡萄糖、阿拉伯糖、蜜二糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖)的方法,解决了对果汁中糖类、糖醇及醇类多组分准确分析的技术难题,该方法快速、准确、灵敏,实现了多类别多组分的同时分析,对果汁成份检测做出重要的贡献。(The invention discloses 22 kinds of sugar in a kind of fruit juice, the method that sugar alcohol and alcohols detect simultaneously, belong to analytical chemistry field, the present invention uses integrated pulsed amperometric-chromatography of ions, by optimizing pre-treating method, research influences the empirical factor of component separation, it establishes disposable while detecting 22 kinds of carbohydrates in fruit juice, sugar alcohol, alcohols (2, 3- butanediol, propylene glycol, methanol, glycerine, antierythrite, xylitol, rhamnose, arabite, sorbierite, trehalose, galactitol, mannitol, 2-deoxy-D-glucose, arabinose, melibiose, glucose, galactolipin, fructose, ribose, sucrose, gossypose, maltose) method, it solves to carbohydrate in fruit juice, the technical problem that sugar alcohol and alcohols multicomponent are accurately analyzed, this method is quick, accurately, it is sensitive, it realizes multi-class more It is analyzed while component, important contribution is made to fruit juice detection.)

一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法。

背景技术

果汁是人们日常生活中的重要饮料，果汁中含有蛋白质、氨基酸、糖类、糖醇类等成分。其中糖类化合物是人们维持生命活动所需能量的主要来源。糖醇是糖类的醛基或酮基被还原成羟基而形成的物质，主要是由对应的糖反应生成的甜味剂，不会引起血糖升高，因此具有预防糖尿病和肥胖病的作用。醇类是分子中含有跟烃基或苯环侧链上的碳结合的羟基的化合物，许多醇类对人体健康有益，但有些醇类具有一定的毒性。糖类、糖醇类组分的检测既是分析化学领域的难点，也是分析测试领域的研究热点，目前我国食品安全国家标准《预包装食品营养标签通则》中规定，必须在食品标签标注食品的糖含量。

果汁中糖、糖醇和醇类的含量大小直接影响果汁的质量。当前糖类、糖醇、醇类主要的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、酶电极法、离子色谱法等。气相色谱法，具有快速、灵敏的优点，但前处理步骤复杂，定量不够准确。液相色谱法，具有准确、选择性好的特点，但灵敏度低。酶电极法，一般仅对一种糖类进行检测，专一性好，但是检测效率不高。离子色谱法具有简便、快速、灵敏、准确等优点，是一种新型多组分同时检测的理想方法。

目前，人们对于果汁中多种糖、糖醇及醇类同时检测的方法虽然有所研究，但在目前资料库中所能检索到的仅仅是对某一类组分（如单纯的糖类或醇类）或者同时检测的组分数量较少（仅对10种左右的糖和糖醇同时分析），不能满足日益增长的检测需求，因此，研究并建立一种适用性强、选择性好、灵敏度高的多种糖、糖醇及醇类同时检测的方法，具有重要的现实意义和应用价值。

本发明的目的是针对上述现有技术的不足，采用积分脉冲安培-离子色谱法，优化前处理检测方法，通过对组分分离的影响因素的研究，建立了一次性同时检测果汁中22种糖类、糖醇、醇类的方法，该方法快速、简便、灵敏度高、稳定性好，实现了快速分析和绿色分析，解决了糖、糖醇及醇类多组分同时分析的技术问题。

为达到上述目的，本发明公开了一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法，其检测步骤如下；

步骤一、混合标准溶液的配置：

将2,3-丁二醇、丙二醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、鼠李糖、***糖醇、山梨醇、海藻糖、半乳糖醇、甘露醇、2-脱氧-D-葡萄糖、***糖、蜜二糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖的标准溶液按需要配置混合标准储备液；

