一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组及其制备方法与应用 (Ququ fructus aurantii effective component group for treating viral pneumonia and preparation method and application thereof ) 是由 由振强 张升 曲雪峰 吴月国 李元圆 王茵 孙维 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组,包括：淫羊藿次苷E4、柚皮素4’-O-新陈皮糖苷、19-羟基柠檬尼酸、芦丁、忍冬苷、5,7,5’-三甲氧基-3’,4’-亚甲二氧基黄酮-3-芸香糖苷、异橙皮内酯、11β-去乙酰羟基诺米林、佛手苷内酯、橙皮内酯和闹米林酸；制备方法：(1)将衢枳壳粉碎,乙醇浸泡提取；(2)加水,以乙酸乙酯进行萃取,减压浓缩；(3)分离,洗脱,根据化学成分类型合并洗脱流分；(4)将化学成分组Fr.6、7、8、10合并,即得。本发明衢枳壳有效成分组化学组成基本明确,抗炎活性成分含量高,临床上可以开发成口服制剂或吸入制剂,药理毒理基本明确,具有更好的成药性。(The invention discloses a thoroughfare bitter orange effective component group for treating viral pneumonia, which comprises the following components: icariside E4, naringenin 4 '-O-neohesperidoside, 19-hydroxycitric acid, rutin, loniceraside, 5,7,5' -trimethoxy-3 ',4' -methylenedioxyflavone-3-rutinoside, iso-hesperidin, 11 beta-deacetyl hydroxyl nomilin, bergaptide, hesperidin lactone and rhodomelin acid; the preparation method comprises the following steps: (1) pulverizing fructus Aurantii, soaking in ethanol, and extracting; (2) adding water, extracting with ethyl acetate, and concentrating under reduced pressure; (3) separating, eluting, and combining elution fractions according to chemical component types; (4) mixing the chemical components Fr.6, 7, 8 and 10. The thoroughfare fructus aurantii effective component of the invention has basically definite chemical composition and high content of anti-inflammatory active ingredients, can be clinically developed into oral preparations or inhalation preparations, has basically definite pharmacological and toxicological properties and better drug property.)
技术领域
本发明涉及药物提取技术领域，更具体的说是涉及一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组及其制备方法与应用。
背景技术
病毒性肺炎是一种由病毒感染引起的急性呼吸道传染病，每年约有2亿例病毒性的社区获得性肺炎发生，其中儿童1亿例，成人1亿例。可引起病毒性肺炎的病毒有呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒、流感病毒、副流感病毒和冠状病毒等，很多肺炎病例会出现双重病毒感染和病毒-细菌混合感染的情况。
