一种用于治疗慢性创伤的组合制剂及其制备方法
阅读说明：本技术 一种用于治疗慢性创伤的组合制剂及其制备方法 (Combined preparation for treating chronic wounds and preparation method thereof ) 是由 侯豹 戚梦婷 朱雪锐 于晓依 班雅婷 胡江涛 康心勉 蔡维维 邱丽颖 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于治疗慢性创伤的组合制剂及其制备方法,属于生物工程技术领域。本发明的组合制剂分为A和B两个制剂,A为洗剂；B为喷剂,其中,所述洗剂A为壳聚糖纳米水凝胶负载0.5％-2％的王不留行黄酮苷和0.5％-2％的王不留行刺桐碱,所述喷剂B为壳聚糖纳米水凝胶负载3％-5％的王不留行黄酮苷和3％-5％的王不留行刺桐碱溶液。本发明的组合制剂对慢性创伤部位具有显著的抗炎作用,对创伤部位血管再生具有显著的促进作用。(The invention discloses a combined preparation for treating chronic wounds and a preparation method thereof, belonging to the technical field of biological engineering. The combined preparation of the invention is divided into two preparations A and B, wherein A is lotion; and B is a spray, wherein the lotion A is formed by loading 0.5-2% of cowherb seed flavonoid glycoside and 0.5-2% of cowherb seed erythrina alkali on chitosan nano hydrogel, and the spray B is formed by loading 3-5% of cowherb seed flavonoid glycoside and 3-5% of cowherb seed erythrina alkali solution on chitosan nano hydrogel. The combined preparation of the invention has obvious anti-inflammatory effect on chronic wound parts and obvious promotion effect on revascularization of wound parts.)
技术领域
本发明涉及一种用于治疗慢性创伤的组合制剂及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
慢性创伤不仅会导致患者生活质量的下降，还会给患者家属带来巨大的经济负担。从人口学角度来看，慢性创伤和愈合障碍患者的数量正在达到流行病的比例，并将在人类健康和经济方面的负担变得更重。因此，越来越多的研究者关注慢性创伤的研究。伤口愈合的过程可以概括为血凝块的形成、炎症、组织再生和组织重塑。在炎症期，早期的炎症反应会调动局部炎症因子和全身对伤口部位的防御反应。慢性伤口的炎症期持续很长时间。研究人员认为，这些伤口可能处于慢性炎症状态，无法过渡到组织再生阶段。慢性创伤愈合炎症期阻滞与NLRP3炎症小体活化和TLR4/NF-κB信号通路激活密切相关，在慢性创伤的治疗过程中不仅要抑制NLRP3炎症小体的活化还要阻断TLR4/NF-κB信号通路的激活。而刺桐碱抗内皮细胞炎症过程仅通过抑制IL-1β和TNF-α等炎症因子的表达来实现。
研究表明，由中性粒细胞和巨噬细胞组成的炎细胞浸润伤口表面，导致IL-1β和TNF-α升高进一步导致金属蛋白酶的增加和局部ECM的过度降解，破坏细胞迁移，对宿主组织造成严重损伤。在组织再生期，血管再生困难，养料和多种生长因子无法运输到创伤部位导致创伤愈合受阻。
目前，虽然有多种生长因子、基因传递疗法和细胞治疗策略来治疗伤口愈合，但能发挥有效作用的药物却少之又少。慢性创伤的治疗一直以来是困扰科研工作者的难题，尽管临床医生可获得大量的局部治疗/抗菌药物和敷料，但很少有前瞻性数据支持。因此，临床医生倾向于使用他们习惯的或根据个人经验来确定有效的治疗方法。
发明内容
为了解决上述慢性创伤治疗难的问题，本发明以纳米水凝胶负载药物为基础，负载促血管再生的药物黄酮苷和抗炎药物刺桐碱，制备了洗剂A和喷剂B，兼具了药物的效用和纳米水凝胶抗菌、保湿和抗炎的功能。洗剂A对慢性创伤具有清创作用，主要发挥壳聚糖的作用。喷剂B喷至创面处，形成一层保护膜，发挥有效药物促创伤愈合的作用，保护膜间的空隙可以进行气体交换，抑制创伤部位厌氧菌的繁殖。
