治疗肝病的方法
阅读说明：本技术 治疗肝病的方法 (The method for treating hepatopathy ) 是由 J.G.贝茨 D.G.C.布雷肯里奇 G.R.布达斯 J.T.莱尔斯 于 2018-04-11 设计创作，主要内容包括：本公开涉及预防和/或治疗肝病的方法,其包括将ASK1抑制剂与ACC抑制剂和FXR激动剂组合给予需要的患者。(This disclosure relates to the method prevented and/or treat hepatopathy comprising ASK1 inhibitor and ACC inhibitor and FXR agonist combinations are given to the patient of needs.)
相关申请的交叉引用
本申请要求根据35U.S.C.§119(e)于2017年4月12日提交的美国临时申请号62/484,652的优先权，在此将其整体引入作为参考。
技术领域
本公开涉及预防和/或治疗肝病的方法。
背景技术
基于疾病的持续时间，肝病通常被分类为急性或慢性。肝病可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物、酒精、食物中的杂质，以及血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色素沉着病)或未知原因而引起。
肝病是全世界死亡的主要原因。特别地，已经看到高脂肪的饮食以惊人地类似于肝炎的方式损伤肝脏。美国肝脏基金会估计，超过20％的人口患有非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。已表明肥胖、不健康的饮食和久坐的生活方式可能造成NAFLD的高发病率。当不治疗时，NAFLD可进展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，引起严重的不良反应。一旦NASH发展，它将导致肝随时间膨胀和形成瘢痕(即肝硬化)。
尽管初步报告表明积极的生活方式改变可以预防或逆转肝损伤，但仍没有有效的NAFLD的药物治疗。因此，仍然需要提供新的有效的药物来治疗肝病。
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的凋亡信号调节激酶1(ASK1)抑制剂与治疗有效量的乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂和治疗有效量的法尼醇X受体(farnesoid X receptor，FXR)激动剂的组合。所述肝病包括但不限于慢性和/或代谢肝病、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
在具体实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。
在本文提供的方法中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可共同给药。在这些实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可作为单一药物组合物一起给药，或在多于一种药物组合物中分开给药。因此，本文还提供包含治疗有效量的ASK1抑制剂、治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的药物组合物。
本文还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的ASK1抑制剂，治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂以及药学上可接受的赋形剂。
附图说明
图1.通过定量图像分析在大鼠CDHFD模型中的PSR阳性面积百分比。(***p<0.001,****p<0.0001通过单因素方差分析显著不同于媒介物；&&&&p<0.0001通过t检验显著不同于开始治疗；#p<0.05,##p<0.01,####p<0.0001通过t检验显著不同于所示的两组分组合)。图显示平均值±SD。
图2.通过定量图像分析在大鼠CDHFD模型中的α-SMA阳性面积百分比。(**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001通过单因素方差分析显著不同于媒介物；&&&&p<0.0001通过t检验显著不同于开始治疗；##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001通过t检验显著不同于所示的两组分组合)。图显示平均值±SD。
图3.通过ELISA测定大鼠CDHFD模型的血浆中的Timp1蛋白。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过单因素方差分析显著不同于媒介物；&&&&p<0.0001通过t检验显著不同于开始治疗；##p<0.01通过t检验显著不同于所示的两组分组合)。图显示平均值±SD。
发明详述
定义和通用参数
本说明书使用的以下术语和短语通常意图具有如在下文中阐述的含义，但上下文另外说明的情况除外。
如本文所使用的，在定量测量的背景下使用的术语“约”是指指示量±10％，或者指示量±5％或±1％。
术语“药学上可接受的盐”是指本文公开的化合物的盐，其保持基础化合物的生物有效性和性质，且不是生物上或其它方面不合需要的。存在酸加成盐和碱加成盐。药学上可接受的酸加成盐可从无机和有机酸制备。
用于与基础化合物反应形成药学上可接受的盐(分别为酸加成盐或碱加成盐)的酸和碱是本领域技术人员已知的。如果本文所述的化合物是作为酸加成盐获得的，则可以通过碱化酸式盐的溶液来获得游离碱。相反，如果产物是游离碱，则可以通过将游离碱溶解在合适的有机溶剂中并用酸处理该溶液，按照从碱化合物制备酸加成盐的常规方法制备加成盐，特别是药学上可接受的加成盐。本领域技术人员将认识到可用于制备无毒的药学上可接受的加成盐的各种合成方法。药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。源自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。源自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙烷磺酸、对甲苯-磺酸、水杨酸，等。同样，药学上可接受的碱加成盐可从无机和有机碱制备。源自无机碱的盐包括，仅作为实例，钠，钾，锂，铵，钙和镁盐。源自有机碱的盐包括，但不限于，伯、仲和叔胺的盐，如烷基胺(即，NH2(烷基))、二烷基胺(即，HN(烷基)2)、三烷基胺(即，N(烷基)3)、取代的烷基胺(即，NH2(取代的烷基))、二(取代的烷基)胺(即，HN(取代的烷基)2)、三(取代的烷基)胺(即，N(取代的烷基)3)、烯基胺(即，NH2(烯基))、二烯基胺(即，HN(烯基)2)、三烯基胺(即，N(烯基)3)、取代的烯基胺(即，NH2(取代的烯基))、二(取代的烯基)胺(即，HN(取代的烯基)2)、三(取代的烯基)胺(即，N(取代的烯基)3、单-、二-或三-环烷基胺(即，NH2(环烷基)、HN(环烷基)2、N(环烷基)3)、单-、二-或三-芳基胺(即，NH2(芳基)、HN(芳基)2、N(芳基)3)、或混合胺，等。合适的胺的具体实例包括，仅作为实例，异丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。类似地，从基础化合物制备药学上可接受的盐的方法(在公开时)是本领域技术人员已知的，并且公开在例如Berge等人，Journal ofPharmaceutical Science，Jan.1977vol.66，No.1等来源。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括对所公开的化合物或其用途无害的赋形剂或试剂，例如溶剂、稀释剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用这样的载体和试剂制备药物活性物质的组合物是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Co.，Philadelphia，PA17thEd(1985)；和Modern Pharmaceutics，Marcel Dekker，Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes，Eds.)。
术语“治疗有效量”和“有效量”可互换使用，并且是指当一个或多个剂量给药于需要这种治疗的患者(例如，人)时足以实现如下定义的治疗的化合物的量。治疗有效量将根据患者、所治疗的疾病、患者的体重和/或年龄、疾病的严重性或由合格的药师或护理者确定的给药方式而变化。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指给药式(I)的化合物或药学上可接受的盐用于以下目的：(i)延迟疾病的发作，即导致疾病的临床症状不出现或延迟其出现；(ii)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即引起临床症状或其严重性的消退。
肝病
肝病是在疾病持续期间对肝脏的急性或慢性损害。肝损伤可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物例如酒精或食物中的杂质、血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色素沉着病)或其他未知原因引起。示例性肝病包括但不限于肝硬化，肝纤维化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)，肝缺血再灌注损伤，原发性胆汁性肝硬化(PBC)和肝炎，包括病毒性和酒精性肝炎。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是并非由酒精引起的肝细胞中额外脂肪的积聚。NAFLD可能导致肝脏肿胀(即脂肪性肝炎)，这又可能随着时间而引起瘢痕(即肝硬化)，并可能导致肝癌或肝衰竭。NAFLD的特征在于脂肪在肝细胞中的积累，并且通常与代谢综合征(例如2型糖尿病、胰岛素抵抗、高脂血症、高血压)的一些方面相关。这种疾病的频率已经变得越来越常见，这是由于消耗富含碳水化合物和高脂肪的饮食。NAFLD患者的一个亚组(～20％)发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