近年来，世界范围内发生了多起病毒性呼吸道传播疾病，H5N1型禽流感病毒、严重急性呼吸综合征SARS冠状病毒、H1N1型禽流感病毒、中东呼吸综合征MERS冠状病毒和H7N9型禽流感病毒等都导致了暴发致命性肺炎。
病毒性肺炎的临床表现主要有驱动细胞因子诱骗免疫系统、细胞因子风暴导致过度免疫反应，出现发热、鼻塞、流涕等症状，可伴干咳、乏力，严重者持续高热、呼吸困难、意识障碍，甚至呼吸衰竭、炎症过后的肺纤维化、多脏器受损、休克等。在临床治疗上主要以抑制病毒复制、缓解症状、抑制机体过度炎症反应、调节免疫平衡和保护脏器为主。
随着医疗水平的不断提升，我国在病毒性肺炎诊治和临床管理方面取得了飞速进步，但仍面临着临床治疗药物缺乏的困境。病毒性肺炎疫情爆发的初期，在没有特效药和疫苗的前提下，中药发挥了其治疗病毒性肺炎的优势。我国的新冠疫情在短时间内能够得到控制，除与我国科学的防疫政策有关外，中药治疗也起到了关键的作用，特别是在平稳血氧饱和度、保护脏器、控制病程发展和恢复期消除症状等方面效果显著。中药治疗病毒性肺炎的作用主要包括抑制病毒的复制、抗炎作用、免疫调节作用和抗纤维化作用等。从药物研发规律看，很难在发现致病病毒后及时研发新药和疫苗抑制病毒传播，而中药在缓解病毒性肺炎的症状、逆转重症化率等方面取得了临床认可。因此，开发治疗病毒性肺炎的中药具有非常重要的意义。
中药饮片衢枳壳又称常山青胡柚，是浙江地方特色药材，被列入《浙江省中药炮制规范》2015版地方习用来源品种，2018年衢枳壳入选了“新浙八味”中药材。衢枳壳为芸香科植物常山胡柚的干燥未成熟果实(常山胡柚7月份的青果)，果肉味甘、酸，性寒、无毒，能健脾、止咳、解酒，柚皮味辛、苦，性温，有化痰、止咳、理气、止痛的功效，果核味苦，性温，能治病痛。临床上枳壳可入脾胃，治胀痛，治积聚。补中益气汤用于治疗胃下垂时，加用枳壳，能行气运脾，消积除痞，起到事半功倍的效果。枳壳在主治病症方面还有入胃经，治胃下垂；主肠风，治脱肛；治子宫下垂；温辛理气，治胸胁气滞，痰饮内停；治风疹；小儿急惊、便秘、牙痛、疮疖等功效。除此之外，民间最常用枳壳治疗呼吸道疾病，枳壳水煮后用于治疗咳嗽、哮喘、多痰和炎症等。
申请人的前期研究(中国专利201710813853.0)表明，衢枳壳水提液可以有效地治疗急性肺炎。衢枳壳中含有黄酮类、挥发油类、三萜类、生物碱类、香豆素类等化学成分，其中黄酮类的橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、橘红素以及生物碱类的辛弗林等具有抗炎作用。但是，衢枳壳水提液中的成分较为复杂，不利于新药的开发。
因此，如何提供一种能有效治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组及其制备方法与应用，以解决现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组，其特征在于，包括：淫羊藿次苷E4、柚皮素4'-O-新陈皮糖苷、19-羟基柠檬尼酸、芦丁、忍冬苷、5,7,5'- 三甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄酮-3-芸香糖苷、异橙皮内酯、11β-去乙酰羟基诺米林、佛手苷内酯、橙皮内酯和闹米林酸；
优选为：淫羊藿次苷E40.026份、柚皮素4'-O-新陈皮糖苷0.035份、19- 羟基柠檬尼酸0.033份、芦丁0.048份、忍冬苷0.193份、5,7,5'-三甲氧基-3',4'- 亚甲二氧基黄酮-3-芸香糖苷0.042份、异橙皮内酯0.227份、11β-去乙酰羟基诺米林0.014份、佛手苷内酯0.075份、橙皮内酯0.129份和闹米林酸0.033 份。
本发明的有益效果在于：申请人对衢枳壳以50％-90％的乙醇进行提取，总提取物分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和衢枳壳水部位。体外抗炎药效学筛选结果显示，石油醚部位和衢枳壳水部位未出现明显的抗炎活性，正丁醇部位抗炎活性较弱，乙酸乙酯部位是具有最强抗炎活性的有效部位。因此，申请人采用 HPLC-QTOF-MS分析、化学成分分离和波谱鉴定等手段，鉴定了衢枳壳乙酸乙酯部位中的29个主要化合物。为进一步探讨乙酸乙酯部位的药效物质基础，便于药物的开发。申请人将衢枳壳乙酸乙酯部位以ODS-C18中压制备色谱进行分离，以甲醇-水不同比例梯度洗脱，在HPLC-QTOF-MS追踪下，根据化学成分类型合并洗脱流分，得到13个化学成分组，并计算其得率。