步骤二、待测样品前处理：

取果汁待检样品0.100 g于100 mL烧杯中，加入超纯水约80 mL，混匀静置10 min，采用0.10 mol/L氢氧化钠溶液调节稀释液pH值至6.5～8.6，将其全部转移至100 mL容量瓶中，采用超纯水定容至刻度，摇匀、静置15 min，取10.0 mL溶液，先过0.22 μm滤膜，再过已经预活化的IC-RP10柱，弃去前3 mL，收集后段清液，待检测。

步骤三、离子色谱条件及多级梯度淋洗条件

分析柱：CarboPac MA1(4×250 mm)；

保护柱：CarboPac MA1(4×50 mm)；

工作电极：Gold；

参比电极：AgCl电极；

流动相：A:1000 mmol/L NaOH溶液,B：超纯水；

流速：0.40 mL/min；

柱温：30 ℃；

进样量：10μL；

多级梯度淋洗条件：

多级梯度淋洗程序为：0.0-80.0 min时，淋洗液NaOH浓度为500.0 mmol/L；80.0-85.0min，淋洗液NaOH浓度为500.0-600.0 mmol/L；85.0-105.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0mmol/L；105.0-110.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0-500.0 mmol/L；110.0-120.0 min，淋洗液NaOH浓度为500.0 mmol/L；详见表1。

表1 离子色谱淋洗条件

步骤四、校准曲线绘制：

将步骤一中配置的混合标准溶液按照步骤三给出的色谱分析条件与多级梯度淋洗条件使用离子色谱仪进行检测，以待测组分质量浓度为横坐标，以待测组分峰面积为纵坐标，来绘制校准曲线，外标法定量；

步骤五、样品溶液的检测：

将步骤二中所得清液按照步骤三给出的色谱分析条件与多级梯度淋洗条件使用离子色谱仪进行检测，并计算结果；

步骤六、结果计算：

通过步骤四混合标准溶液所测得的结果来校正步骤五所测得计算结果，从而计算出所测果汁中各组分含量。

作为优选，上述溶液均使用电阻率为 18.2 MΩ·cm的超纯水配制。

有益效果：

1、对于果汁中糖、糖醇及醇类多组分物质同时检测，一直是分析化学领域的技术难点，本发明一次性同时测定了果汁中22种糖、糖醇及醇类，解决了目前采用多种标准、多种仪器、多种前处理方法进行多种组分测定时效率低的技术难题，大幅提高了检测效率，降低了检测成本。

2、同时分离检测果汁中22种糖类、糖醇、醇类组分是一项技术难度很大的工作。为了提高组分的整体分离度，通过实验分析对比，本发明选择在前80 min内采用等度淋洗的方法，在85 min后采用600 mmol/L的氢氧化钠溶液进行色谱柱的强力冲洗，去除影响待测组分的干扰物，可以大幅度提高检测的准确度。

3、本发明通过多因素多基质考察分析，先后研究分析了多级梯度淋洗条件、初始淋洗浓度、色谱柱温度、pH值等实验影响因素，最大程度地提高了多种组分同时测定时方法的准确性和适用性。

4、本发明通过深入研究分析，发现了溶液pH值对果汁中22种组分同时检测的重要影响，pH值的变化导致某些组分含量发生了大幅波动。通过调节溶液pH值至6.5～8.6，可以大幅提高检测的准确度和精密度。