NASH是脂肪肝疾病的亚型，是更严重的NAFLD形式。其特征在于大泡性脂肪变性、肝细胞的球囊变性和/或炎症，最终导致肝瘢痕形成(即纤维化)。诊断为NASH的患者进展到晚期肝纤维化并最终肝硬化。目前对具有晚期疾病的肝硬化NASH患者的治疗是肝移植。
另一种常见的肝病是原发性硬化性胆管炎(PSC)。它是慢性或长期肝病，慢慢损伤肝脏内部和外部的胆管。在患有PSC的患者中，胆汁由于胆管堵塞而积聚在肝脏中，其逐渐损伤肝细胞并引起肝硬化或肝脏瘢痕形成。目前，没有有效的治疗方法来治愈PSC。许多患有PSC的患者由于肝衰竭最终需要肝移植，通常在被诊断患有该疾病大约10年后。PSC也可能导致胆管癌。
肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。晚期肝纤维化导致肝硬化、肝衰竭和门静脉高血压，并且通常需要肝移植。
方法
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。活性肝病的存在可以通过血液中升高的酶水平的存在来检测。具体来说，已知高于临床上接受的正常范围的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血液水平指示正在进行的肝损伤。对肝病患者的ALT和AST的血液水平的常规监测在临床上用于测量在医疗治疗时肝病的进展。将升高的ALT和AST降低到接受的正常范围内作为临床证据，反映患者正在进行的肝损伤的严重性的降低。
在一些实施方案中，肝病是慢性肝病。慢性肝病涉及肝实质的进行性破坏，导致纤维化和肝硬化。一般来说，慢性肝病可由病毒(例如乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒(CMV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV))、毒性剂或药物(例如酒精、甲氨蝶呤或呋喃妥因)、代谢性疾病(例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血色素沉着病或威尔逊氏病)、自身免疫性疾病(例如自身免疫性慢性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬变)或原发性硬化性胆管炎)或其他原因(例如右心衰竭)引起。
在一个实施方案中，本文提供了用于降低肝硬化水平的方法。在一个实施方案中，肝硬化在病理上的特征为正常微小小叶结构的损失、纤维化和结节再生。测量肝硬化程度的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，肝硬化水平降低约5％至约95％。在一个实施方案中，在受试者中肝硬化水平降低至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％。在一个实施方案中，患者的纤维化得分可以从基线降低，例如从F4降低到F3，从F3降低到F2，或者从F2降低到F1。
在一些实施方案中，所述肝病为代谢性肝病。在一个实施方案中，所述肝病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征(肥胖症、混合型高脂血症、糖尿病(II型)和高血压)相关。认为NAFLD涵盖一系列疾病活性，且开始为在肝中的脂肪累积(肝性脂肪变性)。
已经显示，肥胖和胰岛素抵抗可能在NAFLD的疾病过程中发挥强烈的作用。除了饮食不良之外，NAFLD还有几种其他已知的原因。例如，NAFLD可由某些药物引起，例如胺碘酮，抗病毒药物(例如核苷类似物)，阿司匹林(很少作为儿童瑞氏综合征(Reye's syndrome)的一部分)，皮质类固醇，甲氨蝶呤，他莫昔芬或四环素。NAFLD还通过高果糖玉米糖浆的存在与软饮料的消耗相关，这可能引起脂肪在腹部增加的沉积，尽管蔗糖的消耗显示类似的效果(可能是由于其分解成果糖)。遗传学也被认为发挥了作用，因为已经确定了这种易感性的两个遗传突变。
如果不治疗，NAFLD可以发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其是NAFLD的最极端形式，其中脂肪变性与炎症和纤维化结合的状态。NASH被认为是肝硬化的主要原因。因此，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。
本文还提供在需要的患者中治疗和/或预防肝纤维化的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。在一些实施方案中，晚期肝纤维化导致肝硬化和肝衰竭。用于测量肝组织学的方法，例如纤维化程度、小叶性肝炎和门静脉周围桥接坏死的变化是本领域公知的。
在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织形成、纤维瘤或纤维变性)的水平降低超过约90％。在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织形成、纤维瘤或纤维变性)的水平降低至少约90％，至少约80％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少约40％，至少约30％，至少约20％，至少约10％，至少约5％或至少约2％。
本文所述的一些实施方案涉及治疗肝病的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本文所述的化合物I的形式(form)或本文所述的药物组合物。肝病可分为4个阶段：F0表示无纤维化；F1表示轻度纤维化；F2表示中度纤维化；F3表示严重纤维化；和F4表示肝硬化。在一个实施方案中，本文提供的化合物降低肝脏中的纤维形成水平。肝纤维形成是导致称为纤维化的肝中过量细胞外基质组分沉积的过程。它在诸如慢性病毒性乙型肝炎和丙型肝炎、酒精性肝病、药物诱导的肝病、血色素沉着病、自身免疫性肝炎、威尔逊氏病、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬化)、硬化性胆管炎、肝血吸虫病及其他病症中观察到。在一个实施方案中，纤维形成水平降低超过约90％。在一个实施方案中，纤维形成水平降低至少约90％，至少约80％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少40％，至少约30％，至少约20％，至少约10％，至少约5％或至少2％。本文所述的一些实施方案涉及治疗肝病的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本文所述的化合物I的形式或本文所述的药物组合物。肝病可分为4个阶段：F0表示无纤维化；F1表示轻度纤维化；F2表示中度纤维化；F3表示严重纤维化；和F4表示肝硬化。
在其它实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防原发性硬化性胆管炎(PSC)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。
已经观察到患有NASH的患者在表观遗传测试中平均比健康患者大约2.8岁。因此，在一个实施方案中，用于治疗NASH的化合物可用于减缓、改善或逆转由NASH引起的表观遗传年龄或衰老的影响。在另一个实施方案中，用于治疗NASH的组合疗法，例如本文公开的ASK1抑制剂化合物与ACC抑制剂化合物和FXR激动剂的组合，可用于改善或逆转由NASH引起的衰老作用。
在一个实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可以在组合制剂中或在单独的药物组合物中一起施用，其中每种抑制剂可以配制成任何合适的剂型。在某些实施方案中，本文提供的方法包括分别施用包含ASK1抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物和包含ACC抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物和包含FXR激动剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。根据本发明的组合制剂包含ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和任选的其他治疗剂。或者，可以将ASK1抑制剂、ACC抑制剂或FXR激动剂中的任何两种组合成单一制剂，其与第三种以单独的药物组合物形式给药。含有活性成分的组合制剂可以是适合于预期给药方法的任何形式。
ASK1抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(I)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(II)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(VII)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式(I)、式(II)和式(VII)的化合物可使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，如美国专利申请公开号2011/0009410和2013/0197037中所述的方法。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(V)的化合物或其药学上可接受的盐。
ACC抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ACC抑制剂为具有式(III)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ACC抑制剂为具有式(IV)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式(III)和式(IV)的化合物可使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，如国际申请公开号WO/2013/071169中所述的方法。