通过体外抗炎活性筛选，申请人将活性最强的化学成分组Fr.6、7、8、10 合并成功制备衢枳壳有效成分组，该衢枳壳有效成分组的组成基本明确，包含11个活性成分，即淫羊藿次苷E4、柚皮素4'-O-新陈皮糖苷、19-羟基柠檬尼酸、芦丁、忍冬苷、5,7,5'-三甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄酮-3-芸香糖苷、异橙皮内酯、11β-去乙酰羟基诺米林、佛手苷内酯、橙皮内酯和闹米林酸。成药性研究表明，衢枳壳有效成分组具有很好的抗炎活性，且可以有效地治疗病毒性肺炎，便于进行药理研究和药物开发。
进一步，上述衢枳壳有效成分组是以中药饮片衢枳壳为原料，经提取、化学成分组分离、活性鉴定和活性成分组合并而得到的。
一种治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将衢枳壳粉碎为颗粒，然后以乙醇进行浸泡，回流提取，得衢枳壳总提取物；
(2)将衢枳壳总提取物加水混悬得到混悬液，然后将混悬液以乙酸乙酯进行萃取得到萃取液，最后将萃取液进行减压浓缩，得到衢枳壳乙酸乙酯部位；
(3)将衢枳壳乙酸乙酯部位以ODS-C18中压制备色谱进行分离，以甲醇-水不同比例梯度洗脱，在HPLC-QTOF-MS追踪下，根据化学成分类型合并洗脱流分，得到13个化学成分组；
(4)将化学成分组Fr.6、7、8、10合并，即得治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组。
进一步，上述步骤(1)中，乙醇的体积浓度为50％-90％；浸泡的时间为 12h；回流提取的次数为3次，每次1h。
进一步，上述步骤(2)中，衢枳壳总提取物与水的体积比为1:10；混悬液与乙酸乙酯的体积比为1:1；萃取的次数为3次。
本发明还请求保护一种上述衢枳壳有效成分组在制备药物中的应用。
进一步，上述药物为治疗病毒性肺炎的药物；药物的给药途径为口服或吸入。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、申请人的前期研究(中国专利201710813853.0)中的衢枳壳水提物化学成分比较复杂，抗炎活性成分含量较低，临床上只能开发为口服制剂，药理毒理比较复杂；而本发明中的衢枳壳有效成分组化学组成基本明确，抗炎活性成分含量高，临床上可以开发成口服制剂或吸入制剂，药理毒理基本明确，具有更好的成药性。
2、大量的实验数据证实，本发明中的衢枳壳有效成分组的抗炎活性明显高于衢枳壳水提液和总的乙酸乙酯萃取部位。
3、本发明中的衢枳壳有效成分组组成比较明确，主要有11种有效成分组成，治疗病毒性肺炎时，可以开发成吸入制剂，治疗效果会更好。
4、本发明中的衢枳壳有效成分组治疗病毒性肺炎，是在病毒感染后期通过抑制STING信号通路抑制炎症的产生。
附图说明
图1为实施例1衢枳壳各萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及衢枳壳水部位)对细胞上清液中IL-6炎症因子水平的影响图；
图2为实施例1衢枳壳各萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及衢枳壳水部位)对细胞上清液中IL-1β炎症因子水平的影响图；
图3为实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位的色谱图；
图4为实施例1衢枳壳有效成分组的色谱图；
图5为实施例1衢枳壳有效成分组中化学成分的结构式；
图6为实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位正离子TIC图；
图7为实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位负离子TIC图；
图8为实施例1衢枳壳有效成分组正离子TIC图；
图9为实施例1衢枳壳有效成分组负离子TIC图；
图10为PR8病毒感染后肺脏组织中病毒含量和IFN-β基因表达的关系图；
图11为PR8病毒感染后生存曲线图；
图12为PR8病毒感染后第7天BALF中总细胞数量图；
图13为PR8病毒感染后第7天BALF中巨噬细胞数量图；