为了实现上述目的，本发明首先提供一种治疗慢性创伤的组合制剂，所述组合制剂分为A和B两个制剂，A为洗剂；B为喷剂，其中，所述洗剂A为壳聚糖纳米水凝胶负载0.5％-2％的王不留行黄酮苷和0.5％-2％的王不留行刺桐碱，所述喷剂B为壳聚糖纳米水凝胶负载3％-5％的王不留行黄酮苷和3％-5％的王不留行刺桐碱。
在本发明的一种实施方式中，优选的，所述洗剂A为壳聚糖纳米水凝胶负载2％的王不留行黄酮苷和2％的王不留行刺桐碱，所述喷剂B为壳聚糖纳米水凝胶负载5％的王不留行黄酮苷和5％的王不留行刺桐碱。
在本发明的一种实施方式中，所述洗剂A的黏度在10-4～10-1Pa·s范围内。
本发明还提供了上述组合制剂的制备方法，所述方法包括：
(a)首先将司班80加入液体石蜡中，然后在50～70℃的水浴中混合，作为油相备用；
(b)将王不留行黄酮苷和王不留行刺桐碱溶解在壳聚糖溶液中，然后将混合的壳聚糖溶液加入步骤(a)得到的油相中，搅拌2～6h；
(c)再将三聚磷酸钠加入步骤(b)得到的搅拌液中，继续搅拌0.5～2h获得混合液体；
(d)将步骤(c)得到的混合液体用2～5倍体积的石油醚洗涤数次，离心，真空干燥，得到负载药物的纳米颗粒；
(e)将步骤(d)得到的负载药物的纳米颗粒溶解于水溶液中，超声搅拌，即可获得负载王不留行黄酮苷和王不留行刺桐碱的壳聚糖纳米水凝胶，根据加入黄酮苷和刺桐碱的比例不同，即可获得洗剂A和喷剂B，其中，喷剂B通过喷瓶均匀喷洒使用。
在本发明的一种实施方式中，所述壳聚糖水凝胶由司班80、液体石蜡、壳聚糖溶液、三聚磷酸钠溶液组成，其中，四者的体积比为4～6:36～40:20～25:5～10。
在本发明的一种实施方式中，所述壳聚糖溶液的浓度为4～6mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为1～3mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，组合制剂A和B的纳米粒子尺寸为(64.97±4.39)nm，zeta电位为(-1.83±0.32)mV。
本发明还提供了上述组合制剂或上述制备方法在制备治疗慢性创伤的药物中的应用。
在本发明的一种实施方式中，在治疗慢性创伤时，首先用A剂清洗慢性创伤的伤口，创口清洗干净后用B剂喷至创面，每天用A剂和B剂对创面进行处理一次。
本发明还提供了包含上述组合制剂或上述制备方法制备得到的组合制剂的药物。
本发明具有的有益效果如下：
1.本发明提供的组合制剂对慢性创伤的治疗具有显著效果。
2.本发明提供的组合制剂对慢性创伤部位具有显著的抗炎作用，对创伤部位血管具有显著的促进作用。
附图说明
图1本发明的A型洗剂和B型喷剂的照片。
图2.a为B型喷剂透射电镜图像，b和c分别为A型洗剂在25℃和37℃时不同剪切速率下的水凝胶的粘度分布图。
图3NPS-VAC+HYP、NPS和HYP+VAC组的MTT结果统计图，其中，CON为对照组；NPS为壳聚糖纳米水凝胶组；HYP+VAC为(5％王不留行刺桐碱+5％王不留行黄酮苷生理盐水溶液组)；NPS-VAC+HYP为壳聚糖纳米水凝胶负载刺桐碱和黄酮苷组(A和B剂型联合用药)。
图4a为A型洗剂和B型喷剂促慢性创伤愈合统计图，b为不同时间点慢性创伤愈合图像。CON为对照组；NPS为壳聚糖纳米水凝胶组；HYP+VAC为5％王不留行刺桐碱+5％王不留行黄酮苷组生理盐水溶液组；NPS-VAC+HYP为壳聚糖纳米水凝胶负载刺桐碱和黄酮苷组(A和B剂型联合用药)；HT为阳性药物华佗创伤膏组。
图5.NPS-VAC+HYP加速慢性创伤再上皮化(A)图代表第6天创面HE染色的图像。(B)图代表第9天创面HE染色的图像(C)代表第12天创面HE染色的；放大倍数分别为40倍和200倍。在图中，I代表炎症细胞，B代表血管，F代表成纤维细胞。
图6NPS-VAC+HYP可下调促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达水平。(A)代表伤后第6、9、12天创面IL-1β免疫组化染色图像(放大400倍)。黑色箭头表示IL-1β染色.(B)图代表免疫印迹检测TNF-α和IL-1β的蛋白表达。数值为平均值±标准差。*P<0.05，**P<0.01。与对照组比较。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1组合制剂的制备
(a)首先将4mL的司班80加入36mL的液体石蜡中，然后在55℃的水浴中混合，作为油相备用；
(b)将5mg的黄酮苷和5mg的刺桐碱溶解在20mL的壳聚糖溶液中(5mg/mL)，然后将混合的壳聚糖溶液加入上述油相中，在680转/分钟下搅拌3h；