FXR激动剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述FXR激动剂为具有式(V)结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，FXR激动剂是具有式(VI)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
可以使用本领域技术人员已知的方法，例如在美国公开号2014/0221659中描述的那些方法来合成和表征式(V)和式(VI)的化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
给药和施用
虽然可以单独给药活性成分，但是优选将其作为如下所述的药物制剂或药物组合物提供。本公开的用于兽医和人类使用的制剂包含至少一种活性成分，以及一种或多种可接受的载体和任选的其它治疗成分。载体必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容并且对其接受者是生理上无害的。
每种活性成分可以与常规载体和赋形剂一起配制，其将根据通常的实践进行选择。片剂可以含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当打算用于通过除口服给药之外的递送时，通常将是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(1986)中所述的那些。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂、螯合剂如EDTA、碳水化合物如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。制剂的pH范围为约3至约11，但通常为约7至10。
通常，活性成分将以0.01毫克至2克的剂量给药。在一个实施方案中，剂量为约10毫克至450毫克。在另一个实施方案中，剂量为约25至约250毫克。在另一个实施方案中，剂量为约50或100毫克。在一个实施方案中，剂量为约100毫克。预期活性成分可以每天给药一次、两次或三次。此外，活性成分可以每周一次或两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次给药。在一个实施方案中，给药18毫克ASK1抑制剂并给药20毫克ACC抑制剂并给药20毫克FXR激动剂。
用于活性成分的药物组合物可以包括适合于上述给药途径的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)。这样的方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和紧密地混合，然后如果需要，使产品成型来制备。
适合于口服给药的制剂可以作为离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给药。在具体实施方案中，活性成分可以作为皮下注射给药。
片剂可以通过压缩或模制，任选地使用一种或多种辅助成分制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂或表面活性剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且任选地被配制以便提供活性成分的缓慢或控制释放。
活性成分可以通过适于该病症的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、***和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。应当理解，优选的途径可以随例如接受者的状况而变化。在具体实施方案中，活性成分是口服生物可利用的，因此可以口服给药。在一个实施方案中，患者是人。
当在本文公开的方法中组合使用时，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可以在单一药物组合物中一起给药或在多于一种药物组合物中分开(同时或依次)给药。在一些实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂一起给药。在其他实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂分开给药。在一些方面，在ASK1抑制剂和FXR激动剂之前先给药ACC抑制剂。在一些方面，在ASK1抑制剂和ACC抑制剂之前先给药FXR激动剂。当分别给药时，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可以通过相同或不同的递送途径给药于患者。
药物组合物
本发明的药物组合物包含有效量的选自式(I)化合物、式(II)化合物和式(VII)化合物的ASK1抑制剂，有效量的选自式(III)化合物和式(IV)化合物的ACC抑制剂，和有效量的选自式(V)化合物和式(VI)化合物的FXR激动剂。
当用于口服使用时，可以制备例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且这种组合物可以含有一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供可口制剂。含有与无毒的药学上可接受的赋形剂(其适于制备片剂)混合的活性成分的片剂，是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、一水合乳糖、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如纤维素、微晶纤维素、淀粉、明胶或***胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包括微囊化来包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服使用的制剂也可以是硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
本公开的水性悬浮液含有活性材料与适于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物。这样的赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和***胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如，蔗糖或糖精。
油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(例如液体石蜡)中配制。口服混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂，例如上述的那些，以及调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水制备水性悬浮液的本公开的可分散粉末和颗粒提供与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上面公开的那些举例说明。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如***树胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油，山梨醇或蔗糖配制。这样的制剂还可以含有缓和剂、防腐剂、矫味剂或着色剂。
本公开的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用上述合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉末。可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也可以用于制备注射剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和具体的给药方式(例如口服给药或皮下注射)而变化。例如，旨在用于人类口服给药的时间释放制剂可以含有约1至1000mg的活性物质，其与合适和方便量的载体材料混合，载体材料可为总组合物的约5至约95％(重量：重量)。可以制备药物组合物以提供易于测量的给药量。例如，用于静脉内输注的水溶液可以含有每毫升溶液约3至500μg的活性成分，以便能够以约30mL/hr的速率输注合适的体积。当配制用于皮下给药时，通常在约2至约4个月的时间内每月约两次给药制剂。
适于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在仅需要在即将使用前加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)状态下。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有活性成分的如上文所述的日剂量或单位每日亚剂量或其适当部分的那些。
实施例
实施例1.NASH中细胞凋亡信号调节激酶(ASK1)抑制剂(式(II))与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(式(VII))或法尼醇X受体(FXR)激动剂(式(V))组合的概念研究的验证
临床前数据表明，ASK1抑制剂与ACC抑制剂或FXR激动剂的组合比单一疗法更有效。在这项研究中，评估了这些组合在NASH患者中的安全性和有效性。
入选了经MRE诊断为肝质子密度脂肪分数(PDFF)≥10％，肝硬度≥2.88kPa的70名NASH患者或符合NASH和2-3期纤维化的肝活检。连续队列接受用式(II)18mg，式(VII)20mg或式(V)30mg(n＝10/队列)的单一治疗，或用式(II)+式(VII)(18/20mg)或式(II)+式(V)(18/30mg)(n＝20/队列)的组合治疗，口服QD治疗12周。在基线(BL)、W4和W12时测量集中读取的PDFF和MRE，以及血清纤维化标记物。给药氘化水以测量脂质(从头脂肪生成[DNL])和纤维化相关的标记物的部分合成(数据待定)。