图14为PR8病毒感染后第7天BALF中中性粒细胞数量图；
图15为PR8病毒感染后第7天BALF中嗜酸性粒细胞数量图；
图16为PR8病毒感染后第7天空白对照组组织病理学检查的结果图；
图17为PR8病毒感染后第7天实施例1衢枳壳有效成分组组织病理学检查的结果图；
图18为PR8病毒感染后第7天PR8病毒组织病理学检查的结果图；
图19为PR8病毒感染后第7天PR8病毒+实施例1衢枳壳有效成分组组织病理学检查的结果图；
图20为Westernblot检测细胞和肺组织STING信号通路中关键因子的表达图；
图21为荧光定量PCR检测细胞和肺组织中I型干扰素、炎症因子和趋化因子的表达图；
图22为PR8感染、炎症产生、STING通路激活、治疗节点之间的关系示意图图；
图23为CoIP检测STING与TBK1、IRF3和NF-κB之间的关系图；
图24为Westernblot检测细胞质和细胞核中NF-κB表达水平图；
图25为共聚焦显微镜检测IRF3核转位现象图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将100g衢枳壳粉碎为颗粒，然后以体积浓度为60％的乙醇浸泡12h 后，回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，得到衢枳壳总提取物；
(2)将衢枳壳总提取物以10倍体积的水混悬得到混悬液，然后将混悬液以乙酸乙酯1:1的体积比萃取3次得到萃取液，最后将萃取液进行减压浓缩，得到衢枳壳乙酸乙酯部位5.18g；
(3)将衢枳壳乙酸乙酯部位以ODS-C18中压制备色谱进行分离，以甲醇-水不同比例梯度洗脱，在HPLC-QTOF-MS追踪下，根据化学成分类型合并洗脱流分，得到13个化学成分组；
(4)将化学成分组Fr.6、7、8、10合并，即得治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组QFAEE1，得率为0.219％(以药材质量计)。
实施例2
治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将100g衢枳壳粉碎为颗粒，然后以体积浓度为50％的乙醇浸泡12h 后，回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，得到衢枳壳总提取物；
(2)将衢枳壳总提取物以10倍体积的水混悬得到混悬液，然后将混悬液以乙酸乙酯1:1的体积比萃取3次得到萃取液，最后将萃取液进行减压浓缩，得到衢枳壳乙酸乙酯部位；
(3)将衢枳壳乙酸乙酯部位以ODS-C18中压制备色谱进行分离，以甲醇-水不同比例梯度洗脱，在HPLC-QTOF-MS追踪下，根据化学成分类型合并洗脱流分，得到13个化学成分组；
(4)将化学成分组Fr.6、7、8、10合并，即得治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组QFAEE1。
实施例3
治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)将100g衢枳壳粉碎为颗粒，然后以体积浓度为90％的乙醇浸泡12h 后，回流提取3次，每次1h，合并提取液，减压浓缩，得到衢枳壳总提取物；
(2)将衢枳壳总提取物以10倍体积的水混悬得到混悬液，然后将混悬液以乙酸乙酯1:1的体积比萃取3次得到萃取液，最后将萃取液进行减压浓缩，得到衢枳壳乙酸乙酯部位；
(3)将衢枳壳乙酸乙酯部位以ODS-C18中压制备色谱进行分离，以甲醇-水不同比例梯度洗脱，在HPLC-QTOF-MS追踪下，根据化学成分类型合并洗脱流分，得到13个化学成分组；
(4)将化学成分组Fr.6、7、8、10合并，即得治疗病毒性肺炎的衢枳壳有效成分组QFAEE1。
性能测试
1、衢枳壳各极性部位抗炎活性筛选
取对数生长期的RAW264.7细胞经0.25％的胰酶消化后，接种到24孔板中(每孔细胞2×104个)，然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h(细胞融合度约为70％)，加入1μg/mL的LPS诱导2h后，加入衢枳壳石油醚部位 (25mg/mL，以生药材计)、实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位(25mg/mL，以生药材计)、衢枳壳正丁醇部位(25mg/mL，以生药材计)及衢枳壳水部位(25mg/mL，以生药材计)，同时设模型对照组和空白对照组，LPS诱导24h 后收集细胞上清液。利用ELISA检测细胞上清液中IL-6、IL-1β水平，筛选出抗炎活性最好的极性部位。结果如图1和2所示。