5、本发明研究了色谱柱温度对检测的重要影响，色谱柱温度的细小变化，同样会导致组分重叠。在30 ℃柱温时，恰好能满足22组分的定性定量要求。

6、本发明检测方法操作简便快速、检测灵敏度高，经过简单前处理操作，即可上机检测。

7、在本发明检测方法中并没有使用或产生对人类健康、生态环境有害的溶剂、试剂、副产物，符合绿色分析的理念。

附图说明

图1为22种糖、糖醇及醇类混合标准溶液的离子色谱图。

图2为不同初始淋洗液浓度下混合标准溶液的离子色谱图。

图3为不同柱温下混合标准溶液的离子色谱图。

图4为溶液pH值对6种组分检测的影响。

图5为6种果汁样品的离子色谱图。

附图中各编号对应的物质: 1. 2,3-丁二醇（2,3-Butanediol）；2. 丙二醇（Propanediol）；3. 甲醇（Methanol）；4. 丙三醇（Glycerol）；5. 赤藓糖醇（Erythritol）；6. 木糖醇（Xylitol）；7. 鼠李糖（L-rhamnose）；8. ***糖醇（Arabinitol）；9. 山梨醇（Sorbitol）；10. 海藻糖（Trehalose）；11. 半乳糖醇（Galactitol）；12.甘露醇（Mannitol）；13. 2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose）；14. ***糖（Arabinose）；15.蜜二糖（Melibiose）；16. 葡萄糖（Glucose）；17. 半乳糖（Galactose）；18. 果糖（Fructose）；19. 核糖（Ribose）；20. 蔗糖（Sucrose）；21.棉子糖（Raffinose）；22.麦芽糖（Maltose）。

具体实施方式

实施例一：一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法

1.仪器和试剂

ICS5000+离子色谱系统配有电化学检测器和自动进样器（美国Thermo Scientific公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；电子天平（梅特勒公司ML802/02）；实验用水：超纯水（电阻率18.2MΩ.cm）；糖类、糖醇、醇类标准品或标准试剂（纯度>98%）；氢氧化钠溶液（50%w/w，Fisher Chemical）；盐酸（优级纯）；IC-RP10柱（Agela Technologies）。

2.离子色谱条件

CarboPac MA1(4×250 mm)分析柱，CarboPac MA1 (4×50 mm) 保护柱；工作电极：Gold(Au)；参比电极：AgCl电极；流动相：NaOH淋洗液（氮气保护）；流速：0.40 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10μL。初始淋洗浓度：500 mmol/L NaOH溶液。

3.多级梯度淋洗条件：

多级梯度淋洗程序为：0.0-80.0 min时，淋洗液NaOH浓度为500.0 mmol/L；80.0-85.0min，淋洗液NaOH浓度为500.0-600.0 mmol/L；85.0-105.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0mmol/L；105.0-110.0 min，淋洗液NaOH浓度为600.0-500.0 mmol/L；110.0-120.0 min，淋洗液NaOH浓度为500.0 mmol/L。

4.混合标准溶液的配置：

将2,3-丁二醇、丙二醇、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、木糖醇、鼠李糖、***糖醇、山梨醇、海藻糖、半乳糖醇、甘露醇、2-脱氧-D-葡萄糖、***糖、蜜二糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、蔗糖、棉子糖、麦芽糖的标准品或标准溶液按需要配置一定浓度的混合标准溶液，在配置混合标准溶液的过程中，调节溶液酸碱性配成pH值至6.5～8.6的混合标准溶液。

5.待测样品前处理：

取果汁待检样品0.100 g于100 mL烧杯中，加入超纯水约80 mL，混匀静置10 min，采用0.10 mol/L氢氧化钠溶液调节稀释液pH值至6.5～8.6，将其全部转移至100 mL容量瓶中，采用超纯水定容至刻度，摇匀、静置15 min，取10.0 mL溶液，先过0.22 μm滤膜，再过已经预活化的IC-RP10柱，弃去前3 mL，收集后段清液，待检测。

按照上述实验分析的条件，对混合标准溶液的22种糖、糖醇及醇类进行检测，其检测结果如图1所示。

实施例二：流速对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下先后测试淋洗液的流速为0.30 mL/min、0.40 mL/min、0.50 mL/min、0.60 mL/min流速条件下混合标准溶液的组分分离情况，其淋洗液流速与系统压力的关系如表2所示。