在12周内，所有方案均安全且耐受良好。在单一治疗和组合治疗队列之间观察到相似的不良事件发生率(表1)。没有受试者提前终止治疗。与BL相比，式(VII)显著改善了PDFF(p＝0.006)和TIMP-1(p＝0.049)，并且ALT和PIII-NP均无显著降低(表1)。式(V)单一疗法降低PDFF(p＝0.010)、GGT(p＝0.039)和ALT。式(II)+式(VII)的组合可显著降低PDFF(p<0.001)、ALT(p＝0.019)和PIII-NP(p＝0.057)，而式(II)+式(V)降低了GGT(p＝0.030)。
在这项针对NASH患者的概念研究的验证中，用式(II)+式(VII)或式(II)+式(V)组合治疗12周是安全的，可改善肝脂肪变性、肝脏生物化学和纤维化标记物。需要对组织学评估进行较长时间的研究，以更好地表征NASH中组合疗法与单一疗法的疗效。
表1：在第12周成像、肝脏生物化学和血清纤维化标记物的安全性和相对(％)变化
所有数据均为自BL的中位数(IQR)相对(％)变化或％(n)。
*与BL相比，p<0.05。
在这项研究中，对于患有NASH的患者，用式(II)+式(IV)组合治疗12周是安全的，并且可以改善肝脂肪变性、肝生物化学和纤维化标记物。
实施例2.NASH小鼠模型的功效
进行以下研究以评估ACC抑制剂、ASK1抑制剂和FXR激动剂的组合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)伴纤维化的小鼠模型中的功效，相对于单独的药物在模型中的功效。通过给予缺乏胆碱、蛋氨酸含量低和饱和脂肪、胆固醇和糖含量高的胆碱缺乏的、高脂饮食(CDHFD)18周，诱导雄性WistarHan大鼠中的NASH伴纤维化。对照动物维持正常的饮食。18周后，与对照鼠相比，在CDHFD大鼠中建立了NASH表型，其特征是大泡性脂肪变性，ALT和AST升高以及与肝星状细胞活化相关的转录水平升高。参见Matsumoto M.,等人，An improvedmouse model that rapidly develops fibrosis in non-alcoholicsteatohepatitis.International Journal of Experimental Pathology2013；94：93-103。
在CDHFD治疗8周后，随后将大鼠用安慰剂(媒介物)、ASK1抑制剂(式(VII))、ACC抑制剂(式(III))、FXR激动剂(式(V))以及用式(VII)和式(III)、式(VII)和式(V)、式(III)和式(V)或者式(VII)、式(III)和式(V)的组合治疗10周。对照大鼠在整个18周的研究期内均保持正常的饮食。终点分析包括通过天狼猩红染色定量肝纤维化，通过α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色定量肝星状细胞活化，测量促纤维化血液标志物Timp1、HA和PIINP以及测量肝脏中的促纤维化转录物Timp1和Col1A1。
方法
动物
在印第安纳波利斯的CrownBio的这项研究中使用了雄性Wistar Han大鼠(研究开始时为9周龄)。用于研究动物的所有过程均符合美国农业部《动物福利法》(9CFR第1、2和3部分)(U.S.Department of Agriculture’s Animal Welfare Act(9CFR Parts 1,2,and3))；《实验动物的护理和使用指南》(实验动物研究所，国家科学院出版社，华盛顿特区)(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(Institute for LaboratoryAnimal Research,The National Academies Press,Washington,D.C.))；和美国国立卫生研究院实验动物福利办公室(National Institutes of Health,Office of LaboratoryAnimal Welfare)。
CDHFD大鼠模型的生命实验方案
实验设计示于表2中。为研究动物提供标准的食物(LabDiet 5CR4)或市售的CDHFD(Research Diets Inc,A16092003)长达18周。在CDHFD治疗8周后，对10只动物(第1组)实施安乐死，并开始为其余组给药。在研究的剩余时间(第9周至第18周)中，每天在AM(7：00+/-1小时)对动物给药一次，相同量的制剂，不含化合物(第2至4组，媒介物)或下表2中所列的适当化合物。通过将式(VII)化合物混入Research Diets,Inc的CDHFD中。将式(III)化合物和式(V)化合物分别或一起适当地在0.5％羧甲基纤维素钠(中等粘度)，1％w/w乙醇，98.5％w/w 50mM Tris缓冲液，pH 8，在反渗透水中配制。将式(VII)化合物在CDHFD中以0.03重量％配制，并按表2所示提供给第4、7、8和10组的大鼠。将式(III)化合物以2mg/mL配制，并以表2中提供的剂量向第5、7、9和10组的大鼠给药，将式(V)化合物以6mg/mL配制，并以表2中提供的剂量向第6、8、9和10组的大鼠给药(所有组：口服，每天一次给药频率)。
表2.实验设计和剂量组
*动物的数量＝10
**动物的数量＝15
在研究的最后给药后，每组一半的动物在给药后2小时安乐死，另一半在给药后24小时安乐死。收集血液，将其处理成血浆，然后运送到位于South San Francisco,CA的DCTherapeutics。在位于Davis,CA的VDx Preclinical，将肝收集、处理并包埋在石蜡中，然后运送到Foster City的吉利德科学公司(Gilead Sciences)。将样品切成5μm的切片，并将切片固定在载玻片上以进行后续染色。
天狼猩红染色：将切片在0.2％磷钼酸(EMS,目录号26357-01)中预处理，然后在室温下在饱和苦味酸溶液(EMS,Cat#26357-02)中的0.1％(W/V)天狼猩红88-89-1中孵育1小时。然后将其在0.01N HCl(EMS,Cat#26357)中进行分化，然后在梯度醇中进行脱水。
使用Leica AT2扫描仪以40倍的放大倍数捕获天狼猩红(PSR)染色的玻片的全玻片扫描图像。检查数字玻片图像的扫描质量，添加注释并导出到Leica Digital Image Hubarchive中的相应网络文件夹中。使用Visiopharm图像分析软件(Visiopharm,Hoersholm,Denmark)对全玻片扫描图像进行定量图像分析，以确定PSR的程度和强度。测量总的PSR染色面积，并表示为染色的总肝脏面积的百分比。结果示于图1中。
α-SMA：将切片在3份二甲苯中脱蜡，每次5分钟，然后在3份100％EtOH、1份95％EtOH、1份80％EtOH中再水化，每次3分钟；然后在蒸馏水中连续冲洗2次。然后将切片在过氧化物(Peroxidazed)1(Biocare Medical,目录号PX968)内源性过氧化物酶阻滞剂中孵育5分钟，并在蒸馏水中冲洗。然后，使用Reveal Decloaker(Biocare Medical,目录号RV1000M)在95℃下用Decloaking Chamber NxGen(Biocare Medical,目录号DC2012)进行热诱导的抗原修复40分钟，然后逐步冷却，用蒸馏水代替修复液，并置于tris缓冲盐水(TBS)中。使用Intellipath全自动染色仪(Biocare Medical,目录号IPS0001)通过以下步骤在制备的载玻片上进行免疫组织化学分析：
1.将300μL背景Punisher(Biocare Medical,目录号IP974G20)施加在玻片上，孵育10分钟；然后用TBS洗涤。
2.施加在Da Vinci Green稀释剂(Biocare Medical,目录号PD900L)中以1：50稀释的300μL小鼠单克隆SMA的一抗，克隆号1A4，(Biocare Medical,目录号CM001)。在室温下孵育30分钟；然后用TBS洗涤。
3.使小鼠接触300μL的鼠HRP聚合物(Rat HRP Polymer)(Biocare Medical,目录号MRT621H)，并孵育30分钟；然后用TBS洗涤。
4.制备DSB：1滴DSB色原/1ml底物缓冲液(Biocare Medical,分别为目录号BRI4014C/BRI 4013)。施加300μL深空黑(DSB)色原5分钟；然后用蒸馏水洗涤。
5.用核固红(Biocare Medical,目录号STNFRLT)复染1分钟；随后用蒸馏水洗涤。
从仪器中取出载玻片，并通过一系列梯度的组织学等级的醇脱水为二甲苯并盖上盖玻片。
使用Leica AT2扫描仪以40倍的放大倍数捕获α-SMA染色的玻片的全玻片扫描图像。检查数字玻片图像的扫描质量，添加注释并导出到Leica Digital Image Hub archive中的相应网络文件夹中。使用Visiopharm图像分析软件(Visiopharm,Hoersholm,Denmark)对全玻片扫描图像进行定量图像分析，以确定α-SMA的程度和强度。测量总的α-SMA染色面积，并表示为染色的总肝脏面积的百分比。结果示于图2中。
血浆TIMP-1 ELISA：使用市售的大鼠TIMP-1特异性ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,Cat#RTM100)一式两份测定血浆TIMP-1的浓度。根据制造商的说明进行少量的修改在血浆中对TIMP-1进行分析。将缓冲液RD1-21(50μL)添加到预先用小鼠抗TIMP-1涂覆的ELISA板孔中。在ELISA之前，生成了大鼠TIMP-1(表达NS0的重组TIMP-1：2400-37.5pg/mL)的七点标准曲线，并将血浆样品在缓冲液RD5-17中稀释为1：20。将样品和标准品(各50μL)一式两份添加到含有RD1-21的孔中，并在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)2小时。抗原捕获后，使用自动洗板机，用洗涤缓冲液将板洗涤5次(350μL/孔/洗涤)。洗涤后，将大鼠TIMP-1复合物(100μL)添加至每个孔中，并将板在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)2小时。然后将板洗涤5次，并将底物溶液(100μL)添加至每个孔。将板避光在室温下孵育30分钟。最后，将终止液(100μL)添加到每个孔中。立即在SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale CA)上于450nm处测定光密度(O.D.)吸光度。将每种标准品和样品的相对O.D.相对于空白样品进行背景校正，并使用4参数曲线拟合方法生成将O.D.转换为TIMP-1浓度的标准曲线。使用SoftMax Pro5软件使用20的稀释因子确定未知样品TIMP-1的浓度。结果示于图3中。