图1为实施例1衢枳壳各萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及衢枳壳水部位)对细胞上清液中IL-6炎症因子水平的影响图；图2 为实施例1衢枳壳各萃取部位(石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及衢枳壳水部位)对细胞上清液中IL-1β炎症因子水平的影响图。其中，与空白对照组比较，##p<0.01；与模型对照组比较，**p<0.01。
由图1和2可知，经LPS诱导后细胞上清液中IL-6、IL-1β炎症因子水平明显升高(与空白对照组比较，p<0.01)；加入实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位后IL-6、IL-1β水平明显降低(与模型对照组比较，p<0.01)，加入衢枳壳正丁醇部位后IL-6、IL-1β水平也有一定的降低，但差异不明显(与模型对照组比较，p>0.05)，而加入衢枳壳石油醚部位和衢枳壳水部位后，IL-6、IL-1β水平基本没有改变(与模型对照组比较，p>0.05)。结果说明，衢枳壳乙酸乙酯部位的抗炎活性最强。
2、衢枳壳有效成分组的鉴定
将实施例1制得的衢枳壳有效成分组以HPLC-QTOF-MS分析，利用高分辨质谱的精确分子量、分子式以及二级质谱碎片数据，结合标准品及文献裂解碎片比对，鉴定了主要化合物的结构，对于质谱无法鉴定的化合物，采用制备液相分离，利用核磁共振等波谱方法进行结构鉴定。结果如图3-9所示。
图3为实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位的色谱图；图4为实施例1衢枳壳有效成分组的色谱图；图5为实施例1衢枳壳有效成分组中化学成分的结构式；图6为实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位正离子TIC图；图7为实施例1衢枳壳乙酸乙酯部位负离子TIC图；图8为实施例1衢枳壳有效成分组正离子 TIC图；图9为实施例1衢枳壳有效成分组负离子TIC图。图5中，9号为淫羊藿次苷E4、10号为柚皮素4'-O-新陈皮糖苷、11号为19-羟基柠檬尼酸、12 号为芦丁、13号为忍冬苷、14号为5,7,5'-三甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄酮-3- 芸香糖苷、15号为异橙皮内酯、16号为11β-去乙酰羟基诺米林、20号为佛手苷内酯、21号为橙皮内酯、25号为闹米林酸。
由图3-9可知，本发明实施例1衢枳壳有效成分组的组成基本明确，1g 衢枳壳有效成分组中包含淫羊藿次苷E40.026g、柚皮素4'-O-新陈皮糖苷 0.035g、19-羟基柠檬尼酸0.033g、芦丁0.048g、忍冬苷0.193g、5,7,5'-三甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄酮-3-芸香糖苷0.042g、异橙皮内酯0.227g、11β-去乙酰羟基诺米林0.014g、佛手苷内酯0.075g、橙皮内酯0.129g和闹米林酸0.033g。
3、衢枳壳有效成分组与衢枳壳水提液的抗炎活性比较
取对数生长期的RAW264.7细胞经0.25％的胰酶消化后，接种到24孔板中(每孔细胞2×104个)，后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h(细胞融合度约为70％)，加入1μg/mL的LPS诱导2h后，加入实施例1衢枳壳有效成分组(25mg/mL，以生药材计)和衢枳壳水提液(25mg/mL，以生药材计，具体制备方法参见中国专利201710813853.0)，同时设模型对照组和空白对照组，LPS诱导24h后收集细胞上清液。利用ELISA检测细胞上清液中IL-6、 IL-1β水平，比较实施例1衢枳壳有效成分组与衢枳壳水提液的抗炎活性。
结果如表1所示。
表1衢枳壳有效成分组与衢枳壳水提液的抗炎活性比较
组别
IL-6(pg/mL)
IL-1β(pg/mL)
空白对照组
15.56±4.12