表2 淋洗液流速与系统压力的关系

从表2可以得出淋洗液流速在0.30 mL/min时，系统压力为885 psi，因为流速较低，压力较小，峰宽增大，峰灵敏度下降，整体分离度不高。0.50 mL/min流速时，系统压力达到1430 psi，虽然组分灵敏度有所提高，但是个别组分间的分离度已不理想。0.60 mL/min流速时，系统压力达到1705 psi，系统压力较大，接近色谱柱推荐压力上限2000 psi，组分的整体分析时间缩短，但是组分的整体分离度降低，而且压力较大会在一定程度上影响色谱柱的使用寿命。0.40 mL/min流速时初始压力1155 psi，压力大小适中，组分灵敏度和分离度均能满足检测要求。因此，从系统稳定性、分离度、灵敏度因素考虑，本发明选择在0.40mL/min流速下进行实验。

实施例三：多级梯度淋洗条件对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下先后测试初始淋洗液浓度分别在420、450、480、500、520、550 mmol/L的条件下混合标准溶液组分分离情况，由于初始浓度对组分20、21、22这三种组分的分离度影响很小，这里重点讨论初始浓度对前19种组分的影响，其混合标准溶液的组分分离情况如图2所示。

从图2中可以看出，初始淋洗浓度分别为420、450 mmol/L时，组分7和8以及组分10和11均未实现分离；初始淋洗浓度480 mmol/L时，组分10和11分离度不高；初始淋洗浓度分别为520、550 mmol/L时，组分14和15均未实现完全分离；初始淋洗浓度500 mmol/L时，这19种组分的整体分离度和灵敏度均比较理想。因此，本发明选择初始淋洗浓度500 mmol/L进行实验检测。

实施例四：色谱柱温对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下先后测试在25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃色谱柱温条件下，22种糖类、糖醇、醇类的分离效果，其检测结果如图3所示。

从图3中可以看出，25℃和27.5℃温度条件下，色谱柱温较低，多数组分的分离效果良好，但组分10海藻糖和组分11半乳糖醇，完全重叠，未实现分离。当色谱柱温为32.5℃时，离子交换速率提高，柱效得到提高，缩短了分析时间，特别是组分20、21、22保留时间缩短，但降低了柱选择性，组分14***糖和组分15蜜二糖，几乎重叠在一起，无法确保定量准确性。在35℃柱温条件下，共出现了3对组分共洗脱，分别是组分7和8，组分9和10，组分14和15，可见随着温度升高，组分之间的分离度显著降低。另外，研究还发现，随着温度升高，组分18果糖和组分22麦芽糖的灵敏度越来越小，在35℃柱温时均为检出，由此可见，柱温对组分灵敏度的影响同样很大。在30℃柱温时，分析速率适中，分离度良好，22种组分的总体分离效果好，由此可见，温度对22种组分同时检测有显著的影响，从提高方法的分离度、灵敏度、选择性角度考虑，本发明选取在30℃柱温下进行实验分析。

实施例五：pH值对检测的影响

按照实施例一中的实验分析的条件，在其他条件不变的情况下，依次配置不同pH值（2.0-12.0）的同一理论浓度的混合标准溶液进行上机检测，实验结果表明，葡萄糖、丙三醇、半乳糖、核糖、蜜二糖、麦芽糖这6种组分检测含量受溶液pH值的影响较大，其他组分受pH值影响较小，不同pH值对葡萄糖、丙三醇、半乳糖、核糖、蜜二糖、麦芽糖6种组分对检测的影响如图4所示。

从图4中可以看出，当pH值小于8.6时，葡萄糖、半乳糖、核糖、蜜二糖、麦芽糖这5种糖检测含量几乎不变，而当pH值大于10.5时，葡萄糖含量大幅增加，而另外4种糖检测含量均出现下降，这是因为麦芽糖、蜜二糖等二糖或者多糖，可以在碱性条件下，水解生成一定量的葡萄糖。而丙三醇在pH值小于6.5和pH值大于8.6时，检测含量均出现一定程度的增大，这是因为丙三醇是一种三元醇，受酸碱性影响较大，在强酸或者强碱条件下，其在溶液中的离子化程度更高，测定含量更大。综合考虑22种组分物化特性、解离程度、灵敏度等影响因素，本发明选择pH值在6.5-8.6条件下，进行分析检测。