结果
实施例2表明，在NASH的大鼠模型中，用ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂的组合治疗比双重组合或单一组合治疗具有更高的疗效。特别地，图1-3显示相对于媒介物或双重组合组，式(VII)化合物、式(III)化合物和式(V)化合物的三重组合明显减少了纤维化标志物，包括天狼猩红阳性面积百分比、α-SMA阳性面积百分比和与纤维化相关的血浆标志物TIMP1。
具体实施方式
图1.通过定量图像分析在大鼠CDHFD模型中的PSR阳性面积百分比。(***p<0.001,****p<0.0001通过单因素方差分析显著不同于媒介物；&&&&p<0.0001通过t检验显著不同于开始治疗；#p<0.05,##p<0.01,####p<0.0001通过t检验显著不同于所示的两组分组合)。图显示平均值±SD。
图2.通过定量图像分析在大鼠CDHFD模型中的α-SMA阳性面积百分比。(**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001通过单因素方差分析显著不同于媒介物；&&&&p<0.0001通过t检验显著不同于开始治疗；##p<0.01,###p<0.001,####p<0.0001通过t检验显著不同于所示的两组分组合)。图显示平均值±SD。
图3.通过ELISA测定大鼠CDHFD模型的血浆中的Timp1蛋白。(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001通过单因素方差分析显著不同于媒介物；&&&&p<0.0001通过t检验显著不同于开始治疗；##p<0.01通过t检验显著不同于所示的两组分组合)。图显示平均值±SD。
发明详述
定义和通用参数
本说明书使用的以下术语和短语通常意图具有如在下文中阐述的含义，但上下文另外说明的情况除外。
如本文所使用的，在定量测量的背景下使用的术语“约”是指指示量±10％，或者指示量±5％或±1％。
术语“药学上可接受的盐”是指本文公开的化合物的盐，其保持基础化合物的生物有效性和性质，且不是生物上或其它方面不合需要的。存在酸加成盐和碱加成盐。药学上可接受的酸加成盐可从无机和有机酸制备。
用于与基础化合物反应形成药学上可接受的盐(分别为酸加成盐或碱加成盐)的酸和碱是本领域技术人员已知的。如果本文所述的化合物是作为酸加成盐获得的，则可以通过碱化酸式盐的溶液来获得游离碱。相反，如果产物是游离碱，则可以通过将游离碱溶解在合适的有机溶剂中并用酸处理该溶液，按照从碱化合物制备酸加成盐的常规方法制备加成盐，特别是药学上可接受的加成盐。本领域技术人员将认识到可用于制备无毒的药学上可接受的加成盐的各种合成方法。药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸和有机酸制备。源自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。源自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙烷磺酸、对甲苯-磺酸、水杨酸，等。同样，药学上可接受的碱加成盐可从无机和有机碱制备。源自无机碱的盐包括，仅作为实例，钠，钾，锂，铵，钙和镁盐。源自有机碱的盐包括，但不限于，伯、仲和叔胺的盐，如烷基胺(即，NH2(烷基))、二烷基胺(即，HN(烷基)2)、三烷基胺(即，N(烷基)3)、取代的烷基胺(即，NH2(取代的烷基))、二(取代的烷基)胺(即，HN(取代的烷基)2)、三(取代的烷基)胺(即，N(取代的烷基)3)、烯基胺(即，NH2(烯基))、二烯基胺(即，HN(烯基)2)、三烯基胺(即，N(烯基)3)、取代的烯基胺(即，NH2(取代的烯基))、二(取代的烯基)胺(即，HN(取代的烯基)2)、三(取代的烯基)胺(即，N(取代的烯基)3、单-、二-或三-环烷基胺(即，NH2(环烷基)、HN(环烷基)2、N(环烷基)3)、单-、二-或三-芳基胺(即，NH2(芳基)、HN(芳基)2、N(芳基)3)、或混合胺，等。合适的胺的具体实例包括，仅作为实例，异丙基胺、三甲基胺、二乙基胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶等。类似地，从基础化合物制备药学上可接受的盐的方法(在公开时)是本领域技术人员已知的，并且公开在例如Berge等人，Journal ofPharmaceutical Science，Jan.1977vol.66，No.1等来源。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括对所公开的化合物或其用途无害的赋形剂或试剂，例如溶剂、稀释剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。使用这样的载体和试剂制备药物活性物质的组合物是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，Mace Publishing Co.，Philadelphia，PA17thEd(1985)；和Modern Pharmaceutics，Marcel Dekker，Inc.3rd Ed.(G.S.Banker&C.T.Rhodes，Eds.)。
术语“治疗有效量”和“有效量”可互换使用，并且是指当一个或多个剂量给药于需要这种治疗的患者(例如，人)时足以实现如下定义的治疗的化合物的量。治疗有效量将根据患者、所治疗的疾病、患者的体重和/或年龄、疾病的严重性或由合格的药师或护理者确定的给药方式而变化。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指给药式(I)的化合物或药学上可接受的盐用于以下目的：(i)延迟疾病的发作，即导致疾病的临床症状不出现或延迟其出现；(ii)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)缓解疾病，即引起临床症状或其严重性的消退。
肝病
肝病是在疾病持续期间对肝脏的急性或慢性损害。肝损伤可以由感染、损伤、暴露于药物或有毒化合物例如酒精或食物中的杂质、血液中正常物质的异常积累、自身免疫过程、遗传缺陷(例如血色素沉着病)或其他未知原因引起。示例性肝病包括但不限于肝硬化，肝纤维化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，酒精性脂肪性肝炎(ASH)，肝缺血再灌注损伤，原发性胆汁性肝硬化(PBC)和肝炎，包括病毒性和酒精性肝炎。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是并非由酒精引起的肝细胞中额外脂肪的积聚。NAFLD可能导致肝脏肿胀(即脂肪性肝炎)，这又可能随着时间而引起瘢痕(即肝硬化)，并可能导致肝癌或肝衰竭。NAFLD的特征在于脂肪在肝细胞中的积累，并且通常与代谢综合征(例如2型糖尿病、胰岛素抵抗、高脂血症、高血压)的一些方面相关。这种疾病的频率已经变得越来越常见，这是由于消耗富含碳水化合物和高脂肪的饮食。NAFLD患者的一个亚组(～20％)发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
NASH是脂肪肝疾病的亚型，是更严重的NAFLD形式。其特征在于大泡性脂肪变性、肝细胞的球囊变性和/或炎症，最终导致肝瘢痕形成(即纤维化)。诊断为NASH的患者进展到晚期肝纤维化并最终肝硬化。目前对具有晚期疾病的肝硬化NASH患者的治疗是肝移植。
另一种常见的肝病是原发性硬化性胆管炎(PSC)。它是慢性或长期肝病，慢慢损伤肝脏内部和外部的胆管。在患有PSC的患者中，胆汁由于胆管堵塞而积聚在肝脏中，其逐渐损伤肝细胞并引起肝硬化或肝脏瘢痕形成。目前，没有有效的治疗方法来治愈PSC。许多患有PSC的患者由于肝衰竭最终需要肝移植，通常在被诊断患有该疾病大约10年后。PSC也可能导致胆管癌。
肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。晚期肝纤维化导致肝硬化、肝衰竭和门静脉高血压，并且通常需要肝移植。
方法
本文公开了在需要的患者中治疗和/或预防肝病的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。活性肝病的存在可以通过血液中升高的酶水平的存在来检测。具体来说，已知高于临床上接受的正常范围的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的血液水平指示正在进行的肝损伤。对肝病患者的ALT和AST的血液水平的常规监测在临床上用于测量在医疗治疗时肝病的进展。将升高的ALT和AST降低到接受的正常范围内作为临床证据，反映患者正在进行的肝损伤的严重性的降低。
在一些实施方案中，肝病是慢性肝病。慢性肝病涉及肝实质的进行性破坏，导致纤维化和肝硬化。一般来说，慢性肝病可由病毒(例如乙型肝炎、丙型肝炎、巨细胞病毒(CMV)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr Virus，EBV))、毒性剂或药物(例如酒精、甲氨蝶呤或呋喃妥因)、代谢性疾病(例如非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血色素沉着病或威尔逊氏病)、自身免疫性疾病(例如自身免疫性慢性肝炎、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬变)或原发性硬化性胆管炎)或其他原因(例如右心衰竭)引起。
在一个实施方案中，本文提供了用于降低肝硬化水平的方法。在一个实施方案中，肝硬化在病理上的特征为正常微小小叶结构的损失、纤维化和结节再生。测量肝硬化程度的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，肝硬化水平降低约5％至约95％。在一个实施方案中，在受试者中肝硬化水平降低至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％。在一个实施方案中，患者的纤维化得分可以从基线降低，例如从F4降低到F3，从F3降低到F2，或者从F2降低到F1。