4.55±3.43
LPS
4512.13±524.34##
3876.91±313.55##
LPS+衢枳壳有效成分组
462.88±213.46**
219.45±146.76**
LPS+衢枳壳水提液
2152.55±613.28**
2283.67±232.65**
注：与空白对照组比较，##p<0.01；与LPS模型对照组比较，**p<0.01。
由表1可知，经LPS诱导后细胞上清液中IL-6、IL-1β炎症因子水平明显升高(与空白对照组比较，p<0.01)。加入实施例1衢枳壳有效成分组和衢枳壳水提液后IL-6、IL-1β水平明显降低(与模型对照组比较，p<0.01)，而实施例1衢枳壳有效成分组的抗炎活性明显高于衢枳壳水提液的抗炎活性，抗炎活性相差5倍以上。
结论：本发明衢枳壳有效成分组的抗炎活性明显高于申请人之前申请的专利(201710813853.0)公开的衢枳壳水提液的抗炎活性，且在相同生药剂量下，本发明衢枳壳有效成分组的抗炎活性是衢枳壳水提液的5倍以上。
4、衢枳壳有效成分组与衢枳壳乙酸乙酯极性部位抗炎活性比较
取对数生长期的RAW264.7细胞经0.25％的胰酶消化后，接种到24孔板中(每孔细胞2×104个)，后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h(细胞融合度约为70％)，加入1μg/mL的LPS诱导2h后，加入实施例1衢枳壳有效成分组(25mg/mL，以生药材计)和实施例1衢枳壳乙酸乙酯极性部位 (25mg/mL，以生药材计)，同时设模型对照组和空白对照组，LPS诱导24h后收集细胞上清液。利用ELISA检测细胞上清液中IL-6、IL-1β水平，比较衢枳壳有效成分组与衢枳壳乙酸乙酯极性部位的抗炎活性。
结果如表2所示。
表2衢枳壳有效成分组与衢枳壳乙酸乙酯极性部位抗炎活性比较
组别
IL-6(pg/mL)
IL-1β(pg/mL)
空白对照组
13.25±6.54
8.22±4.35
LPS
4106.43±328.54##
3512.98±286.78##
LPS+衢枳壳有效成分组
314.55±143.56**
204.54±212.87**
LPS+衢枳壳乙酸乙酯极性部位
431.63±229.58**
266.43±89.64**
注：与空白对照组比较，##p<0.01；与LPS模型对照组比较，**p<0.01；
由表2可知，经LPS诱导后细胞上清液中IL-6、IL-1β炎症因子水平明显升高(与空白对照组比较，p<0.01)。加入实施例1衢枳壳有效成分组和实施例1衢枳壳乙酸乙酯极性部位后IL-6、IL-1β水平明显降低(与模型对照组比较，p<0.01)，且实施例1衢枳壳有效成分组的抗炎活性优于实施例1衢枳壳乙酸乙酯极性部位的抗炎活性。
结论：本发明衢枳壳有效成分组与衢枳壳乙酸乙酯极性部位均具有较好的抗炎活性，且衢枳壳有效成分组的抗炎活性明显比衢枳壳乙酸乙酯极性部位强；另外，衢枳壳有效成分组的成分已经明确，而衢枳壳乙酸乙酯极性部位成分比较复杂，在相同生药剂量下毒性会比衢枳壳有效成分组复杂很多。因此，衢枳壳有效成分组成药性更强，更易开发成抗炎药物。
5、衢枳壳有效成分组与衢枳壳水提液中抗炎活性成分含量比较
利用HPLC检测实施例1衢枳壳有效成分组与中国专利201710813853.0 公开的衢枳壳水提液中中各化学成分的含量，色谱条件：Agilent Extend-C18 色谱柱(4.6mm×250mm，5um)；以乙腈为A相，以0.1％甲酸水为B相，梯度洗脱：0-3min，20％A；3-40min，20-55％A；检测波长254，330nm；柱温为35℃；进样量5μL。结果如表3所示。
表3衢枳壳有效成分组与衢枳壳水提物中各化学成分的含量比较
由表3可知，实施例1衢枳壳有效成分组中主要成分的含量(以药材质量计mg/100g)明显高于衢枳壳水提液。特别地，实施例1衢枳壳有效成分组中忍冬苷、5,7,5'-三甲氧基-3',4'-亚甲二氧基黄酮-3-芸香糖苷、异橙皮内酯、佛手苷内酯、橙皮内酯、闹米林酸含量是衢枳壳水提液中的7-33倍。
6、衢枳壳有效成分组治疗病毒性肺炎的作用