(c)再将5mL三聚磷酸钠(2mg/mL)缓慢加入上述搅拌液中，继续搅拌0.5h获得均匀的混合液体；
(d)获得的混合液体用3倍体积的石油醚洗涤3次，离心，真空干燥，得到负载药物的纳米颗粒；
(e)将纳米颗粒溶解于水溶液中，超声搅拌，即可获得负载黄酮苷和刺桐碱的纳米水凝胶，根据加入黄酮苷和刺桐碱的比例不同，即可获得洗剂A和喷剂B，其中，洗剂A为壳聚糖纳米水凝胶负载2％的王不留行黄酮苷和2％的刺桐碱，喷剂B为壳聚糖纳米水凝胶负载5％的王不留行黄酮苷和5％的刺桐碱溶液，洗剂A放置在EP管中使用，喷剂B通过喷瓶均匀喷洒使用。A型洗剂和B型喷剂的产品见图1。
一、粒径和zeta电位测定
通过ZetaPALS分析仪测定上述制备方法获得的纳米水凝胶溶液的平均纳米粒子尺寸为(64.97±4.39)nm和zeta电位为(-1.83±0.32)mV。通过透射电镜获得B型喷剂透射电镜图像如图2a所示，经过粘度测试结果图2b和图2c可知洗剂A的黏度在10-4～10-1Pa·s范围内。
二、体外安全性试验
用raw264.7巨噬细胞检测细胞毒性：将raw246.7(1×104细胞/孔)接种于96孔板中并在37℃下培养。分别以不同浓度(5、10、25μg/mL)向孔中添加NPS-VAC+HYP(A和B剂型联合用药)、NPS(壳聚糖纳米水凝胶组，制备方法同本发明实施例1，但是不添加刺桐碱和黄酮苷)和VAC+HYP(为5％王不留行刺桐碱+5％王不留行黄酮苷组生理盐水溶液组)。细胞培养24h后，每孔加入浓度为5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h，再加入二甲基亚砜(DMSO)150μL。在570nm处测定光密度(OD)值，计算细胞活力。
结果表明：用MTT法检测HYP-NPS对RAW264.7细胞的细胞毒性，结果如图3所示。在浓度范围(5-25μg/mL)内，VAC+HYP、NPS和NPS-VAC+HYP均无细胞毒性。这些结果表明，HYP-NPS具有良好的生物相容性和安全性，可作为创伤愈合材料。体外细胞毒性试验是评价生物材料生物相容性的重要方法。
三、动物实验
从上海斯莱克实验动物有限公司购买SPF雄性SD大鼠48只(6周龄，200～220g)，适应性喂养7d。腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠模型。将STZ溶解在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH 4.5)中，并以70mg/kg体重的剂量腹腔注射。STZ治疗2周后，当血糖高于300mg/dL时，将大鼠视为糖尿病大鼠，制作开放性创伤模型。
将纳米水凝胶应用于开放性创伤模型，应用方法为先将洗剂A涂抹到创伤部位，对创伤部位的坏死组织进行清洗干净，然后将喷剂B喷到创伤部位形成一层可进行气体交换的保护膜。
结果如图4所示，其中，CON为对照组(不做处理)；NPS为壳聚糖组(壳聚糖纳米溶液涂抹)；HYP+VAC为王不留行刺桐碱+王不留行黄酮苷组(涂抹)；NPS-VAC+HYP为壳聚糖负载刺桐碱和黄酮苷组(A和B剂型联合用药，实施例1)；HT为阳性药物华佗创伤膏组。
从图4a可以看出，在创伤后的第6天和第9天，A和B剂型联合用药组促慢性创伤愈合的速度显著比其他组快；从图4b可以看出A和B剂型联合用药组促慢性创伤愈合效果显著。
四、组织学评价
将创伤部位皮肤组织制成5μm的组织切片。苏木精-伊红染色进行病理学分析。在显微镜下观察伤口愈合的组织病理学变化，如图5所示。
结果表明，NPS-VAC+HYP组通过抑制慢性创面炎症反应，促进创面组织的再上皮化，并且血管再生速度显著快于其他组。
五、蛋白组学评价
提取创伤部位蛋白组织，通过免疫印迹法检测创伤部位IL-1β和TNF-α的表达水平。结果表明NPS-VAC+HYP在创伤愈合过程中可下调促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达，如图6所示。
总的来说，本发明提供的组合制剂无细胞毒性，且对慢性创伤部位具有显著的抗炎作用，对创伤部位血管增殖具有显著的促进作用。
此外，当洗剂A为壳聚糖水凝胶负载0.5％-2％的王不留行黄酮苷和0.5％-2％的王不留行刺桐碱，喷剂B为壳聚糖水凝胶负载3％-5％的王不留行黄酮苷和3％-5％的王不留行刺桐碱溶液时，均能够实现对慢性创伤部位具有显著的抗炎作用，对创伤部位血管增殖具有显著的促进作用的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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