在一些实施方案中，所述肝病为代谢性肝病。在一个实施方案中，所述肝病为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。NAFLD与胰岛素抵抗和代谢综合征(肥胖症、混合型高脂血症、糖尿病(II型)和高血压)相关。认为NAFLD涵盖一系列疾病活性，且开始为在肝中的脂肪累积(肝性脂肪变性)。
已经显示，肥胖和胰岛素抵抗可能在NAFLD的疾病过程中发挥强烈的作用。除了饮食不良之外，NAFLD还有几种其他已知的原因。例如，NAFLD可由某些药物引起，例如胺碘酮，抗病毒药物(例如核苷类似物)，阿司匹林(很少作为儿童瑞氏综合征(Reye's syndrome)的一部分)，皮质类固醇，甲氨蝶呤，他莫昔芬或四环素。NAFLD还通过高果糖玉米糖浆的存在与软饮料的消耗相关，这可能引起脂肪在腹部增加的沉积，尽管蔗糖的消耗显示类似的效果(可能是由于其分解成果糖)。遗传学也被认为发挥了作用，因为已经确定了这种易感性的两个遗传突变。
如果不治疗，NAFLD可以发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，其是NAFLD的最极端形式，其中脂肪变性与炎症和纤维化结合的状态。NASH被认为是肝硬化的主要原因。因此，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。
本文还提供在需要的患者中治疗和/或预防肝纤维化的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。肝纤维化是在大多数类型的慢性肝病中发生的细胞外基质蛋白(包括胶原)的过度积累。在一些实施方案中，晚期肝纤维化导致肝硬化和肝衰竭。用于测量肝组织学的方法，例如纤维化程度、小叶性肝炎和门静脉周围桥接坏死的变化是本领域公知的。
在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织形成、纤维瘤或纤维变性)的水平降低超过约90％。在一个实施方案中，肝纤维化(其为纤维组织形成、纤维瘤或纤维变性)的水平降低至少约90％，至少约80％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少约40％，至少约30％，至少约20％，至少约10％，至少约5％或至少约2％。
本文所述的一些实施方案涉及治疗肝病的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本文所述的化合物I的形式(form)或本文所述的药物组合物。肝病可分为4个阶段：F0表示无纤维化；F1表示轻度纤维化；F2表示中度纤维化；F3表示严重纤维化；和F4表示肝硬化。在一个实施方案中，本文提供的化合物降低肝脏中的纤维形成水平。肝纤维形成是导致称为纤维化的肝中过量细胞外基质组分沉积的过程。它在诸如慢性病毒性乙型肝炎和丙型肝炎、酒精性肝病、药物诱导的肝病、血色素沉着病、自身免疫性肝炎、威尔逊氏病、原发性胆汁性胆管炎(以前称为原发性胆汁性肝硬化)、硬化性胆管炎、肝血吸虫病及其他病症中观察到。在一个实施方案中，纤维形成水平降低超过约90％。在一个实施方案中，纤维形成水平降低至少约90％，至少约80％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少40％，至少约30％，至少约20％，至少约10％，至少约5％或至少2％。本文所述的一些实施方案涉及治疗肝病的方法，所述方法包括给药治疗有效量的本文所述的化合物I的形式或本文所述的药物组合物。肝病可分为4个阶段：F0表示无纤维化；F1表示轻度纤维化；F2表示中度纤维化；F3表示严重纤维化；和F4表示肝硬化。
在其它实施方案中，本文提供在需要的患者中治疗和/或预防原发性硬化性胆管炎(PSC)的方法，包括向患者给药治疗有效量的ASK1抑制剂与治疗有效量的ACC抑制剂和治疗有效量的FXR激动剂的组合。
已经观察到患有NASH的患者在表观遗传测试中平均比健康患者大约2.8岁。因此，在一个实施方案中，用于治疗NASH的化合物可用于减缓、改善或逆转由NASH引起的表观遗传年龄或衰老的影响。在另一个实施方案中，用于治疗NASH的组合疗法，例如本文公开的ASK1抑制剂化合物与ACC抑制剂化合物和FXR激动剂的组合，可用于改善或逆转由NASH引起的衰老作用。
在一个实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可以在组合制剂中或在单独的药物组合物中一起施用，其中每种抑制剂可以配制成任何合适的剂型。在某些实施方案中，本文提供的方法包括分别施用包含ASK1抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物和包含ACC抑制剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物和包含FXR激动剂和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。根据本发明的组合制剂包含ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂和任选的其他治疗剂。或者，可以将ASK1抑制剂、ACC抑制剂或FXR激动剂中的任何两种组合成单一制剂，其与第三种以单独的药物组合物形式给药。含有活性成分的组合制剂可以是适合于预期给药方法的任何形式。
ASK1抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(I)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(II)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂为具有式(VII)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式(I)、式(II)和式(VII)的化合物可使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，如美国专利申请公开号2011/0009410和2013/0197037中所述的方法。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(II)的化合物或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，所述ASK1抑制剂为式(V)的化合物或其药学上可接受的盐。
ACC抑制剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ACC抑制剂为具有式(III)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ACC抑制剂为具有式(IV)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
式(III)和式(IV)的化合物可使用本领域技术人员已知的方法合成和表征，如国际申请公开号WO/2013/071169中所述的方法。
FXR激动剂
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述FXR激动剂为具有式(V)结构的化合物:
或其药学上可接受的盐。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，FXR激动剂是具有式(VI)结构的化合物：
或其药学上可接受的盐。
可以使用本领域技术人员已知的方法，例如在美国公开号2014/0221659中描述的那些方法来合成和表征式(V)和式(VI)的化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(I)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(II)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(V)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(III)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
在本文公开的方法和药物组合物的某些实施方案中，所述ASK1抑制剂是式(VII)化合物，所述ACC抑制剂是式(IV)化合物，并且所述FXR激动剂是式(VI)化合物。
给药和施用
虽然可以单独给药活性成分，但是优选将其作为如下所述的药物制剂或药物组合物提供。本公开的用于兽医和人类使用的制剂包含至少一种活性成分，以及一种或多种可接受的载体和任选的其它治疗成分。载体必须是“可接受的”，意思是与制剂的其它成分相容并且对其接受者是生理上无害的。
每种活性成分可以与常规载体和赋形剂一起配制，其将根据通常的实践进行选择。片剂可以含有赋形剂、助流剂、填充剂、粘合剂等。水性制剂以无菌形式制备，并且当打算用于通过除口服给药之外的递送时，通常将是等渗的。所有制剂将任选地含有赋形剂，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(1986)中所述的那些。赋形剂包括抗坏血酸和其它抗氧化剂、螯合剂如EDTA、碳水化合物如糊精、羟烷基纤维素、羟烷基甲基纤维素、硬脂酸等。制剂的pH范围为约3至约11，但通常为约7至10。
通常，活性成分将以0.01毫克至2克的剂量给药。在一个实施方案中，剂量为约10毫克至450毫克。在另一个实施方案中，剂量为约25至约250毫克。在另一个实施方案中，剂量为约50或100毫克。在一个实施方案中，剂量为约100毫克。预期活性成分可以每天给药一次、两次或三次。此外，活性成分可以每周一次或两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次或每六周一次给药。在一个实施方案中，给药18毫克ASK1抑制剂并给药20毫克ACC抑制剂并给药20毫克FXR激动剂。
用于活性成分的药物组合物可以包括适合于上述给药途径的那些。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。技术和制剂通常参见Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.，Easton，PA)。这样的方法包括使活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体缔合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀和紧密地混合，然后如果需要，使产品成型来制备。