将甲型流感病毒鼠肺适应株PR8经10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，微量血凝试验滴定病毒效价，血凝效价测定1:640以上者供实验用。将病毒尿囊液以灭菌生理盐水稀释成50LD50/0.1mL。选取适应性饲养一周的BALB/c小鼠经异氟烷轻度麻醉后从左侧鼻腔滴入50μL上述病毒液，并在感染病毒后3-6天，通过吸入给药方式给予10mg/kg剂量的实施例1衢枳壳有效成分组。观察实验期间小鼠的死亡情况，并在实验结束后检测肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞的数目和肺脏组织病理。结果如图10-19所示。
图10为PR8病毒感染后肺脏组织中病毒含量和IFN-β基因表达的关系图；图11为PR8病毒感染后生存曲线图；图12为PR8病毒感染后第7天BALF 中总细胞数量图；图13为PR8病毒感染后第7天BALF中巨噬细胞数量图；图14为PR8病毒感染后第7天BALF中中性粒细胞数量图；图15为PR8病毒感染后第7天BALF中嗜酸性粒细胞数量图。由图10-15可知，小鼠感染流感病毒14天内死亡率为80％(8/10)，给予实施例1衢枳壳有效成分组治疗后死亡率降到20％(2/10)；在病毒感染第7天，小鼠肺泡灌洗液中总细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞数目明显增多(与空白对照组比较 p<0.01)，而给予实施例1衢枳壳有效成分组治疗后炎性细胞的数目明显降低 (与模型对照组比较p<0.01)。
图16为PR8病毒感染后第7天空白对照组组织病理学检查的结果图；图 17为PR8病毒感染后第7天实施例1衢枳壳有效成分组组织病理学检查的结果图；图18为PR8病毒感染后第7天PR8病毒组织病理学检查的结果图；图19为PR8病毒感染后第7天PR8病毒+实施例1衢枳壳有效成分组组织病理学检查的结果图。由图16-19可知，实施例1衢枳壳有效成分组治疗后可以明显改善病毒感染引起的病理损伤。
结论：衢枳壳有效成分组可以通过吸入给药的方式治疗病毒性肺炎。
7、衢枳壳有效成分组通过在病毒感染后期抑制STING通路治疗病毒性肺炎
剂量组别:(1)空白对照组；(2)衢枳壳有效成分组对照组；(3)PR8流感病毒感染模型对照组；(4)PR8流感病毒+衢枳壳有效成分组。
取适应性饲养一周的BALB/c小鼠经异氟烷轻度麻醉后从左侧鼻腔滴入 50μL上述病毒液，并在感染病毒后3-6天，通过吸入给药方式给予10mg/kg 剂量的实施例1衢枳壳有效成分组。在病毒感染第7天，经0.5％的戊巴比妥钠(0.4mL/20g)麻醉后解剖取肺脏，Western blot检测细胞和肺组织STING 信号通路中关键因子的表达；荧光定量PCR检测细胞和肺组织中I型干扰素、炎症因子和趋化因子的表达；CoIP检测STING与TBK1、IRF3和NF-κB之间的关系；Westernblot检测细胞质和细胞核中NF-κB表达水平；共聚焦显微镜检测IRF3核转位现象。结果如图20-25所示。
图20为Westernblot检测细胞和肺组织STING信号通路中关键因子的表达图；图21为荧光定量PCR检测细胞和肺组织中I型干扰素、炎症因子和趋化因子的表达图；图22为PR8感染、炎症产生、STING通路激活、治疗节点之间的关系示意图图；图23为CoIP检测STING与TBK1、IRF3和NF-κB 之间的关系图；图24为Westernblot检测细胞质和细胞核中NF-κB表达水平图；图25为共聚焦显微镜检测IRF3核转位现象图。
由图20-25可知，流感病毒性肺炎小鼠在病毒感染5天后开始出现死亡；在感染后第3天，小鼠肺脏组织中I型干扰素、炎症因子以及炎症趋化因子表达明显升高，在感染后第3-6天利用治疗后，小鼠肺组织中I型干扰素和炎症因子以及趋化因子mRNA水平显著降低；治疗组的p-TBK1、p-IRF3蛋白水平明显低于PR8感染组，提示具有潜在的调控STING缓解流感病毒性肺炎的可能性。随后申请人通过使用PR8感染肺上皮细胞株(BEAS-2B)并加以进行干预来探索STING通路在流感病毒肺炎中的机制作用，结果显示，能有效的降低STING与TBK1和IRF3的结合，抑制STING通路信号传导，同时抑制IRF3和NF-κB的修饰，减少这类转录因子入核启动炎症因子转录，减少炎症因子、I型干扰素和趋化因子的产生。
结论：衢枳壳有效成分组通过在病毒感染后期抑制STING通路治疗病毒性肺炎。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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