实施例六：线性范围与检出限

配置不同浓度的混合标准溶液，使用实施例一中色谱条件进行校准曲线拟合。通过色谱峰信噪比来计算待测组分的检出限（S/N=3），在0.10 mg/L～20.0 mg/L浓度范围内，进行了8个浓度水平（0.10、0.20、0.40、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 mg/L）混合标准溶液的检测和线性拟合，其结果如表3所示。

表3 检测组分的线性范围、线性方程、相关系数及检出限（S/N=3）

Y：峰面积（nC．min），X：质量浓度（mg/L）

从表3可以看出，22种组分线性相关系数均大于0.999，说明在该实验条件下，组分同时检测时线性良好。除了甲醇外，其他21种组分检出限在0.0059～0.2059 mg/L之间。

实施例七：回收率与精密度

分别选取梨汁、桃汁、混合果汁3种样品，依次向3个样品中添加浓度水平分别为0.50mg/L、1.00 mg/L、5.00 mg/L的混合标准溶液，每个浓度水平进行6次平行测定实验，来验证不同果汁基质检测方法的回收率和精密度，根据基质浓度、添加浓度和添加后检测浓度计算回收率。表4列出三浓度水平、六次检测的平均回收率和RSD数据。

表4 检测组分的回收率及精密度（RSD）（n=6）

从表4中可以看出，除了2,3-丁二醇和甲醇回收率不高，在0.50 mg/L添加浓度水平下，分别为71.71%和73.34%；在1.00 mg/L添加浓度水平下，只有2,3-丁二醇回收率低于80%，这是因为两种醇类挥发性强，在前处理过程有所损失；其他20种组分回收率在81.42%～106.17%之间，所有回收率数据均满足食品理化检验技术要求（检测含量小于0.10 mg/L，回收率应在60%～120%），这充分说明22种糖类、糖醇、醇类回收率良好。三浓度水平下，22种组分检测RSD在1.03%～11.12%范围内。从总体上来看，三种基质、六次平行检测的回收率数据结果，符合食品理化检测要求，说明该检测方法准确性高、精密度好。

实施例八：实际样品的检测

抽取6种常见果汁饮料（苹果汁、葡萄汁、梨汁、芒果汁、桃汁、混合果汁），按照实施例一中离子色谱条件和前处理步骤，进行了实际样品中22种糖类、糖醇、醇类含量的检测分析，表5是检测组分数据结果，图5是实际样品检测的离子色谱图。

表5 果汁样品的检测结果（mg/L）

“－”：未检出

从6种果汁色谱图对比来看，6种果汁中共检出10种组分，果汁中含有的主要糖类是葡萄糖、果糖、蔗糖，葡萄汁中葡萄糖含量较高，并且检出少量***糖；果汁中含有的主要糖醇是丙三醇、山梨醇，苹果汁中检出少量木糖醇和甘露醇；特别注意的是在葡萄汁中检出了有毒害的2,3-丁二醇，说明该批次果汁在生产或包装过程中质量控制存在问题。从检出组分数量来看，检出数量较多的依次是苹果汁、桃汁、混合果汁，而混合果汁属于新型的营养膳食饮料，其中各种糖类组分种类多，各组分含量分布均匀，常饮用有利于人体营养均衡。

本发明通过对初始淋洗浓度、流速、柱温、溶液pH值等多种实验影响因素的深入研究，探索出了果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的色谱分离条件，建立了积分脉冲安培-离子色谱法同时检测果汁中22种糖、糖醇及醇类的分析方法。该方法简便、快速、灵敏、准确，完全适于果汁中22种糖、糖醇及醇类的快速分析。

本发明的保护内容不局限于以上实施例，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。