适合于口服给药的制剂可以作为离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂或片剂，每个含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。活性成分还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂给药。在具体实施方案中，活性成分可以作为皮下注射给药。
片剂可以通过压缩或模制，任选地使用一种或多种辅助成分制备。压制片剂可以通过在合适的机器中压缩自由流动形式的活性成分如粉末或颗粒，任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂或表面活性剂混合来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且任选地被配制以便提供活性成分的缓慢或控制释放。
活性成分可以通过适于该病症的任何途径给药。合适的途径包括口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、***和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)等。应当理解，优选的途径可以随例如接受者的状况而变化。在具体实施方案中，活性成分是口服生物可利用的，因此可以口服给药。在一个实施方案中，患者是人。
当在本文公开的方法中组合使用时，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可以在单一药物组合物中一起给药或在多于一种药物组合物中分开(同时或依次)给药。在一些实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂一起给药。在其他实施方案中，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂分开给药。在一些方面，在ASK1抑制剂和FXR激动剂之前先给药ACC抑制剂。在一些方面，在ASK1抑制剂和ACC抑制剂之前先给药FXR激动剂。当分别给药时，ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂可以通过相同或不同的递送途径给药于患者。
药物组合物
本发明的药物组合物包含有效量的选自式(I)化合物、式(II)化合物和式(VII)化合物的ASK1抑制剂，有效量的选自式(III)化合物和式(IV)化合物的ACC抑制剂，和有效量的选自式(V)化合物和式(VI)化合物的FXR激动剂。
当用于口服使用时，可以制备例如片剂、糖锭、锭剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法制备，并且这种组合物可以含有一种或多种试剂，包括甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供可口制剂。含有与无毒的药学上可接受的赋形剂(其适于制备片剂)混合的活性成分的片剂，是可接受的。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，例如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、一水合乳糖、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，例如纤维素、微晶纤维素、淀粉、明胶或***胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包衣的，或者可以通过已知技术包括微囊化来包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。例如，可以使用延时材料，例如单独的或与蜡一起的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
口服使用的制剂也可以是硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
本公开的水性悬浮液含有活性材料与适于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物。这样的赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和***胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如，卵磷脂)，环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇)，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)。水性悬浮液还可以含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如，蔗糖或糖精。
油悬浮液可以通过将活性成分悬浮在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(例如液体石蜡)中配制。口服混悬液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂，例如上述的那些，以及调味剂，以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂例如抗坏血酸来保存。
适于通过加入水制备水性悬浮液的本公开的可分散粉末和颗粒提供与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂由上面公开的那些举例说明。还可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。
本公开的药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，矿物油，例如液体石蜡，或这些的混合物。合适的乳化剂包括天然存在的树胶，例如***树胶和黄蓍胶，天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可以含有甜味剂和调味剂。糖浆和酏剂可以用甜味剂，例如甘油，山梨醇或蔗糖配制。这样的制剂还可以含有缓和剂、防腐剂、矫味剂或着色剂。
本公开的药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，例如无菌可注射的水性或油性悬浮液。该悬浮液可以根据已知技术使用上述合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液或制备为冻干粉末。可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌不挥发性油通常可用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸也可以用于制备注射剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和具体的给药方式(例如口服给药或皮下注射)而变化。例如，旨在用于人类口服给药的时间释放制剂可以含有约1至1000mg的活性物质，其与合适和方便量的载体材料混合，载体材料可为总组合物的约5至约95％(重量：重量)。可以制备药物组合物以提供易于测量的给药量。例如，用于静脉内输注的水溶液可以含有每毫升溶液约3至500μg的活性成分，以便能够以约30mL/hr的速率输注合适的体积。当配制用于皮下给药时，通常在约2至约4个月的时间内每月约两次给药制剂。
适于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以储存在仅需要在即将使用前加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)状态下。临时注射溶液和悬浮液由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。优选的单位剂量制剂是含有活性成分的如上文所述的日剂量或单位每日亚剂量或其适当部分的那些。
实施例
实施例1.NASH中细胞凋亡信号调节激酶(ASK1)抑制剂(式(II))与乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(式(VII))或法尼醇X受体(FXR)激动剂(式(V))组合的概念研究的验证
临床前数据表明，ASK1抑制剂与ACC抑制剂或FXR激动剂的组合比单一疗法更有效。在这项研究中，评估了这些组合在NASH患者中的安全性和有效性。
入选了经MRE诊断为肝质子密度脂肪分数(PDFF)≥10％，肝硬度≥2.88kPa的70名NASH患者或符合NASH和2-3期纤维化的肝活检。连续队列接受用式(II)18mg，式(VII)20mg或式(V)30mg(n＝10/队列)的单一治疗，或用式(II)+式(VII)(18/20mg)或式(II)+式(V)(18/30mg)(n＝20/队列)的组合治疗，口服QD治疗12周。在基线(BL)、W4和W12时测量集中读取的PDFF和MRE，以及血清纤维化标记物。给药氘化水以测量脂质(从头脂肪生成[DNL])和纤维化相关的标记物的部分合成(数据待定)。
在12周内，所有方案均安全且耐受良好。在单一治疗和组合治疗队列之间观察到相似的不良事件发生率(表1)。没有受试者提前终止治疗。与BL相比，式(VII)显著改善了PDFF(p＝0.006)和TIMP-1(p＝0.049)，并且ALT和PIII-NP均无显著降低(表1)。式(V)单一疗法降低PDFF(p＝0.010)、GGT(p＝0.039)和ALT。式(II)+式(VII)的组合可显著降低PDFF(p<0.001)、ALT(p＝0.019)和PIII-NP(p＝0.057)，而式(II)+式(V)降低了GGT(p＝0.030)。
在这项针对NASH患者的概念研究的验证中，用式(II)+式(VII)或式(II)+式(V)组合治疗12周是安全的，可改善肝脂肪变性、肝脏生物化学和纤维化标记物。需要对组织学评估进行较长时间的研究，以更好地表征NASH中组合疗法与单一疗法的疗效。
表1：在第12周成像、肝脏生物化学和血清纤维化标记物的安全性和相对(％)变化
所有数据均为自BL的中位数(IQR)相对(％)变化或％(n)。
*与BL相比，p<0.05。
在这项研究中，对于患有NASH的患者，用式(II)+式(IV)组合治疗12周是安全的，并且可以改善肝脂肪变性、肝生物化学和纤维化标记物。
实施例2.NASH小鼠模型的功效
进行以下研究以评估ACC抑制剂、ASK1抑制剂和FXR激动剂的组合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)伴纤维化的小鼠模型中的功效，相对于单独的药物在模型中的功效。通过给予缺乏胆碱、蛋氨酸含量低和饱和脂肪、胆固醇和糖含量高的胆碱缺乏的、高脂饮食(CDHFD)18周，诱导雄性WistarHan大鼠中的NASH伴纤维化。对照动物维持正常的饮食。18周后，与对照鼠相比，在CDHFD大鼠中建立了NASH表型，其特征是大泡性脂肪变性，ALT和AST升高以及与肝星状细胞活化相关的转录水平升高。参见Matsumoto M.,等人，An improvedmouse model that rapidly develops fibrosis in non-alcoholicsteatohepatitis.International Journal of Experimental Pathology2013；94：93-103。
在CDHFD治疗8周后，随后将大鼠用安慰剂(媒介物)、ASK1抑制剂(式(VII))、ACC抑制剂(式(III))、FXR激动剂(式(V))以及用式(VII)和式(III)、式(VII)和式(V)、式(III)和式(V)或者式(VII)、式(III)和式(V)的组合治疗10周。对照大鼠在整个18周的研究期内均保持正常的饮食。终点分析包括通过天狼猩红染色定量肝纤维化，通过α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)染色定量肝星状细胞活化，测量促纤维化血液标志物Timp1、HA和PIINP以及测量肝脏中的促纤维化转录物Timp1和Col1A1。
方法
动物
在印第安纳波利斯的CrownBio的这项研究中使用了雄性Wistar Han大鼠(研究开始时为9周龄)。用于研究动物的所有过程均符合美国农业部《动物福利法》(9CFR第1、2和3部分)(U.S.Department of Agriculture’s Animal Welfare Act(9CFR Parts 1,2,and3))；《实验动物的护理和使用指南》(实验动物研究所，国家科学院出版社，华盛顿特区)(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(Institute for LaboratoryAnimal Research,The National Academies Press,Washington,D.C.))；和美国国立卫生研究院实验动物福利办公室(National Institutes of Health,Office of LaboratoryAnimal Welfare)。
CDHFD大鼠模型的生命实验方案
实验设计示于表2中。为研究动物提供标准的食物(LabDiet 5CR4)或市售的CDHFD(Research Diets Inc,A16092003)长达18周。在CDHFD治疗8周后，对10只动物(第1组)实施安乐死，并开始为其余组给药。在研究的剩余时间(第9周至第18周)中，每天在AM(7：00+/-1小时)对动物给药一次，相同量的制剂，不含化合物(第2至4组，媒介物)或下表2中所列的适当化合物。通过将式(VII)化合物混入Research Diets,Inc的CDHFD中。将式(III)化合物和式(V)化合物分别或一起适当地在0.5％羧甲基纤维素钠(中等粘度)，1％w/w乙醇，98.5％w/w 50mM Tris缓冲液，pH 8，在反渗透水中配制。将式(VII)化合物在CDHFD中以0.03重量％配制，并按表2所示提供给第4、7、8和10组的大鼠。将式(III)化合物以2mg/mL配制，并以表2中提供的剂量向第5、7、9和10组的大鼠给药，将式(V)化合物以6mg/mL配制，并以表2中提供的剂量向第6、8、9和10组的大鼠给药(所有组：口服，每天一次给药频率)。
表2.实验设计和剂量组
*动物的数量＝10
**动物的数量＝15
在研究的最后给药后，每组一半的动物在给药后2小时安乐死，另一半在给药后24小时安乐死。收集血液，将其处理成血浆，然后运送到位于South San Francisco,CA的DCTherapeutics。在位于Davis,CA的VDx Preclinical，将肝收集、处理并包埋在石蜡中，然后运送到Foster City的吉利德科学公司(Gilead Sciences)。将样品切成5μm的切片，并将切片固定在载玻片上以进行后续染色。
天狼猩红染色：将切片在0.2％磷钼酸(EMS,目录号26357-01)中预处理，然后在室温下在饱和苦味酸溶液(EMS,Cat#26357-02)中的0.1％(W/V)天狼猩红88-89-1中孵育1小时。然后将其在0.01N HCl(EMS,Cat#26357)中进行分化，然后在梯度醇中进行脱水。
使用Leica AT2扫描仪以40倍的放大倍数捕获天狼猩红(PSR)染色的玻片的全玻片扫描图像。检查数字玻片图像的扫描质量，添加注释并导出到Leica Digital Image Hubarchive中的相应网络文件夹中。使用Visiopharm图像分析软件(Visiopharm,Hoersholm,Denmark)对全玻片扫描图像进行定量图像分析，以确定PSR的程度和强度。测量总的PSR染色面积，并表示为染色的总肝脏面积的百分比。结果示于图1中。
α-SMA：将切片在3份二甲苯中脱蜡，每次5分钟，然后在3份100％EtOH、1份95％EtOH、1份80％EtOH中再水化，每次3分钟；然后在蒸馏水中连续冲洗2次。然后将切片在过氧化物(Peroxidazed)1(Biocare Medical,目录号PX968)内源性过氧化物酶阻滞剂中孵育5分钟，并在蒸馏水中冲洗。然后，使用Reveal Decloaker(Biocare Medical,目录号RV1000M)在95℃下用Decloaking Chamber NxGen(Biocare Medical,目录号DC2012)进行热诱导的抗原修复40分钟，然后逐步冷却，用蒸馏水代替修复液，并置于tris缓冲盐水(TBS)中。使用Intellipath全自动染色仪(Biocare Medical,目录号IPS0001)通过以下步骤在制备的载玻片上进行免疫组织化学分析：
1.将300μL背景Punisher(Biocare Medical,目录号IP974G20)施加在玻片上，孵育10分钟；然后用TBS洗涤。
2.施加在Da Vinci Green稀释剂(Biocare Medical,目录号PD900L)中以1：50稀释的300μL小鼠单克隆SMA的一抗，克隆号1A4，(Biocare Medical,目录号CM001)。在室温下孵育30分钟；然后用TBS洗涤。
3.使小鼠接触300μL的鼠HRP聚合物(Rat HRP Polymer)(Biocare Medical,目录号MRT621H)，并孵育30分钟；然后用TBS洗涤。
4.制备DSB：1滴DSB色原/1ml底物缓冲液(Biocare Medical,分别为目录号BRI4014C/BRI 4013)。施加300μL深空黑(DSB)色原5分钟；然后用蒸馏水洗涤。
5.用核固红(Biocare Medical,目录号STNFRLT)复染1分钟；随后用蒸馏水洗涤。
从仪器中取出载玻片，并通过一系列梯度的组织学等级的醇脱水为二甲苯并盖上盖玻片。
使用Leica AT2扫描仪以40倍的放大倍数捕获α-SMA染色的玻片的全玻片扫描图像。检查数字玻片图像的扫描质量，添加注释并导出到Leica Digital Image Hub archive中的相应网络文件夹中。使用Visiopharm图像分析软件(Visiopharm,Hoersholm,Denmark)对全玻片扫描图像进行定量图像分析，以确定α-SMA的程度和强度。测量总的α-SMA染色面积，并表示为染色的总肝脏面积的百分比。结果示于图2中。
血浆TIMP-1 ELISA：使用市售的大鼠TIMP-1特异性ELISA试剂盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,Cat#RTM100)一式两份测定血浆TIMP-1的浓度。根据制造商的说明进行少量的修改在血浆中对TIMP-1进行分析。将缓冲液RD1-21(50μL)添加到预先用小鼠抗TIMP-1涂覆的ELISA板孔中。在ELISA之前，生成了大鼠TIMP-1(表达NS0的重组TIMP-1：2400-37.5pg/mL)的七点标准曲线，并将血浆样品在缓冲液RD5-17中稀释为1：20。将样品和标准品(各50μL)一式两份添加到含有RD1-21的孔中，并在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)2小时。抗原捕获后，使用自动洗板机，用洗涤缓冲液将板洗涤5次(350μL/孔/洗涤)。洗涤后，将大鼠TIMP-1复合物(100μL)添加至每个孔中，并将板在轨道板振荡器(300rpm)上孵育(室温)2小时。然后将板洗涤5次，并将底物溶液(100μL)添加至每个孔。将板避光在室温下孵育30分钟。最后，将终止液(100μL)添加到每个孔中。立即在SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices,Sunnyvale CA)上于450nm处测定光密度(O.D.)吸光度。将每种标准品和样品的相对O.D.相对于空白样品进行背景校正，并使用4参数曲线拟合方法生成将O.D.转换为TIMP-1浓度的标准曲线。使用SoftMax Pro5软件使用20的稀释因子确定未知样品TIMP-1的浓度。结果示于图3中。
结果
实施例2表明，在NASH的大鼠模型中，用ASK1抑制剂、ACC抑制剂和FXR激动剂的组合治疗比双重组合或单一组合治疗具有更高的疗效。特别地，图1-3显示相对于媒介物或双重组合组，式(VII)化合物、式(III)化合物和式(V)化合物的三重组合明显减少了纤维化标志物，包括天狼猩红阳性面积百分比、α-SMA阳性面积百分比和与纤维化相关的血浆标志物TIMP1。
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